REMOTE ISCHEMIC PRE- AND POSTCONDITIONING ABOLISHED DELAYED HIF-1a EXPRESSION IN THE RAT HIPPOCAMPUS ALONGSIDE WITH THE CORRECTION OF EXPERIMENTAL POST-TRAUMATIC STRESS DISORDER

Abstract


Aims of the study. To examine effects of remote ischemic pre- and postconditioning which prevents development of the experimental post-traumatic s tress disorder (PTSD) in rats on the dynamics of expression of regulatory a-subunit of hypoxia-inducible factor (HIF-1a) in hippocampus. Materials and methods. Using immunohistochemistry method, the level of HIF-1a immunoreactivity has been quantitatively assessed in the hippocampus of animals exposed to stressors in the “traumatic stress-restress” paradigm, and by using the three-time remote limb ischemia which prevented the formation of anxiety pathology in this model. Results. Development of the PTSD-like pathology in rats was accompanied by considerable and persistent (up to 10 days after restress) up-regulation of HIF-1a immunoreactivity level in the CA1 field and dentate gyrus of hippocampus. Conditioning remote ischemia applied before traumatic stress (preconditioning) or following restress (postconditioning) did not affect early post-stress induction of HIF-1a (the first day) but abolished the delayed overexpression of this factor (5-10 days). Conclusions. The data obtained support our recent hypothesis on the pathogenic role of increased HIF-1 factor activity for the development of stress-related anxiety and depressive disorders within the delayed time-period. This also gives evidence to the fact that normalization of delayed violations of HIF-1a expression is obviously the key link of stress-protective effects of remote ischemic conditioning.

Введение. Посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) - это тревожная патология , развивающаяся как затяжная реакция на переживание сверхинтенсивных стрессовых событий, связанных с реальной или воспринимаемой угрозой жизни. Одной из наиболее общепринятых и этиологически-обоснованных экспериментальных моделей ПТСР на животных является парадигма «травматический стрессрестресс» [1], в которой ПТСР-подобное состояние у крыс возникает в результате последовательного действи двух стрессов. Первый - тяжелый комбинированный («травматический») стресс (ТС), за которым спустя 7 сут с целью напоминани о психотравмирующем воздействии предъявляется мягкий стресс («рестресс»). Согласно современным представлени м, ТС вл -ется патогенным фактором, повышающим реактивность нервной и нейроэндокринной системы на последующий рестресс, тогда как последний выполняет роль триггера для проявления характерной дл ПТСР симптоматики, в том числе повышения уровня тревожности и специфических гормональных нарушений (снижение базального уровня глюкокортикоидных гормонов в крови и включение «быстрой» обратной связи - феномен fast feedback) [1$3]. В связи с посто нно возрастающей распространенностью ПТСР и высокими рисками его возникновени в современном мире, полном экстремальных воздействий различной природы, раскрытие патогенетических механизмов ПТСР и разработка эффективных способов и средств его терапии представляют собой крайне актуальную проблему дл медицины и биомедицинских исследований. В этом отношении исследования в экспериментальных моделях на животных открывают широкие возможности и перспективы. В течение ряда лет нами проводятся исследования по поиску эффективных немедикаментозных способов коррекции ПТСР-подобного состояния в моделях на крысах и выявлению церебральных и нейроэндокринных механизмов данных протективных воздействий. Было впервые показано, что гипокси -индуцибельный фактор HIF-1 способен активироваться не только в гипоксических услови х, как полагали ранее, но и в ответ на такие негипоксические воз-действи , как психоэмоциональные стрессы, причем стойкая а п-регуля ция р егуляторной субъединицы HIF-1a в гиппокампе и неокор-тексе в отдаленный постстрессовый период сопровождала формирование тревожно-де прессивных состояний в моделях депрессии и ПТСР у крыс. Более того, коррекци этих патологических состо ний путем применени гипокси-гипобарического кондиционирования приводила к нормализации отдаленной сверхэкспрессии HIF-1a [4, 5]. Являя сь эффективным нейропротективным воздействием, гипок-си-гипобарическое кондиционирование тем не менее представля ет собой не очень удобный с точки зрения внедрения в широкую медицинскую практику способ, поскольку требует проведени достаточно интенсивных гипоксических сеансов в барокамере («подъемы» на условную высоту 5 км). Более перспективным в этом отношении считаетс создание дистантной ишемии конечности, также оказывающей значительное нейропротективное действие при и шем и че с к и х, т рав м а ти че с к и х и д р у г и х нару-шени х [6-8]. В наших работах недавно было обнаружено, что интервальна дистантна ишеми конечности в режиме пре- и посткондиционирования оказывает выраженный стресс-протективный эффект в модели «травматическсий стресс-рестресс», предотвраща формирование экспериментального ПТСР [9]. Цель исследования: анализ возможного участи фактора HIF-1 в механизмах формировани адаптивных реакций при дистантном кондиционировании в экспериментальной модели ПТСР. Оценивали динамику экспрессии HIF-1a в разных областях гиппокампа (поле СА1 и зубчатая извилина) при коррекции ПТСР-подобного со-сто ни применением дистантного ишемического пре- и посткондиционировани у крыс. Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на 60 взрослых самцах крыс линии Вистар массой около 200 г из Биоколлекции «Коллекци лабораторных млекопитающих разной таксономической принадлежности» ИФ РАН, поддержанной программой биоресурсных коллекций ФАНО России. При проведении экспериментов соблюдались требовани , сформулированные в Директиве 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета ЕС по охране ж ивотных, используемых в научных цел х. Крыс разделили на контрольную (6 животных) и три экспериментальных группы по 18 животных в каждой. У животных группы «ТС-Р» индуцировали аналог посттравматического стрессового расстройства (ПТСР), используя модель «травматический стресс - рестресс» [1], ко торая включала тя желый патогенный травматический стресс (2 ч иммобилизации, 20 мин вынужденного плавания и после 15-минутного перерыва - воздействие эфиром до обездвиживания) и через 7 суток - напоминающий рестресс (30 мин иммобилизации), запускающий проявление симптоматики тревожного патологического состояния. Крыс 2-й и 3-й экспериментальных групп дополнительно подвергали воздействию дистантной ишемии конечности - трехкратному пятиминутному пережатию задней конечности на уровне верхней трети бедра с помощью нейлоновых жгутов с реперфузионными перерывами в 15 мин. Животным группы «дпТС-Р» трехкратную ишемизацию конечности о существляли в режиме прекондиционировани перед стрессированием в модели ПТСР, последний сеанс за 15 мин до начала ТС. Крысы из группы «ТС-Рдп» подвергались действию дистантного ишемического посткондиционировани , в этом случае первый из трех ишемических эпизодов следовал через 15 мин после рестресса. В обоих случаях дистантное ишемическое кондиционирование предотвращало формирование экспериментального ПТСР у крыс [9]. Спустя 1, 5 и 10 сут после рестресса (ранний, промежуточный и отсроченный постстрессовый период соответственно) по 6 крыс из каждой экспериментальной группы декапити-ровали, затем, после извлечения мозга и фиксации в Immunofix (BioOptica, Italy) в течение 24-48 ч, стандартных процедур обезвоживания и заливки в парафиновую среду, изготавливали срезы во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм на координатных уровня х около $2,8 от брегмы. Для иммуногистохимической оценки содержания HIF-1a в нейронах гиппокампа контрольных, стрессированных (ТС-Р), прекондиционированных перед стрессированием (дпТС-Р), и посткондиционированных (ТС-Рдп) крыс срезы инкубировали с поликлональными антителами к HIF-1a (Santa Cruz, USA), в разведении 1:100, далее обрабатывали с использованием наборов для детекции фирмы Vector Labs, USA и проводили оценку иммунорективности к HIF-1a на основании компьютерного анализа микроизображений поля СА1 и зубчатой извилины гиппокампа крыс. Использу программу ВидеоТест Мастер Морфологи (ООО «ВидеоТест», СПб), производили подсчет числа иммунопозитивных клеток, с их автоматическим разделением на слабо- и интенсивно-иммунопозитивные по величине оптической плотности в условных единицах по сравнению с фоном. Для каждого животного анализировали 2$3 среза, подсчет производили в поле длиной 500 мкм, использовали усредненные значения по каждой области мозга у конкретного животного. Эти данные обрабатывали, вычисл среднюю арифметическую величину и стандартную ошибку среднего в исследуемых подгруппах животных (6 крыс для каждой точки забора материала), сравнивали средние значени выборок. Статистическую обработку проводили средствами однофакторного дисперсионного анализа ANOVA (Statistica 7.0, Statsoft Inc., USA), с достоверностью различий при p<0,05. Результаты представлены в виде среднего арифметического значения, выраженного в процентах о т среднего значения соответствующей контрольной группы, прин той за 100%, ± стандартная ошибка среднего, выраженная в процентах. Результаты и их обсуждение. В гиппокампе животных, подвергнутых стрессированию в модели ПТСР «травматический стресс-рестресс» (ТС-Р), по сравнению с контрольной группой, выявлялось значительное и устойчивое (до 10 дней после рестресса) увеличение как общего количества иммунопозитивных к регул торной a-субъединице фактора HIF-1 (HIF-1a) нейронов, так и иммунореактивных нейронов с интенсивной окраской. Число последних в области СА1 в ранний постстрессорный период возрастало в ответ на рестресс до 502% от контроля, оставаясь значительно повышенным (600% на 10-е сутки) в течение всего периода наблюдения (рисунок б, черные столбики). В зубчатой извилине гиппокампа существенный рост интенсивности экспрессии HIF-1a также сохранялся до 10 дней (571%) после рестресса (рисунок, г). Животные, перенесшие 3 сеанса дистантной ишемии конечности перед ТС, демонстрировали возрастание общего числа HIF-1a-содержащих нейронов (рисунок, а и в, белые столбики) и числа интенсивно иммунопозитивных клеток (рисунок, б и г) в гиппокампе исключительно в ранний постсрессорный период (1-е сутки после рестресса). В промежуточный и отсроченный периоды уровень данного фактора возвращалс к контрольным значени м, оказыва сь достоверно ниже показателей группы ТС-Р. Сходный временной паттерн экспрессии HIF-1a наблюдался и у ТС-Рдп животных, которым дистантная ишемия предъя влялась в режиме посткондицио-нировани , после рестресса. В гиппокампе таких крыс через 24 ч после рестресса количество интенсивно иммунореактивных к HIF-1a нейронов достигало 859% в области СА1 (рисунок, б, штрихованные столбики) и 543% в зубчатой извилине (рисунок, г) гиппокампа, при этом отсро-ченна свехэкспресси данного фактора в гиппокампе полностью нивелировалась. 800% 1 сутки 5 сутки 10 сутки 600% 400% 200% 0% Рисунок. Изменения иммунореактивности к HIF-1a в области СА1 (а, б) и зубчатой извилине (в, г) гиппокампа крыс в процессе формирования и коррекции экспериментального ПТСР. По оси абсцисс - дни после рестресса; по оси ординат - общее количество НЖ-1а-позитивны1х клеток (а, в) либо число интенсивно-иммунореактивных клеток (б, г) в % от значений контрольной группы. Серые столбики - интактный контроль, принятый за 100%; черные столбики - группа ТС-Р, у которой развиваетс экспериментальное ПТСР; белые столбики - группа дпТС-Р, в которой дистантное прекондиционирование применялось перед травматическим стрессом; штрихованные столбики - группа ТС-Рдп, которой дистантное посткондиционирование предъя влялось после рестресса. * Различия достоверны по отношению к контролю; # достоверные различия относительно группы ТС-Р, р<0,05. Согласно традиционным представлениям, HIF-1 считается ключевым фактором клеточной адаптации к гипоксии. В условиях нормок-сии a-субъединица HIF-1 (HIF-1a) подвергается деградации путем пролил-гидроксилазной реакции, тогда как при гипоксии происходит инак-тиваци фермента пролил-гидроксилазы и стабилизация HIF-1a, что приводит к образованию активного HIF-1 [10]. В св зи с этим HIF-1a является регуляторной субъединицей, и ее уровень коррелирует с транскрипционной активностью HIF-1. Таким образом, долгое время полагали, что накопление HIF-1 в нейронах происходит только в услови х гипоксии. Однако в последнее время внимание исследователей все больше привлекается к негипоксическим способам активации HIF-1. В частности, накапливаются сведения, что на повышение содержания HIF-1a могут влия ть возрастающие количества активных форм кислорода [11], недостаточные уровни глюкокортикоидных гормонов крови, подавляющих его синтез [12], активация протеинкиназных каскадов [13] в различных областя х мозга и др. Факты, полученные в наших последних ис-следовани х, позвол ют уверенно говорить о том, что мощным негипоксическим стимулом, вызывающим активацию HIF-1 в нейронах мозга, в-л етс психоэмоциональный стресс, причем, в отличие от общепринятых представлений, в данных услови х HIF-1 очевидно вл етс фактором патологии, нежели адаптации. В частности, в настоящей работе развитие ПТСР-подобного расстройства у крыс сопровождалось значительной и пролонгированной индукцией HIF-1a в гиппокампе, что также подтверждает полученные ранее данные. При анализе «скрытого периода» (периода между ТС и рестрессом) было выявлено, что патогенный ТС не приводит к индукции HIF-1a [4]. Э то позволяет предположить, что устойчивую ап-регул цию данного фактора вызывает именно рестресс. При этом следует отметить, что субъединица HIF-1a - продукт раннего гена hif, для которого, как и дл других ранних генов, характерны волновая динамика, быстрая и непродолжительная индукция [14]. По этой причине длительное поддержание повышенной экспрессии HIF-1a при формировании экспериментального ПТСР отражает нарушение волновой динамики. Представляется важным, что аналогичные нарушения, в частности устойчивая ап-регуляция в отдаленный период, отмечены и для другого продукта раннего гена - транскрипционного фактора с-Fos [15]. По литературным данным, подобная отсроченная экспрессия ранних генов связана с развитием патологического процесса после повреждающих и стрессорных воздействий [14]. На этом основании можно предположить, что стойкая сверхэкспрессия ранних генов, и в первую очередь HIF-1a, составляет один из важных компонентов патогенетического процесса при ПТСР. Более того, отсроченная индукция HIF-1a наблюдалась также и после острого психоэмоционального стресса в модели депрессии [5], поэтому возможно, что длительно поддерживающаяся акти-ваци HIF-1 носит дезадаптивный характер и в-л етс механизмом патогенеза не только ПТСР, но и других посстрессорных расстройств, в том числе депрессии. У животных, подвергнутых дистантному ишемическому пре- либо посткондиционированию, одновременно с коррекцией ПТСР-подобной симптоматики нивелируетс отсроченна экспресси HIF-1a. Как уже отмечалось выше, применение другого способа пре- и посткондиционировани - гипоксического (трехкратная умеренная гипобарическая гипоксия) проводило к сходным результатам [4]. В частности, в гиппокампе животных, получивших сеансы умеренной гипоксии, нар ду с коррекцией поведенческих и гормональных нарушений также полностью предотвращалась длительна сверх индукция HIF-1a. При этом особенностью при-менени кондиционировани дистантной ишемией конечности вл етс сохранение так называемой «ранней волны» экспрессии данного фактора после стрессировани , тогда как гипоксическое кондиционирование полностью предотвращало индукцию HIF-1a в гиппокампе после рестресса [4]. Известно, что HIF-1 в мозге может играть роль патогенного или протективного фактора. Он является ведущим регулятором транскрипции генов, ответственных за реакцию на недостаток кислорода, а также генов, связанных либо с адаптивными реакци ми, пластичностью и обучением, либо с дегенерацией нейронов и развитием патологий. С одной стороны, как транскрипционный фактор, HIF-1 активирует экспрессию цитокина эритропоэтина, оказывающего широкий спектр нейропротективных эффектов, включа стимул цию процессов нейропластичности [16]. С другой стороны, он может быть св зан с расстройством механизмов адаптации к стрессу, вли на регул цию гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГАС). HIF-1 модифицирует экстрагипоталамические вли ни на центры гипоталамуса, участвует в регуляции транскрипции глюкокортикоидных рецепторов [17], поэтому его чрезмерная активация может приводить к нарушениям контуров саморегул ции нейроэндокринной системы, дисбалансу нейрогормонов ГАС и стероид-рецеп-тирующих механизмов. Возможно, именно нормализация уровня HIF-1a в зубчатой извилине гиппокампа - структуре, известной своим ключевым участием в нейроэндокринной регуляции ГАС по механизму обратной св зи, у кондиционированных гипоксией или ишемией животных предотвращает в дальнейшем характерную дл ПТСР дисрегул цию Заключение. Результаты настоящего ис-следовани свидетельствуют о том, что стресс-протективный и анксиолитический эффект дистантного ишемического пре- и посткондици-онировани в модели ПТСР сопровождается нивелированием пролонгированной сверхиндукции HIF-1 и сохранением его ранней постстрессорной активации в нейронах гиппокампа крыс. Работа поддержана грантом РФФИ 16-3460095 и Программой ПФНИ ГАН ГП-14 (направление 65).

K A Baranova

FSBSI “Pavlov Institute of Physiology of the Russian Academy of Sciences”

E A Rybnikova

FSBSI “Pavlov Institute of Physiology of the Russian Academy of Sciences”

  1. Liberzon I., Krstov M., Young E.A. Stress restress: effects on ACTH and fast feedback // Psychoneuroendocrinology. 1997. Vol. 22 (6). P. 443-453.
  2. Рыбникова Е.А., Миронова В.И., Тюлькова Е.И., Самойлов М.О. Анксиолитический эффект умеренной гипобарической гипоксии у крыс в модели посттравматического стрессового расстройства // ЖВНД им. И.П. Павлова. 2008. Т. 58, № 4. С. 486-492. [Rybnikova E.A., Mironova V.I., Tiul'kova E.I., Samoĭlov M.O. The anxyolytic effect of mild hypobaric hypoxia in a model of post-traumatic stress disorder in rats // Zh Vyssh Nerv Deiat Im I.P. Pavlova. 2008. Vol. 58 (4). P. 486-492].
  3. Рыбникова Е.А., Воробьев М.Г., Самойлов М.О. Гипоксическое посткондиционирование корректирует нарушения поведения крыс в модели посттравматического стрессового расстройства // ЖВНД им. И.П. Павлова. 2012. Т. 62, № 3. С. 364-371. [Rybnikova E.A., Vorob'ev M.G., Samoĭlov M.O. Hypoxic postconditioning corrects behavioral abnormalities in a model of post-traumatic stress disorder in rats // Zh Vyssh Nerv Deiat Im I.P. Pavlova. 2012. Vol. 62, No 3. P. 364-371].
  4. Baranova K.A., Rybnikova E.A., Samoilov M.O. The Dynamics of HIF-1α Expression in the Rat Brain at Different Stages of Experimental Posttraumatic Stress Disorder and its Correction with Moderate Hypoxia // Neurochemical Journal. 2017. Vol. 11, Nо 2. P. 149-156.
  5. Baranova K.A., Mironova V.I., Rybnikova E.A., Samoilov M.O. Characteristics of the Transcription Factor HIF-1α Expression in the Rat Brain during the Development of a Depressive State and the Antidepressive Effects of Hypoxic Preconditioning // Neurochemical Journal. 2010. Vol. 4, No 1. P. 35-40.
  6. Ren C., Gao M., Dornbos D. 3rd, Ding Y., Zeng X., Luo Y., Ji X. Remote ischemic post-conditioning reduced brain damage in experimental ischemia/reperfusion injury // Neurol. Res. 2011. Vol. 33. P. 514-519.
  7. Joseph B., Pandit V., Zangbar B., Kulvatunyou N., Khalil M., Tang A., O'Keeffe T., Gries L., Vercruysse G., Friese R.S., Rhee P. Secondary brain injury in trauma patients: the effects of remote ischemic conditioning // J. Trauma Acute Care Surg. 2015. Vol. 78. P. 698-703.
  8. Li S., Hu X., Zhang M., Zhou F., Lin N., Xia Q., Zhou Y., Qi W., Zong Y., Yang H., Wang T. Remote ischemic post-conditioning improves neurological function by AQP4 down-regulation in astrocytes // Behav. Brain Res. 2015. Vol. 289. P. 1-8.
  9. Baranova K.A. Mild hypoxic and remote ischemic preconditioning in the prevention and correction of anxiety and depressive disorders in animal models // Official J. of the Internat. Stress and Behavior Society. 2016. Vol. 5. P. 17.
  10. Wang G.L., Jiang B.H., Rue E.A., Semenza G.L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 5510-5514.
  11. Bell E.L., Chandel N.S. Mitochondrial oxygen sensing: regulation of hypoxia-inducible factor by mitochondrial generated reactive oxygen species // Essays Biochem. 2007. Vol. 43. P. 17-27.
  12. Wagner A.E., Huck G., Stiehl D.P., Jelkmann W., Hellwig-Bürgel T. Dexamethasone impairs hypoxia-inducible factor-1 function // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 372, Nо 2. P. 336-340.
  13. Richard D.E., Berra E., Pouyssegur J. Nonhypoxic pathway mediates the induction of hypoxia-inducible factor 1alpha in vascular smooth muscle cells // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 26765-26771.
  14. Senba E., Ueyama T. Stress-induced expression of immediate early genes in the brain and peripheral organs of the rat // Neurosci. Res. 1997. Vol. 29 (3). P. 183-207.
  15. Baranova K.A., Rybnikova E.A., Samoilov M.O. Involvement of the Transcription Factor c-Fos in the Protective Effect of Hypoxic Preconditioning in a Model of Post-Traumatic Stress Disorder in Rats // Neurochemical Journal. 2011. Vol. 5, Nо 4. P. 257-262.
  16. Paschos N., Lykissas M.G., Beris A.E. The role of erythropoietin as an inhibitor of tissue ischemia // Int. J. Biol. Sci. 2008. Vol. 10, Nо 4 (3). P. 161-168.
  17. Leonard M.O., Godson C., Brady H.R., Taylor C.T. Potentiation of glucocorticoid activity in hypoxia through induction of the glucocorticoid receptor // J. Immunol. 2005. Vol. 174, Nо 4. P. 2250-2257.

Views

Abstract - 68

PDF (Russian) - 1

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Baranova K.A., Rybnikova E.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies