Bela2-microglobuline amyloidosis: Fibrillogenesis of natural and recombinant human beta2-microglobulines

Abstract


Β2-Microglobulin ( β2М) is noncovalently associated with alpha chain of the class I major histocompatibility complex. The protein is removed from blood by degradation in the proximal tubule of the kidney. β2M cannot be removed from the blood by the kidney or the dialysis membrane in patients undergoing haemodialysis. As a consequence of increased β2M concentrations, partial unfolding of β2M is believed to be prerequisite to its assembly into β2M amyloid fibrils. β2M amyloidosis is a common complication associated with long-term hemodialysis. Mechanism of fibril formation in physiological conditions is poorly understood. Simulation in vitro is required for elucidation of its mechanism and for searching after factors that can induce or inhibit fibrillogenesis. For these purpose we have devised the method to obtain β2M from dialysate of patients undergoing long-term hemodialysis. We have constructed expression plasmid for production of recombinant human β2M in E.coli with subsequent fast and easy purification. Recombinant fusion protein of β2M with green fluorescent protein was also produced. These recombinant proteins do not form inclusion bodies and can be extracted directly from the cell lysate. Electron microscopy and atomic force microscopy have shown presence of fibrils formed in vitro from the three β2M variants. Using thioflavin-T binding we have determined that β2M purified from dialysate and recombinant β2M can form amyloid fibrils.

ВВЕДЕНИЕ Бета-2-микроглобулин ( β2М) (11800 Да) синтезируется практически во всех клетках организма. Этот белок нековалентно связан с тяжелой цепью молекул класса I главного комплекса гистосовместимости, располагающихся на поверхности мембран. Исключительная важность белка подтверждается отсутствием полиморфизма кодирующей части соответствующего гена. Нарушения структуры белка выявляются только при злокачественном перерождении клеток, что связано с участием нормального Р2М в антигенной презентации [14]. р2М синтезируется в количестве от 2 до 4 мг/кг в день, при этом период его полувыведения составляет 2,5 ч, а концентрация в плазме здоровых лиц - 1-3 мг/л. Так как элиминация Р2М на 95% обеспечивается путем клубочковой фильтрации (с последующей реабсорбцией и внутриклеточным протеолизом в проксимальных канальцах), его концентрация в плазме обратно пропорциональна скорости клубочковой фильтрации. Уровень Р2М у больных с хронической почечной недостаточностью многократно повышается, в зависимости от степени снижения функции почек, возрастая примерно в 60 раз вследствие значительного (в 10-15 раз) увеличения периода полувыведения данного белка [4]. Большие количества |32М обнаруживаются в моче нефротических больных. Такая моча обычно служит источником получения природного белка человека [8]. Проблема бета-2-микроглобулинового амилоидо- за (А|32М) связана с введением гемодиализа в медицинскую практику. При длительной гемодиализной терапии концентрация Р2М в плазме крови больных постоянно существенно превышает норму. Длительная персистенция высоких концентраций Р2М считается основной причиной появления молекул белка в аномальной конформации и образования амилоидных фибрилл [20]. У некоторых из этих больных развивается осложнение гемодиализа, получившее название гемодиализного амилоидоза или А_р2М. Клинически Ар2М проявляется главным образом симптомами поражения соединительнотканных образований, где по невыясненным до настоящего времени причинам происходит накопление амилоидных отложений. Наиболее часто отмечается синдром карпального канала, скапулофеморальный периартроз, деструктивная спондилоартропатия, протекающая в ряде случаев с миелокомпрессией, атлантоаксиальная артропатия, бурситы, костные кисты, патологические переломы и др. [27, 29]. С развитием болезни системное отложение может встречаться также в стенке желудка и в сердце [9, 13]. В отличие от других амилоидозов, А[Ї2М редко сам по себе является причиной летального исхода. В то же время Ар2М служит основной причиной выраженного снижения качества жизни, что проявляется болями в суставах и сокращением объема движений у больных, находящихся на длительном диализе [5]. В большинстве публикаций сообщается о начале проявления АР2М у больных спустя несколько лет после начала гемодиализа. В редких случаях данный амилоидоз наблюдается у больных после непродолжительной гемодиализной терапии или даже до ее начала [29, 7, 11, 22]. Клинические проявления Ар2М появляются постепенно через 2-10 лет после начала диализа у значительной части больных. В большом проспективном посмертном исследовании [15] выявлены значимые отличия клинических проявлений Ар2М, определяемых по частоте развития синдрома карпального канала (2% больных) от рентгенологических изменений в костях (4% больных) и от гистологического обнаружения амилоидных отложений в аутопсийном материале (в среднем у 48% пациентов). В этом исследовании частота выявления депозитов р2М варьировала от 28% у больных в первые 2 года гемодиализа до 100% у пациентов, находящихся на хроническом диализе более 13 лет. В исследовании Ohashi и соавт. [23] 90% больных через 5 лет имели гистологически обнаруживаемые проявления А|32М. Однако у многих больных видимые клинические проявления часто отсутствуют. Кроме того, клинические симптомы обычно неспецифичны и легко принимаются за суставные нарушения другой этиологии. «Золотым стандартом» диагностики является биопсия с положительным окрашиванием тканей Конго красным и наличие |32М при иммуногистохи- мическом исследовании [5]. Применение различных мембран при гемодиализе может оказывать влияние на развитие А(32М. Использование полисульфона и других синтетических мембран обеспечивает более эффективное по сравнению с купрофаном удаление Р2М из организма, но не предотвращает развитие амилоидоза. Это же справедливо в отношении различной диализной техники: гемофильтрации, гемодиафильтрации, постоянной артерио-венозной гемофильтрации [2]. До сих пор не выявлены ключевые факторы формирования амилоидных отложений in vivo и причины дегенеративных явлений в тканях. Для всех амилоидозов характерной особенностью является длительный латентный период. Для наследственных амилоидозов, которые относятся к заболеваниям с доминантным наследованием, свойственно сравнительно позднее клиническое проявление и низкая пенетрантность. Все это свидетельствует о наличии определенных факторов, способствующих началу фибриллогенеза и развитию амилоидоза. Поэтому изучение начальных условий фибриллогенеза и влияния различных соединений на этот процесс может пролить свет на закономерности молекулярных основ патогенеза данного вида заболеваний. Знание патогенеза, в свою очередь, является предпосылкой для эффективной терапии и предотвращения формирования аномальных фибрилл. Особое значение имеет выяснение механизмов клеточной дегенерации в ходе формирования амилоидных отложений. Высказывается мнение, что не сами фибриллы, а префибриллярные формы, возникающие в начальной фазе изменения пространственной организации амилорідогенных белков, играют ключевую токсическую роль в отношении окружающих клеток [17]. Апоптоз этих клеток приводит к нарушению функции органов. В то же время объемный процесс, который сопровождает отложение амилоидных структур, также не может полностью игнорироваться. Приступая к изучению механизмов развития гемодиализного амилоидоза и выяснению основных факторов, способствующих и препятствующих фибриллогенезу Р2М, в настоящем сообщении мы представляем разработанные нами способы получения очищенных препаратов природного и рекомбинантного р2М, в том числе и рекомбинантного белка слияния р2М с зеленым флуоресцентным белком (P2MSF) Очищенные белки необходимы для моделирования фибриллогенеза in vitro и для анализа факторов и условий, способствующих и препятствующих фибриллогенезу, а также для установления структурных особенностей Р2М плазмы крови больных на хроническом гемодиализе. Теоретический аспект исследования, частью которого является настоящая работа, включает также выяснение общих закономерностей фибриллогенеза белков и пептидов на примере модельного белка Р2М человека. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение поликлональных антител кролика к р2М человека. В качестве источника получения природного Р2М использовали диализат плазмы крови больных на хроническом гемодиализе. Первые десять литров диализата концентрировали с помощью ультрафильтрации на мембране с порами, проницаемыми для белков с молекулярной массой более 5 кДа. Далее концентрат подвергали ультрафильтрации на мембране, проницаемой для белков с молекулярной массой более 30 кДа. Р2М, содержащийся в ультрафильтрате, очищали методом гель-фильтрационной хроматографии. Электрофорез в ПААГ. Электрофорез белка осуществляли в блоках 12% ПААГ (10><10 см) при градиенте напряжения 20 В/см в присутствии SDS. Идентификация Р2М методом MALDI-TOF. Выделенный из диализата больного предполагаемый |32М подвергали препаративному электрофорезу в ПААГ в денатурирующих условиях. Анализ электрофоретической зоны, соответствующей по мол. м. Р2М, был осуществлен в НИИ физико-химической медицины РАМН. Идентификацию белков по «пептидному фингерпринту» осуществляли с помощью программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск проводился в базе данных NCBI среди белков всех организмов с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом. Получение поликлональных антител кролика к р2М человека. Иммунизацию кроликов осуществляли фрагментом ПААГ, содержащим 100 мкг р2М. Фрагмент гомогенизировали, смешивали с адъювантом Фрейнда (Sigma) и вводили кролику внутрикожно по стандартной схеме [3]. Забор крови осуществляли на 10-й день после последней иммунизации. Фракцию IgG получали методом высаливания сульфатом аммония [1]. Получение экспрессионной генетической конструкции рЕТЬ2т6.8. Из лейкоцитов венозной крови здорового донора стандартным методом была выделена тотальная РНК и проведена обратная транскрипция, затем проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием специфических праймеров. В состав праймеров для получения ПЦР-продукта кодирующей части 02М человека во фланкирующие участки были внесены нуклеотидные последовательности, содержащие сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции и позволяющие провести вставку в последовательность плазмиды РЕТ22Ь(+) (Novagen, Madison, WI, Cat. No. 69744-3). Таким образом был получен ПЦР-продукт, содержащий сайт рестрикции MscI на 5’ конце, последовательность, кодирующую Р2М человека, полигистидиновую последовательность (5xPIis), два стоп-кодона и сайт рестрикции Hindlll на 3’ конце. Полученный ПЦР- продукт был обработан рестриісгазами MscI и Hindlll (Femientas) и вставлен в плазмиду рЕТ22Ь(+), обработанную теми же рестриктазами, с помощью лигазы Т4 DNA ligase (Femientas). Компетентные клетки штамма Escherichia coli DH5(alpha) были трансформированы полученной лигазной смесью и нанесены на селективную агарозную среду. Плазмидная ДНК отобранных клонов была просеквенирована в АТГ сервис ген, Санкт-Петербург. Был обнаружен клон, несущий плазмиду, содержащую в рамке считывания РеІВ «лидерный пептид», полностью идентичную Р2М последовательность, а также внесенную полигистидиновую последовательность и два стоп- кодона. Получение экспрессионной генетической конструкции pTRCblmsf С помощью ПЦР был получен фрагмент ДНК, кодирующий Р2М без его сигнального пептида. В качестве матрицы при амплификации была использована полученная нами ранее плазмида рЕТЬ2т6.8. Некомплементарная часть прямого праймера содержала сайт рестрикции для КрпІ, некомплементарная часть обратного праймера содержала сайт рестрикции для ВапіНІ. Продукт ПЦР после обработки соответствующими рестриктазами вставлен в плазмиду pTRC99a-P7 (Amersham Pharmacia), обработанную теми же эндонуклеазами рестрикции с помощью лигирования. Плазмида рТгс99А-Р7 создана для экспрессии белков в бактериальной системе Е.соіі и содержит ген superfolder GFP [24]. Указанные сайты рестрикции были подобраны таким образом, чтобы в полученном векторе pTRC99a-B2MSF после ATG (старт-кодона) исходной плазмиды в той же рамке считывания находилась последовательность ДРІК, кодирующая Р2М, затем последовательность superfolder GFP, затем His-tag из шести остатков гистидина, а затем стоп-кодон. Компетентные клетки штамма Escherichia coli DH5(alpha) были трансформированы полученной лигазной смесью и нанесены на селективную агарозную среду. Плазмидная ДНК выросших ампициллин-резистентных колоний была подвергнута ПЦР-анализу, по результатам которого были отобраны клоны, содержащие ген |32М. Компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) были трансформированы плазмидами отобранных клонов и нанесены на агарозную среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 240 мкг/мл изопропил- (З-Б-Цтиогалактопиранозида (IPTG). После культивирования (16 ч при +37 °С) наличие экспрессии белка слияния Р2М с superfolder GFP (P2MSF) было показано с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Выделение и очистка рекомбинантного р2М. Рекомбинантный Р2М получали из клеток Escherichia coli BL21(DE3), трансформированных экспрессионной конструкцией рЕТЬ2т6.8. Escherichia coli выращивали в течение ночи в 10 мл среды Luria-Bertani (LB) с ампициллином (100 мкг/мл) при 37 °С. Ночная культура была инокулирована в 500 мл свежей среды и культивировалась в условиях аэрации при 37 °С до достижения оптической плотности А600 = 0,8-1. Синтез р2М индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 1 мМ, и культивирование продолжали в течение ночи при 26 °С в условиях аэрации. После отделения бактериальных клеток путем центрифугирования в течение 15 мин при 10 000 g, периплазматическую фракцию получали методом «осмотического шока» [6]. К периплазматической фракции добавляли ингибитор протеаз (PMSF, phenylmethylsulfonyl fluoride) до конечной концентрации 1 тМ и имидазол до конечной концентрации 10 мМ. Белок сорбировали на металл-хелатном сорбенте. Балластные белки последовательно отмывали 0,5 м раствором NaCl на 0,1 М К-фосфатном буфере, pH 8,0, содержащем 20-30-40 мМ имидазола. Далее белок элюировали 0,14 М NaCl, pH 8,0, содержащем 200 мМ имидазола. Выделение и очистка рекомбинантного белка слияния piMSF. P2MSF получали из клеток Е.соіі BL21(DE3), трансформированных экспрессионной конструкцией pTRCb2msf. Отдельную колонию клеток, выросшую на селективной агарозной среде засевали в 500 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/ мл). Культивирование проводили в условиях аэрации при 37 °С до достижения оптической плотности А600 = 0,8-1. Синтез Р2М индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 250 мкМ, и культивирование продолжали в течение ночи при 26 °С в условиях аэрации. Бактериальные клетки отделяли от среды культивирования путем центрифугирования в течение 15 мин при 10 000 g и однократно отмывали физиологическим раствором с последующим осаждением при 10 000 g. Клеточную массу ресус- пендировали в растворе, содержащем 0,15 М NaCl, 25 мМ Na-фосфат, pH 7,4, 1 шМ PMSF, 10 мМ имидазол и 5 тМ меркаптоэтаиол. Клетки разрушали с помощью соникации в условиях охлаждения. Для более полного разрушения к суспензии добавляли 1/10 объема стеклянных гранул. После разрушения бактериальных клеток суспензию центрифугировали в течение 15 мин при 30 000 g, и супернатант отделяли от осадка. Очистку белка на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте осуществляли, как описано в предыдущем разделе. Формирование фибрилл природного и рекомбинантного Р2М. Для получения фибрилл природный или рекомбинантные Р2М с конечной концентрацией 30 рМ инкубировали в 200 тМ глицин-НСІ буфере (pH 2,0) в течение 7 сут при 37 ОС при постоянном перемешивании (500 rpm) на термошейкере TS-100 (Biosan). Для получения фибрилл в физиологическом pH, был использован метод, описанный ранее Sasahara с соавт. [25, 26]. Использовался (32М с конечной концентрацией 30 рМ. Кроме того, для получения фибрилл в физиологическом pH, был применен метод Kihara и соавт. [18]. В качестве «затравки» фибриллогенеза добавляли 1/100 объема готовых фибрилл той же концентрации, выращенных при pH 2,0 и стабилизированных 0,5 шМ SDS. Измерение флуоресценции комплексов тиофла- вина Т с фибриллами проводили по модифицированному методу [19]: 10 мкл раствора фибрилл добавляли к 300 мкл PBS-буфера, содержащего 6 мкМ тиофлавин Т. Пробу тщательно перемешивали, затем инкубировали 5 мин при комнатной температуре и переносили в кювету. Регистрацию спектров флуоресценции проводили с помощью спектрофлуо- риметра AVANTES AvaSpec-2048 (Источник света AvaLight-LED, 460 нм). Для исключения сигнала, поступающего на регистрирующее устройство спектрофлуориметра вследствие рассеяния излучения, применяли фильтр, отсекающий часть спектра с длиной волны менее 460 нм. В качестве нулевой пробы использовали |32М в мономерной форме в той же концентрации. Электронная микроскопия. Электронная микроскопия. Электронную микроскопию осуществляли на просвечивающем микроскопе JEM 1011 (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 ІсѴ. Препараты готовили с использованием метода негативного контрастирования. В качестве контрастирующего вещества применяли калийную соль фосфовольфрамо- вой кислоты (pH 7.2). Атомно-силовая микроскопия. Для исследования с помощью атомной силовой микроскопии 5 мкл фибрилл помещали на влажную поверхность слайда, покрытого гидрогелем (HydroGel, Perkin Elmer, USA), предварительно инкубировавшегося в деионизованной воде в течение 30 мин. Далее образец подсушивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Атомно-силовая микроскопия проводилась с помощью сканирующего зондового микроскопа NT- MDT Solver Bio (NT-MDT, Россия) в полуконтакт- ном режиме с использованием кантилевера NSG03 Ultra Sharp (NT-MDT, Россия). Обработка данных проводилась в программе GWYDDION (http:// gwyddion.net). Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. Для детального анализа агрегатов и надфиб- риллярных структур, образованных белком слияния |32MSF in vitro, использовали конфокальный лазерный сканирующий микроскоп «Carl Zeiss LSM 510» (Германия). Для возбуждения флуоресценции (32MSF и superfolder GFP использовали лазер с длиной волны 488 нм, для детекции флуоресценции использовали фильтр 505-550 нм. Получение и обработку изображений осуществляли при помощи прилагаемого к микроскопу программного обеспечения «LSM 510». РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ На начальном этапе работы был получен очищенный препарат |32М человека из диализата. Описанные в литературе способы выделения р2М из мочи нефротических больных [8] не всегда пригодны для проведения исследования, так как исходный материал не всегда доступен и, кроме того, Р2М в образцах мочи может частично деградировать. В настоящее время широко применяется гемодиализ, позволяющий предотвратить гибель больных с хронической почечной недостаточностью. В плазме крови таких больных концентрация Р2М существенно выше нормы. Фильтрация Р2М через гемодиализные мембраны приводит к частичному очищению плазмы крови от этого белка и его появлению в оттекающей из аппарата жидкости. Общий объем диализата составляет десятки литров, поэтому диализат может служить удобным источником получения Р2М. В диализной жидкости содержится гораздо меньше балластных белков, чем в плазме крови. Единственной трудностью в получении Р2М из диализата являются большие объемы исходного материала. Мы использовали для получения Р2М только первые десять литров диализата, в которых наблюдается наибольшая концентрация целевого белка. На первом этапе выделения (32М диализная жидкость подвергалась ультрафильтрации на фильтре с размерами пор, проницаемых для низкомолекулярных соединений с молекулярной массой не выше 5 кДа. Анализ концентрата с помощью электрофореза в ПААТ показал наличие компонентов, соответствующих по молекулярной массе (32М. Кроме того, в концентрате присутствовали белки с более высокой молекулярной массой, в частности альбумин (рис. 1). Масс-спектрометричес- кий анализ белкового компонента, соответствующего Р2М по электрофоретической подвижности, подтвердил, что данная белковая зона содержит только полноразмерный Р2М человека. Последующая очистка белка включала дополнительную ультрафильтрацию через мембрану с размерами пор, проницаемыми для р2М, но не для более высокомолекулярных компонентов. Окончательную очистку производили при помощи гель-фильтрации. На электрофореграмме, представленной на рис. 1, видно, что выделенный белок мигрирует в денатурирующих условиях в виде одной зоны с молекулярной массой 12 кДа. Для получения поликлональных моноспецифи- ческих антител кроликов иммунизировали гомогенизированными фрагментами полиакриламидного геля, содержащими [32М после электрофоретической очистки. Полученные антитела обладают достаточным титром и могут быть использованы для обнаружения р2М в сыворотке человека и к культуре Е.соіі (рис. 1). В связи с ограниченностью количества природного Р2М для изучения фибриллогенеза было решено получить рекомбинантный белок. Из литературы известно, что созданные ранее другими группами рекомбинантные р2М в бактериальных культурах имет 1234 123456 _ Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения белков в 12% ПААГ. Рисунок слева: окраска Coomassie brilliant blue R250. 1 - маркер молекулярного веса (Fermenlas). Снизу вверх: 11 кДа, 17 кДа, 28 кДа, 36 кДа, 55 кДа, 72 кДа, 95 кДа; 2 - |32М, выделенный из диализата больных на гемодиализе; 3 - рекомбинантный Р2М; 4 - концентрат диализата больного, длительное время находящегося на гемодиализе. Рисунок справа: после WESTERN-BLOT нитроцеллюлозный фильтр разрезан на 2 части. Дорожки 1, 2, 3 окрашены амидо-шварц. Дорожки 4, 5, 6 обработаны кроличьими антителами к |32М и окрашены с помощью меченных пероксида- зой антител козы против IgG кролика (Sigma). 1,4- рекомбинантный Р2М; 2, 5 - белок слияния P2MSF; 3,6- зеленый флуоресцентный белок ют дополнительный метионин на N-конце и аккумулируются внутри бактерий в тельцах включения [12, 21, 16, 10]. Как известно, получение белка из телец включения чаще всего является достаточно сложной задачей, особенно, если белок плохо ренатурирует. Обычно извлечение белка из телец включения требует их растворения в сильных детергентах (мочевина, гуанидинхлорид и т.д.), после чего требуется стадия рефолдинга. Однако ренатурация происходит не всегда, и не может быть полной уверенности, что в дальнейшей работе используется белок, идентичный по всем параметрам природному [28]. Для некоторых белков ренатурация неосуществима. Поэтому получение растворимых, не образующих телец включения белков представляется весьма актуальной задачей. Для достижения поставленной цели мы использовали два подхода. Первый подход заключался в конструировании вектора, несущего ген целевого белка, содержащий дополнительные последовательности, которые направляют синтезируемый белок в периплазму. Второй подход состоял в получении вектора, содержащего нуклеотидную последовательность белка слияния [32М и superfolder green fluorescent protein (SFGFP). Суперфолдер (искусственно полученный мутантный GFP) обладает способностью восстанавливать исходную третичную структуру после полной денатурации, и, кроме того, он способствует правильному фолдингу синтезируемых вместе с ним в бактериальной клетке белков слияния [24]. Поэтому мы предположили, что наличие в составе белка слияния superfolder GFP будет способствовать формированию нативной структуры [32М и препятствовать образованию телец включения. Рекомбинантный р2М получали из клеток Escherichia соіі штамма BL21(DE3), трансформированных созданной нами плазмидой рЕТЬ2ш6.8. Вектор сконструирован так, что белок синтезируется вместе с бактериальным РеІВ «лидерным пептидом», транспортирующим его в периплазматическое пространство бактерии, и впоследствии отщепляющимся под воздействием бактериальной протеазы. Это позволяет получить белок, не содержащий дополнительного метионина на N-конце и начинающийся сразу с изолейцина, первой аминокислоты (32М человека. Как и ожидалось, в периплазме был обнаружен растворимый (32М, который не образовывал телец включения. Такая процедура позволяет уже на стадиях экстракции отделить целевой белок от большинства бактериальных примесей. Включение в |32М полигистидиновой последовательности на С-конце дает возможность аффинно очистить белок на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте. В результате процедура очистки становится весьма эффективной и быстрой. Уже экстракция периплазматической фракции сопровождается извлечением оботащенного Р2М. Аффинная хроматография приводит к полной очистке Р2М в одну стадию (рис. 1). Весьма интересным является белок слияния P2MSF, который также легко выделяется из бактериальной культуры благодаря полигистидиновой последовательности на С-конце SFGFP. По данным электрофоретического разделения с последующим вестерн-блоттингом, P2MSF обладал антигенными детерминантами Р2М (рис. 1). При возбуждении светом с длиной волны 460 нм P2MSF флуоресцировал зеленым светом. Белок слияния в условиях фибриллогенеза образовывал структуры, видимые с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (рис. 2). Следует отметить, что при pH 2,0 (32MSF обесцвечивается из-за изменения конформации GFP, но увеличение pH раствора до 5,0 и выше возвращает белку зеленую флуоресценцию. К сожалению, разрешающая способность микроскопа такого типа не позволяет различать сами фибриллы, поэтому видимые при конфокальной микроскопии образования можно интерпретировать или как над- фибриллярные структуры, или как не содержащие фибриллы агрегаты. Наличие фибрилл подтверждается и данными анализа флуоресценции тиофлавина Т в комплексе с Р2М. Этот метод количественного обнаружения фибрилл является общепринятым [19, 25, 26, 18, 10, 12, 16, 21]. В образцах, содержащих фибриллы, мы наблюдали возрастание флуоресценции по сравнению с контролем - раствором мономера Р2М (30 мкмоль), содержащим ту же концентрацию тиофлавина Т (рис. 2). К сожалению, фибриллы белка слияния исследовать с помощью тиофлавина не представляется возможным из-за собственной флуоресценции зеленого флуоресцентного белка. Рис. 2. Спектр флуоресценции комплекса тиофлавина Т с фибриллами (слева). Возбуждение - 460 нм. По оси абсцисс - длина волны флуоресценции в нанометрах, по оси ординат - относительные единицы флуоресценции. Показаны графики флуоресценции амилоидных фибрилл рекомбинантного|32М (сплошная линия) и р2М, выделенного из диализата больных на гемодиализе (прерывистая линия). В качестве нулевой пробы использовали мономер Р2М в той же концентрации. Рисунок справа: конфокальная микроскопия белка слияния P2MSF. Масштабная шкала в правом нижнем углу соответствует 10 мкм Fla рис. 3 и 4 представлены результаты электронной и атомно-силовой микроскопии образцов (32М, подвергнутых фибриллогенезу. Видно, что как рекомбинантный р2М, являющийся полноразмерным |32М человека, так и рекомбинантный белок слияния образуют характерные фибриллярные структуры. Гемодиализный амилоидоз (Ар2М) относится к вторичным амилоидозам. Основным условием его развития считается увеличение концентрации Р2М, обусловленное угнетением выведения белка поврежденными почками. Несмотря на то, что гемодиализный амилоидоз относится к заболеваниям с нефатальными последствиями, это осложнение основного заболевания приводит к резкому ухудшению качества жизни пациентов. Поэтому изучение патогенеза Ар2М на молекулярном уровне является актуальным и, по нашему мнению, позволит не только разработать раннюю диагностику, но и найти подходы для терапии. Кроме того, выяснение закономерностей фибриллогенеза Р2М, лежащего в основе патогенеза данного амилоидоза, представляется самостоятельной фундаментальной задачей белковой химии, так как выявляет взаимосвязи фолдинга белков и их способности формировать аномальные мультимолекулярные структуры. Для решения поставленных задач необходимо иметь достаточное количество белка, сходного по своим характеристикам природного Р2М и способного в определенных условиях формировать амилоидные фибриллы. Как следует из представленных результатов, нам удалось получить как природный, так и рекомбинантные аналоги (32М, которые по всем свойствам удовлетворяют поставленным требованиям. В настоящее время мы можем в достаточном количестве и с минимальными временными и финансовыми затратами получать варианты [32М. Эти белки, как показано, формируют амилоидные фибриллы. Фибриллогенез белка слияния P2MSF может быть исследован с помощью конфокальной микроскопии. Природный Р2М и его рекомбинантные формы предполагается использовать для изучения закономерностей фибриллогеназа in vitro. В частности, планируется изучить влияние некоторых фармакологических препаратов на способность Р2М формировать фибриллы. В настоящее время проводятся исследования особенностей связывания фибрилл разных белков, в том числе и Р2М, с красителями. Фибриллы Р2М используются для получения специфических антител, которые взаимодействуют именно с аномальными конформерами белка и с фибриллярными формами. Для этих же целей используется и белок слияния, фибриллогенез которого можно исследовать in vivo. Фибриллярные формы р2М предполагается также использовать для изучения взаимодействия с другими белками плазмы крови и Рис. 3. Атомно-силовая микроскопия фибрилл рекомбинантного (32М (сверху) и белка слияния |32MSF (снизу) с белками соедршительной ткани, а также с компонентами соединительной ткани, которые постоянно присутствуют в зрелом амилоиде различного происхождения. Сравнительный анализ фибриллогенеза Р2М и других амилоидогенных белков позволит выявить отличительные свойства разных амилоидов и их тропность к определенным тканям. Рис. 4. Электронная микроскопия фибрилл рекомбинантного Р2М (слева) и белка слияния P2MSF (справа). Масштабная шкала в правом нижнем углу соответствует 100 нм Как показывают клинические исследования, амилоидозы представляют собой довольно распространенную патологию, которая в настоящее время плохо диагностируется и практически не поддается обычным видам терапии. Наиболее часто амилоидозы проявляются как заболевания нервной системы и повреждения сердечной мышцы (кардиомиопатии). В последнем случае больные страдают тяжелыми формами сердечной недостаточности с поздней постановкой правильного диагноза. В настоящее время единственным достоверным критерием амилоидоза являются гистохимическое исследование биоптатов с последующим уточнением природы амилоидоза (иммуногистохимия) и в ряде случаев (наследственные амилоидозы) с привлечением методов молекулярной генетики. Мы надеемся, что исследование фибриллогенеза р2М позволит сделать шаг вперед по направлению к ранней диагностике и разработке эффективных способов терапии как гемодиализного, так и других амилоидозов. ВЫВОДЫ 1. Разработан простой и эффективный способ получения нативного природного р2М без примесей из диализата больных на хроническом гемодиализе. 2. Получена экспрессионная генетическая конструкция, позволяющая синтезировать Р2М человека в бактериальной системе с аккумуляцией белка в периплазме. 3. Получена экспрессионная генетическая конструкция для получения белка слияния |32М и зеленого флуоресцентного белка. 4. Показано, что полученные конструкции позволяют экспрессировать целевые гены в бактериальных клетках с синтезом нативных белков, которые не образуют тел включения. 5. Разработаны простые и эффективные методы получения рекомбинантных Р2М. 6. Показано, что природный и рекомбинантные Р2М формируют амилоидные фибриллы, которые могут быть использованы для изучения механизмов фибриллогенеза и путей его предотвращения. 7. Полученный белок слияния P2MSF может быть использован для изучения фибриллогенеза с помощью конфокальной микроскопии, так как он, с одной стороны, образует фибриллы, а с другой - флуоресцирует в зеленом диапазоне. Авторы выражают благодарность к.ф-м.н. Исаеву-Иванову В. В. за помощь в проведении экспериментов по атомной силовой микроскопии.

D S Poyakov

Email: dipoi@mail.org

N A Grudinina

K V Solovyov

V V Egorov

A K Sirotkin

T D Aleinicova

Areg A Totolian

M M Shavlovsky

  1. Брок Й. Получение препаратов иммуноглобулинов // Иммунологические методы / Г. Фримель. М.: Медицина, 1987. С. 390.
  2. Ермоленко В.М. Хроническая почечная недостаточность // Нефрология: Руководство для врачей / Под ред. Іі.Е. Тареевой. М.: Медицина, 2000. С. 633- 634.
  3. Харбоу Н., Ингильд А. Иммунизация, выделение иммуноглобулинов, определение титра антител // Руководство по клиническому электрофорезу. М.: Мир, 1977. С. 200-205.
  4. Шило В., Денисов А. Позднее осложнение программного гемодиализа: бета-2-микроглобулиновый амилоидоз // Врач : Ежемесячный научно-практический и публицистический журнал. 2002. № 6. С. 7-12.
  5. Guideline 10. p2-microglobulin amyloidosis // Clinical Practice Guidelines for Bone Metabolism and Disease in Chronic Kidney Disease / Massry S.G., Cobum J.W. // Am. J. Kidney Dis. 2003. Vol. 42 (Suppl. 3). P. 1-202.
  6. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E. et al. // Current Protocols in Molecular Biology. 1989. John Wiley & Sons, New York.
  7. Benz R.L., Siegfried J.W., Teehan B.P. Carpal tunnel syndrome in dialysis patients: Comparison between continuous ambulatory peritoneal dialysis and hemodialysis populations //Am.1. Kidney Dis. 1988. № 11. P. 473-476.
  8. Berggard I., Beam A.G. Isolation and properties of a low molecular weight B2-globulin occurring in human biological fluids // J. Biol. Chem. 1968. № 243. P. 4095-4103.
  9. Campistol J.M., Sole M., Munoz-Gomez J., Lopez-Pedret J., Revert L. Systemic involvement of dialysis-amyloidosis //Am. J. Nephrol. 1990. № ю. P. 389-396.
  10. Chiba T., Hagihara Y., Higurashi T., Hasegawa K., Nai- lci H., Goto Y. Amyloid fibril formation in the context of full-length protein. Effects of proline mutations on the amyloid fibril formation of B2-microglobulin // J. Biol. Chem. 2003. № 278. P. 47016-47024.
  11. Comelis F., Bardin T., Faller B. et al. Rheumatic syndromes and beta 2-microglobulin amyloidosis in patients receiving long-term peritoneal dialysis // Arthritis Rheum. 1989. № 32. P. 785-788.
  12. Esposito G., Michelutti R., Verdone G. et al. Removal of the N-terminal hexapeptide from human b2-micro- globulin facilitates protein aggregation and fibril formation // Protein Sci. 2000. № 9. P 831-845.
  13. Gal R., Korzets A., Schwartz A., Rath-Wolfson L., Gafter U. Systemic distribution of beta 2-microglobulin-derived amyloidosis in patients who undergo longterm hemodialysis. Report of seven cases and review of the literature // Arch. Pathol. Lab. Med. 1994. № 118. P. 718-721.
  14. Goldsby R.A., Kindt T.J., Osborne B.A. Major histocompatibility complex // Kuby Immunology / Freeman W.H. 2007. P. 166-178.
  15. Jadoul M., Garbar C., Noel H., Sennesael J., Vanholder R., Bemaert P, Rorive G., Hanique G., van Ypersele, de Strihou C. Histological prevalence of beta 2-microglobulin amyloidosis in hemodialysis: a prospective post-mortem study // Kidney Int. 1997 (Jun). Vol. 51 (6). P. 1928-1932.
  16. Kad N.M., Thomson N.H., Smith D.P., Smith D.A., Radford S.E. // J. Mol. Biol. 2001. № 313. P. 559- 571.
  17. Kayed R.K., Glabe C.G. Conformation-Dependent Anti-Amyloid Oligomer Antibodies // Methods in enzymology. 2006. Vol. 413. P. 326-344.
  18. Kihara M., Chatani E., Sakai M., Hasegawa K., Naiki H., Goto Y. Seeding-dependent maturation of (32- microglobulin amyloid fibrils at neutral pH // J. Biol. Chem. 2005. № 280. P. 12012-12018.
  19. LeVine H. Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer’s disease b-amyloid peptides: detection amyloid aggregation in solution // Prot. Sci. 1993. № 2. P. 404M10.
  20. Maruyama Н., Gejyo F., Aralcawa M. Clinical studies of destructive spondyloarthropathy in long-term hemodialysis patients //Nephron. 1992. № 61. P. 37- 44.
  21. McParland V.J., Kad N.M., Kalverda A.P., Brown A., Kirwin-Jones P., Hunter M. G., Sunde M., Radford S.E. // Biochemistry. 2000. № 39. P. 8735-8746.
  22. Moriniere P., Marie A., el Esper N., Fardellone P., Derarnond H., Remond A., Sebert J.L., Fournier A. Destructive spondyloarthropathy with beta 2-microglobulin amyloid deposits in a uremic patient before chronic hemodialysis //Nephron. 1991. № 59. P. 654-657.
  23. Ohashi К., Нага M., Kawai R., Ogura Y., Flonda K., Nihei H., Mimura N. Cervical discs are most susceptible to beta 2-microglobulin amyloid deposition in the vertebral column // Kidney Int. 1992. № 41. P. 1646- 1652.
  24. Pedelacq J.D., Cabantous S., Tran T., Terwilliger T.C., Waldo G.S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein // Nat. Biotechnol. 2006. Vol. 24. № 1. P. 79-88.
  25. Sasahara K., Yagi H., Naiki FI., Goto, Y. Heat-triggered conversion of protofibrils into mature amyloid fibrils of (32-microglobulin // Biochemistry. 2007. № 46. P. 3286-3293.
  26. Sasahara K., Yagi H., Naiki H., Goto Y. Heat-induced conversion of (32-microglobulin and hen egg-white lysozyme into amyloid fibrils // J. Mol. Biol. 2007. № 372. P. 981-991.
  27. Sprague S.M., Мое S.M. Clinical manifestations and pathogenesis of dialysis-related amyloidosis // Semin. Dial. 1996. №9. P.360-369.
  28. Ventura S., Villaverde A. Protein quality in bacterial inclusion bodies // Trends Biotechnol. 2006. № 24. P. 179-185.
  29. Zingraff J.J., Noel L.H., Bardin T., Atienza C., Zins B., Drueke T.B., Kuntz D. Beta 2-microglobulin amyloidosis in chronic renal failure // N. Engl. J. Med. 1990. № 323. P. 1070-1071.

Views

Abstract - 43

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2010 Poyakov D.S., Grudinina N.A., Solovyov K.V., Egorov V.V., Sirotkin A.K., Aleinicova T.D., Totolian A.A., Shavlovsky M.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies