CIRCULATING NEUTROPHIL EXTRACELLULAR TRAPS IN TYPE 2 DIABETES MELLITUS PATIENTS WITH SUPPURATIVE AND NECROTIC COMPLICATIONS

Abstract


Aim of the study. Neutrophil extracellular traps (NETs) have been reported to participate in many pathological processes, which points at NET concentration in blood as an important indicator of the body condition. When studying NETs, their blood concentration is usually evaluated indirectly, which has a number of shortcomings. We aimed to measure directly the amount of NETs as integral structures, using blood smears as a most suitable tool for clinical practice, and to carry out measurements of NET levels in blood of type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients with necrotic suppurative complications to elucidate the usefulness of this assay. Materials and methods of the research. NETs were quantified by counting in standardized blood smears stained with Romanovsky dyes. Results. The mean level of circulating NETs in the blood of patients was higher than that in healthy subjects. Blood NET concentration in healthy persons and patients with high levels of NETs increased as glycated hemoglobin (HbA1c) concentration increased in the blood. In other patients, NET concentration decreased as HbAlc increased. Elevated NET levels and a direct correlation between NETs and HbAlc were observed in patients with phlegmon, large-area infected wound, lower leg gangrene, suppurative mediastinitis. In other patients, the prevailing lesions were infected wounds, abscesses, finger gangrene. Conclusion. This pilot study demonstrated the usefulness of measurement (using blood smear) of circulating NET concentration in the blood as a clinical parameter that would help to estimate patient’s condition, to predict the duration of post-surgical wound healing and the probability of complications in the form of thrombosis in T2DM.

Введение. Нейтрофильные внекле20чные ло-В3шки (НВЛ) средс2авляю2 co6oL се2есодобные структуры, выбрасываемые ак2ивированными нейтрофилами во внекле20чное срос2ранс2во и сос20ящие из деконденсированного хрома2ина с включенными в него гис2онами и различными ан2имикробными белками гран3л, 2акими как миелосероксидаза (МПО), элас2аза, лактофер-рин. Не2оз - сроцесс сpoгpaммиpземoL кле-20чнoL гибели, coсpoвoждaющиLcя выбросом НВЛ, являе2ся важным звеном в осзщес2влении неL2po-илaми aн2имикpoбнoL -знкции [1-3]. С дpзгoL с2ороны, чрезмерная сродзкция НВЛ може2 сриводи2ь к разви2ию воссали2ельных сроцессов и ссособс2вова2ь са2ологическим со-с2ояниям [4, 5]. В связи с э2им возник ин2ерес к измерению НВЛ в крови или др3гих 2кан х как важного клинического соказа2еля. В настоящее время при клинических исследованиях для оценки количества НВЛ в крови чаще всего регистрируют суррогатные маркеры, такие как внеклеточная ДНК, концентрация комплексов нейтрофильная эластаза-ДНК и др., а также используют выделенные нейтрофилы для оценки способности генерировать НВЛ [6]. Однако приведенные параметры лишь косвенно оценивают реальное количество НВЛ, циркулирующих в крови в данное время. Это связано с тем, что концентрация суррогатных маркеров, определяемая с помощью регистрации составных компонентов НВЛ, зависит от способности ДНКазы1 расщепл ть НВЛ в крови. Кроме того, патогенетическое значение составных компонентов НВЛ и самих НВЛ различно. Так, МПО принимает участие в окислительном/га-логенирующем стрессе, нейтрофильная эластаза может быть причиной «протеазного шторма», гистоны обладают пря мым токсическим действием на ткани и органы [7, 8]. О ценка способности выделенных нейтрофилов генерировать НВЛ in vitro мало соотносится с реальными процессами в крови, поскольку при выделении нейтрофилов часть клеток теряется, удаляются белки и клетки, несущие на поверхности паттерн сиаловых кислот, тормозящий активацию нейтрофилов [9]. Сказанное выше затрудн ет интерпретацию данных, получаемых с помощью выше описанных подходов. В св зи с этим чрезвычайно актуальным вл етс оценка количества непосредственно тех структур, которые получили название НВЛ. В р де исследований было показано, что количественный анализ НВЛ можно проводить на мазках крови [10-14]. Мы попытались провести предварительное исследование, направленное на выявление принципиальной возможности исполь-зовани мазков крови дл определени концентрации в ней НВЛ с целью дополнительной оценки активации клеточного звена врожденного иммунитета и тяжести состояния больных на примере сахарного диабета 2-го типа (СД2) с гнойно-некротическими осложнениями. СД2 ассоциируется с хроническим воспалением низкой интенсивности, в основе которого ответ врожденной системы иммунитета [15, 16]. НВЛ могут повреждать эндотелий сосудов и ткани, усилива воспаление и станов сь активным звеном патогенетических механизмов [17]. Цель исследования: выяснить целесообразность оценки количества циркулирующих в крови НВЛ с использованием мазков крови как клинического показател у пациентов с СД2 с гнойнонекротическими осложнениями. Материалы и методы исследования. В исследовании, одобренном локальным этическим комитетом, участвовали здоровые добровольцы (n=17) и пациенты с диагнозом СД2 (n=26), проходившие лечение в Центре гнойной хирургии и регенераторных технологий ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России. От больных и здоровых лиц было получено информированное согласие на участие в исследовании и заборе крови дл анализов. Венозную кровь забирали в вакутейнеры с натри цитратом. В клинической лаборатории проводили общий и биохимический анализы крови, в том числе определяли уровень гликированного гемоглобина (HbA1c), базовый уровень глюкозы, креатинин, мочевину, билирубин, активность аспартатаминотрансферазы и аланинаминотранс-феразы. Сразу после вз ти крови готовили стандартизированные мазки. Характеристика участников исследования. Данные представлены в виде медианы, в скобках указаны минимальное и максимальное значения Показатель Здоровые добровольцы Пациенты (сахарный диабет 2-го типа) Мужчины 5 14 NT/’ Женщины 12 12 Возраст, годы 57 (44-67) 61,5 (44-77) НЬА1с , % 5,8 (5,1-6,5) 8,1 (6,2-11,7)** БУГ, ммоль / л 5,2 (4,7-6,6) 9,6 (5,6-25,0)** Креатинин , мкмоль/л 92 (78-115) 115 (71-355)* Мочевина, ммоль/л 5,3 (3,5-6,6) 7,7 (2,7-28,6)* Билирубин, мкмоль/л 6,5 (4,7-19,3) 10,1 (2,7-27,3) АсАТ, МЕ/л 21,1 (13,8-39,8) 22 4 (13,4-54,2) АлАТ, МЕ/л 21,8 (10,5-37,5) 23,0 (11,4-78,5) Лейкоциты / мкл крови 6300 (3670-7750) 8550 (5400-24450)* Примечание. НЬА1с - гликированный гемоглобин; БУГ - базовый уровень глюкозы; АсАТ - аспартатамино-трансфераза; АлАТ - аланинаминотрансфераза. Концентрацию НВЛ в крови определяли в соответствии с предложенным нами методом [14]. Мазки крови окрашивали по Романовскому. В средней трети мазков подсчитывали соотношение между количеством лейкоцитов и НВЛ. Пр и этом подсчитывали 300-500 лейкоцитов. При расчете концентрации НВЛ в крови (число НВЛ в 1 мкл крови) дополнительно использовали данные о количестве лейкоцитов в 1 мкл крови, которые были получены при проведении клинического анализа крови. Для подсчета клеток на мазках использовали микроскоп Motic B3 (Motic Asisa, Hong Kong). Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ STATISTICA 6.0. Результаты и их обсуждение. В исследовании прин ли участие 17 здоровых добровольцев и 26 пациентов с СД2 с гнойно-некротическими осложнениями в виде флегмон различной локализации, гангрены пальцев и голени. О выраженной воспалительной реакции в группе пациентов свидетельствовало повышение содержания лейкоцитов в крови, при этом достоверно увеличивалось содержание мочевины и креатинина (таблица). Та блица Качественный анализ полученных мазков показал, что форма и размеры НВЛ, а также их контакты с клетками крови в группе здоровых добровольцев и у пациентов с СД2 визуально не отличаются. На рис. 1 представлены типичные НВЛ, встречающиеся как у здоровых лиц, так и у пациентов с СД2. Рис. 1. Типичные нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ) на мазках крови, полученных от пациентов с сахарным диабетом 2-го типа. Окраска по Романовскому. Длина маркера на фотография х 10 мкм. 1 - НВЛ, 2 - эритроциты; а - НВЛ, лежащая свободно между клетками; б - НВЛ, контактирующая с эритроцитами. Концентраци НВЛ у пациентов в среднем в 1,7 раза превышала таковую для здоровых добровольцев (р<0,05) (рис. 2). *р<0,05; **р<0,01 относительно группы здоровых добровольцев (по критерию Манна-Уитни). Рис. 2. Концентрация нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) в крови здоровых добровольцев и пациентов с сахарным диабетом 2-го типа с гнойно-некротическими осложнениями. Горизонтальными отрезками отмечена медиана. *р<0,05 по сравнению со здоровыми добровольцами по критерию Манна-Уитни. При сопоставлении содержания HbAlc и содержания НВЛ в крови у здоровых людей между этими показателями выявилась достоверная положительная корреляция. Эти данные представлены в виде темных треугольников на рис. 3. Коэффициент коррел ции дл них составил г=0,84, р<0,001. При о бъединении данных для здоровых добровольцев и пациентов обнаружилось, что у части пациентов зависимость между НВЛ и HbAlc имела тот же характер (светлые треугольники на рис. 3), что и у здоровых добровольцев. Дл данных, полученных у этой части пациентов, коэффициент коррел ции равнялся г=0,93, р<0,05. Как видно из рис. 3, для этих пациентов характерно относительно высокое содержание НВЛ в крови. Дл остальных пациентов зависимость была обратной, и с ростом HbA1c концентраци НВЛ в крови снижалась (г = - 0,70, р<0,05; светлые ромбы на рис. 3). При этом у этих пациентов значени концентрации НВЛ располагались в диапазоне, наблюдаемом у здоровых добровольцев. Рис. 3. Корреляции между концентрацией нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) и содержанием гликиро-ванного гемоглобина (HbAle) в крови здоровых добровольцев и пациентов с сахарным диабетом 2-го типа с гнойно-некротическими осложнениями. Линии тренда: сплошная линия - корреляция для здоровых добровольцев (темные треугольники) и пациентов с высокой концентрацией НВЛ (светлые треугольники); пунктирна лини - коррел ци дл пациентов с концентрацией НВЛ, соответствующей уровню НВЛ у здоровых добровольцев (светлые ромбы). Однозначной зависимости между базовым уровнем глюкозы и концентрацией НВЛ не наблюдали ни у здоровых лиц (г=0,2; р>0,05), ни у пациентов (г=-0,14; р>0,05). На основании полученных данных можно предположить, что ответная реакция нейтрофилов в виде нетоза при развитии осложнений СД2 может происходить по двум сценария м. В рамках первого сценария скорость образования НВЛ будет превышать скорость их деградации и элиминации (светлые треугольники на рис. 3). При втором сценарии скорость деградации и элиминации НВЛ будет преобладать над скоростью их образования (светлые ромбы на рис. 3). Природа таких механизмов пока неясна. Небольшой объем выборки не позволяет однозначно утверждать, что высокая концентрация НВЛ способствует (или сопутствует) развитию гнойно-некротических осложнений. Однако следует отметить, что высокий уровень содержания НВЛ и его положительная корреляция с HbAlc наблюдались у пациентов с флегмоной, обширной инфицированной раной, гангреной голени, гнойным медиастенитом. У остальной части пациентов преобладали инфицированные раны, абсцессы, гангрена пальца. В качестве примера рассмотрим типичную историю болезни пациента с высоким уровнем НВЛ в крови (1409 НВЛ/мкл). Больная Т., 61 год. Диагноз. Сахарный диабет 2-го типа в течение 15 лет. Индивидуальный целевой уровень гл икированного гемоглобина - 7,5%. Гликемия натощак - 7,5 ммоль/л, после еды - 10 ммоль/л. Диабетическа дистальна полинейро-пати 3-й стадии, диабетическа макро- и микроан-гиопатия, диабетическая нефропатия (хроническая болезнь почек, стадия 3б). Синдром диабетической стопы нейроишемической формы, обширная гнилостно-некротическая флегмона правой стопы. Ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения 2-го функционального класса. Атеросклеротический кардиосклероз. Стенозирующий атеросклероз артерий нижних конечностей. Остаточные явления перенесенного острого нарушени мозгового крово-обращени . Гипертоническа болезнь 2-й степени. Артериальная гипертензия 2-й степени, риск 4. Ожирение 1-й степени. Состояние при поступлении средней степени тяжести. Лечение. Выполнены операции: вскрытие флегмоны, хирургическая обработка гнойного очага (12*5 см) правой стопы, экзартикул ци первого пальца и 1-й плюсневой кости правой стопы. Проведена системна антибактериальна терапи с учетом чувствительности выделенной микрофлоры и ПЦР исследовани генов резистентности. Проводилась реологическа и фле-ботропна терапи , коррекци гликемии, местное лечение с использованием инновационных перев -зочных средств в виде вакуумной системы закрыти ран (Vacuum-assisted closure - VAC). Результат лечения. Выраженный клинический эффект в виде купировани болевого синдрома, уменьшени в размере раны стопы до 7 *3 см, активное развитие гранул ционной ткани в центре, эпителизаци с краев раны подошвенной части стопы. Время нахождения в стационаре составило 31 койко-день. Иная картина наблюдалась у пациента с низким уровнем НВЛ в крови (319 НВЛ/мкл). Больной Р., 61 год. Диагноз. Сахарный диабет 2-го типа в течение 10 лет. Индивидуальный целевой уровень гликированного гемоглобина - 8%. Гликемия натощак - 8,0 ммоль/л, после еды - 11 ммоль/л. Диабетическая дистальная полинейропати , диабетическа макро- и микро-ангиопатия, диабетическая нефропатия, множественные инфицированные раны (2*1 см) правой голени. Состояние при поступлении удовлетворительное. Лечение. Больному проведена системная антибактериальна терапи с учетом чувствительности выделенной микрофлоры и ПЦР исследования генов резистентности. Проводилась реоло-гическа и флеботропна терапи , коррекци гликемии, местное лечение с использованием VAC. Результат лечения. Выраженный клинический эффект в виде купирования болевого синдрома, полной эпителизации раневых дефектов. Время нахождения в стационаре составило 14 койко-дней. Выводы и заключение. Проведенное исследование показало, что в контрольной группе (здоровые добровольцы) между концентрация ми в крови НВЛ и H ЬА1с имеетс пр ма достоверна корреляция. Эти предварительные данные позволяют предположить, что увеличение длительности гипергликемии может привести к системной активации нейтрофилов, котора про вл етс образованием НВЛ. Увеличение количества НВЛ в циркулирующей крови может вызвать формирование тромбов, а это повышает вероятность развития таких осложнений, как инфаркт и инсульт. Полученные данные о содержании НВЛ в крови пациентов с СД2 с гнойными осложнения ми показали, что высокий уровень НВЛ ассоциирован с тя же-лым течением процесса и длительным нахождением в стационаре. Можно предположить, что концентрация НВЛ в крови пациентов при поступлении может быть дополнительным критерием тя жести состоя ния, указывать на возможное долгое заживление послеоперационных ран и свидетельствовать о высокой вероятности развития осложнений в виде тромбозов. В связи с этим кажется целесообразным использовать концентрацию НВЛ в крови в качестве прогностического критери дл дополнительной оценки тяжести состояния, предсказания длительности заживления послеоперационных ран и вероятности развития осложнений в виде тромбозов. Работа выполнена при поддержке Федерального медико-биологического агентства в рамках государственного заказа, шифр темы «Воспаление».

D I Maximov

FSBI «Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency»

L Yu Basyreva

FSBI «Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency»

A A Gusev

FSBI «Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency»

T V Vakhrusheva

FSBI «Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency»

A V Yaskevich

FSBI «Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency»

S A Gusev

FSBI «Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency»

E M Ostrovsky

FSBI «Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency»

O M Panasenko

FSBI «Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency»

V I Sergienko

FSBI «Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency»

  1. Brinkmann V., Reichard U, Goosmann C, Fauler B, Uhlemann Y, Weiss D.S., Weinrauch Y., Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps kill bacteria // Science. 2004. Vol. 303, No 5663. P. 1532-1535.
  2. Brinkmann V, Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin // J. Cell Biol. 2012. Vol. 198, No 5. P. 773-783.
  3. Marin-Esteban V., Turbica I., Dufour G., Semiramoth N, Gleizes A, Gorges R. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells // Infect. Immun. 2012. Vol. 80, No 5. P. 1891-1899.
  4. Delgado-Rizo V., Martnnez-Guzman M.A., Idguez-Gutierrez L, Garcna-Orozco A., Alvarado-Navarro A., Fafutis-Morris M. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: an overview // Front. Immunol. 2017. Vol. 8. P. 81.
  5. Simon D., Simon H.U., Yousefi S. Extracellular DNA traps in allergic, infectious, and autoimmune diseases // Allergy. 2013. Vol. 68, No 4. P. 409-416.
  6. Perez-Sanchez C, Ruiz-Limyn P, Aguirre M.A., Jimenez-Gymez Y, Arias-de la Rosa I., Abalos-Aguilera M.C., Rodriguez-Ariza A, Castro-Villegas M.C., Ortega-Castro R., Segui P., Martinez C., Gonzalez-Conejero R., Rodrnguez-Lypez S., Gonzalez-Reyes J.A., Villalba J.M., Collantes-Estevez E., Escudero A., Barbarroja N., Lypez-Pedrera C. Diagnostic potential of NETosis-derived products for disease activity, atherosclerosis and therapeutic effectiveness in Rheumatoid Arthritis patients // J. Autoimmun. 2017. Vol. 82. P. 31-40.
  7. Silk E., Zhao H., Weng H., Ma D. The role of extracellular histone in organ injury // Cell Death Dis. 2017. Vol. 8. Р. 2812.
  8. Fuchs T.A., Brill A, Duerschmied D., Schaizberg D., Monestier M., Myers D.D.Jr., Wrobleski S.K., Wakefield T.W., Hartwig J.H., Wagner D.D. Extracellular DNA traps promote thrombosis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010. Vol. 107, No 36. P. 15880-15885.
  9. Lizcano A., Secundino I., Dyhrmann S., Corriden R., Rohena C., Diaz S., Ghosh P., Deng L., Nizet V., Varki A. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation // Blood. 2017. Vol. 129, No 23. P. 3100-3110.
  10. Hamaguchi S., Hirose T., Akeda Y, Matsumoto N., Irisawa T, Seki M, Hosotsubo H., Tasaki O., Oishi K, Shimazu T, Tomono K. Identification of neutrophil extracellular traps in the blood of patients with systemic inflammatory response syndrome // J. Int. Med. Res. 2013. Vol. 41, No 1. P. 162-168.
  11. Beiter T, Fragasso A, Hudemann J., Schild M, Steinacker J., Mooren F.C., Niess A.M. Neutrophils release extracellular DNA traps in response to exercise // J. Appl. Physiol. 2014. Vol. 117, No 3. P. 325-333.
  12. Hirose T, Hamaguchi S, Matsumoto N, Irisawa T, Seki M, Tasaki O, Hosotsubo H, Yamamoto N, Yamamoto K, Akeda Y, Oishi K, Tomono K, Shimazu T. Presence of Neutrophil Extracellular Traps and Citrullinated Histone H3 in the Bloodstream of Critically ill Patients // PLoS One. 2014. Vol. 9, No 11. e111755.
  13. Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Нейтрофильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М.: Изд-во РАМН, 2009. 203 с. [Dolgushin I.I., Andreeva Yu.S., Savochkina A.Yu. Neutrophil extracellular traps and methods to assess the functional state of neutrophils. Moscow: Izdatel’stvo RAMS, 2009. 203 p.]
  14. Basyreva L.Y, Brodsky I.B., Gusev A.A., Zhapparova O.N., Mikhalchik E.V, Gusev S.A., Shor D.B., Dahan S, Blank M, Shoenfeld Y. The effect of intravenous immunoglobulin (IVIG) on ex vivo activation of human leukocytes // Hum. Antibodies. 2016. Vol. 24, No 3-4. P. 39-44.
  15. Wellen K.E., Hotamisligil G.S. Inflammation, stress, and diabetes // J. Clin. Invest. 2005. Vol. 115, No 5. P. 1115-1119.
  16. Fernandez-Real J.M., Pickup J.C. Innate immunity, insulin resistance and type 2 diabetes // Diabetologia. 2012. Vol. 55, No 2. P. 273-278.
  17. Villanueva E, Yalavarthi S, Berthier C.C., Hodgin J.B., Khandpur R, Lin A.M., Rubin C.J., Zhao W., Olsen S.H., Klinker M, Shealy D, Denny M.F., Plumas J., Chaperot L, Kretzler M, Bruce A.T., Kaplan M.J. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus // J. Immunol. 2011. Vol. 187, No 1. P. 538-552.

Views

Abstract - 115

PDF (Russian) - 2

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Maximov D.I., Basyreva L.Y., Gusev A.A., Vakhrusheva T.V., Yaskevich A.V., Gusev S.A., Ostrovsky E.M., Panasenko O.M., Sergienko V.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies