Immunohistochemical method of simultaneous detection of neurons and astrocytes in the rat brain

Abstract


This study aimed to develop a method of simultaneous immunohistochemical detection of neurons and astrocytes using peroxidase labeling with subsequent analysis by light microscopy. A pair of antigens, each of which specifically identifies either neurons or astrocytes, was chosen (as markers neuronal nuclear antigen and glial fibrillary acidic protein were used, respectively). This method not only identifies the studied cells, but it also assesses their functional state under normal and pathological conditions. The proposed staining protocol allows significant simplification and optimization to simultaneously detect two antigens and to improve the quality of the slices obtained.

Введение В настоящее время нередко возникает необходимость в выявлении одновременно нескольких антигенов на одном препарате для визуализации различных популяций клеток в ткани или оценки колокализации двух антигенов. Как правило, для решения этих задач применяют методы флуоресцентной микроскопии [1, 2], однако они весьма дорогостоящие и требуют обработки препаратов по длительному протоколу. Более быстрым и дешевом методом является метод иммуногистохимии (ИГХ) с применением ферментных меток с последующим анализом при помощи микроскопии в проходящем свете. В этом случае одновременная визуализация двух антигенов может осуществляться несколькими способами: с использованием первичных антител разной видовой принадлежности и вторичных антител, конъюгированных с различными ферментными метками, или с использованием первичных антител одной видовой принадлежности и вторичных антител, конъюгированных только с одной ферментной меткой (как правило, пероксидазной) [3]. Однако в последнем варианте обработка каждым реагентом идет последовательно, что значительно увеличивает время постановки реакций и усложняет процесс окраски. В настоящее время как в лабораторных исследованиях, так и в рутинных диагностических мероприятиях все более сильно ощущается потребность в стандартизированных протоколах, которые были бы просты в применении, но при этом не теряли своей информативности. При ИГХ-исследовании нервной ткани, а именно нейрон-астроцитарных взаимодействий, возможно использование такой пары антигенов, которые специфически выявляют определенный тип клеток (нейроны или астроциты) и при этом никогда не колокализуются. Например, такой парой могли бы послужить ядерный белок нервных клеток NeuN [4, 5] и белок промежуточных филаментов III типа - глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), который является маркером астроцитов [6-8]. Особенность этих маркеров заключается также в том, что они отражают функциональное состояние исследуемых клеток. Цель настоящего исследования состояла в разработке адаптированного протокола одновременного иммуногистохимического выявления нейронов и астроцитов в головном мозге крысы. Материалы и методы Исследовали головной мозг крыс-самцов линии Вистар (n = 9). Часть материала фиксировали в 4 % параформальдегиде (n = 5), другую часть - в цинк-этанол-формальдегиде (n = 4), специальном фиксаторе, который обеспечивает высокую сохранность антигенных детерминант [9]. Обезвоживание и заливку в парафин осуществляли по общепринятой методике. Изготавливали фронтальные срезы толщиной 5 и 10 мкм на уровне +1,2…+0,7 мм по брегме [10]. Часть препаратов окрашивали толуидиновым синим по методу Ниссля для исследования состояния клеток нервной ткани [11], другая часть предназначалась для иммуногистохимического окрашивания. При иммуногистохимическом выявлении нейронов и астроцитов использовали антитела к ядерному белку нервных клеток (NeuN) и глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP). Действовали в соответствии со следующим протоколом окраски: 1) удаляли парафин и регидратировали срезы обычным способом [12]; 2) после пятиминутной промывки в дистиллированной воде срезы подвергали тепловому демаскированию (99,5 °С, в пароварке) в цитратном буфере S1700 (Dako, Дания) в течение 20 мин; 3) остывшие предметные стекла со срезами промывали дистиллированной водой и помещали в стакан с 3 % пероксидом водорода на 10 мин; 4) смывали пероксид водорода со срезов дистиллированной водой и помещали их в 0,01М фосфатно-солевой буфер (PBS) с pH 7,4 на 5-7 минут; 5) промокнув фильтровальной бумагой стекло вокруг срезов (для образования сухого поля), обводили срезы гидрофобным фломастером (Liquid Blocker, PAP Pen, Dako Pen), наносили необходимое для покрытия срезов количество блокировочного раствора Protein block (Spring Bioscience, США) на срезы и оставляли при комнатной температуре на 10 минут; 6) сливали излишек блокировочного раствора, не промывая препараты, наносили смесь мышиных моноклональных антител к NeuN (клон A60) в разведении 1 : 400 (Chemicon, США) и мышиных моноклональных антител к GFAP (клон GA5) в разведении производителя (Monosan, Нидерланды) в соотношении 1 : 1. Помещали срезы во влажную камеру и инкубировали при 27,5 °С в течение 4 суток; 7) смывали антитела PBS и затем помещали в свежую порцию буфера на 5-7 минут; 8) на срезы наносили необходимое количество реагента из набора MACH 2 Universal HRP Polymer Kit for mouse and rabbit (Biocare Medical, США) и инкубировали при 27,5 °С в течение 35 минут; 9) смывали реагент со срезов и оставляли препараты в PBS на 5 минут; 10) удаляли со срезов избыток PBS фильтровальной бумагой и наносили на срезы необходимое количество реагента из набора DAB+ (Dako, Дания). В течение 1-3 минут происходило образование окрашенного продукта гистохимической реакции. Данную реакцию необходимо было контролировать под микроскопом и остановить до появления окрашенного фона, смывая раствор хромогена 3 % пероксидом водорода; 11) промывали препараты в 2-3 порциях дистиллированной воды по 3-5 минут в каждой; 12) обезвоживали препараты в спиртах восходящей концентрации, просветляли в ксилолах и заключали препараты в перманентную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США) обычным способом [12]. Полученные препараты анализировали с помощью светового микроскопа Leica DM750 (Германия) и фотографировали с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия). Изображения обрабатывали в программе LAS EZ (Leica, Германия). Результаты и обсуждение Часто для общей оценки состояния ткани как в научных исследованиях, так и при гистопатологической диагностике прибегают к гистологической окраске, в частности, для изучения нервной ткани общепринятой является окраска нервных клеток по Нисслю. При анализе препаратов, окрашенных толуидиновым синим по методу Ниссля, в нейронах выявляли хроматофильную субстанцию, интенсивно окрашенную в синий цвет. Ядра нейронов, светлые и крупные, округлой или овальной формы, содержали, как правило, одно ядрышко. Встречались единичные гиперхромные (сморщенные) нейроны. Также помимо нейронов идентифицировались ядра глиальных клеток и эндотелиоцитов сосудов (рис. 1, а). Окраска по Нисслю - это простой и информативный метод для оценки функционального состояния нейронов, который не теряет своей актуальности и в настоящее время. Однако данная методика не позволяет определить тип глиальных клеток и оценить реакцию всех компонентов нервной ткани (в частности, макро- и микроглии, сосудов головного мозга) на то или иное воздействие или повреждение. Иммуногистохимия представляет собой альтернативный метод, с помощью которого можно обнаружить одновременно несколько антигенов. Несмотря на то что это более совершенный и чувствительный метод оценки состояния ткани по сравнению с классическими гистологическими окрасками, он является дорогостоящим и трудоемким. Упростить и удешевить процесс обработки препаратов при иммуногистохимическом окрашивании можно путем подбора такой пары антигенов, которые специфически выявляют определенный тип клеток, при этом никогда не колокализуются. Данный способ позволяет одновременно наносить на препарат оба первичных антитела одной видовой принадлежности и обрабатывать их одними вторичными антителами, меченными одной ферментной меткой, с последующей визуализацией с помощью диаминобензидина, что значительно сокращает и упрощает процесс обработки препаратов. В данной работе в качестве такой пары был выбран нейронспецифический маркер - NeuN и маркер астроцитов - GFAP. С помощью такой комбинации антител возможно оценить не только наличие нескольких типов клеток в нервной ткани, но и их функциональное состояние. Иммуногистохимическая реакция на NeuN является одним из современных методов оценки функционального состояния нейронов, который получил широкое распространение при различных экспериментальных исследованиях (ишемия, гипоксия, токсическое воздействие на головной мозг) и при патоморфологических исследованиях, что связано с быстрым катаболизмом белка NeuN [13]. Реакция астроглиальных клеток наблюдается практически при всех патологических состояниях ЦНС, что приводит к увеличению экспрессии GFAP и к изменению морфологии астроцитов (наблюдаются пролиферация и гипертрофия астроцитов) [14]. Кроме того, интенсивность экспрессии GFAP зависит от дозы и длительности воздействия патологических факторов [15, 16]. В качестве контроля иммуногистохимической реакции провели окраску препаратов отдельно каждым исследуемым антителом. В результате на всех исследуемых препаратах наблюдали высокую специфичность ИГХ-реакции и отсутствие фона (рис. 1, б, в), что выступает необходимым условием для проведения дальнейшего двойного иммуногистохимического окрашивания. При анализе иммуногистохимически окрашенных препаратов реакция на NeuN в нейронах поясной извилины была неравномерной. В подавляющем большинстве нейронов наблюдалась высокоинтенсивная реакция на NeuN. Продукт реакции локализовался как в ядрах, так и в телах нейронов, при этом интенсивность реакции в ядрах была более высокой по сравнению с телами нервных клеток (рис. 1, в, г). В единичных клетках отмечалась слабая реакция на данный белок. В дендритах и аксонах нервных клеток реакция отсутствовала. В области поясной извилины ИГХ-реакция на GFAP наблюдалась в телах и отростках протоплазматических астроцитов. Тела астроцитов некрупные с ветвящимися, длинными и тонкими отростками (рис. 1, г, д). Поскольку эти клетки участвуют в формировании периваскулярной глиальной пограничной мембраны, ИГХ-реакция на GFAP, помимо астроцитов, выявляет также и контуры сосудов головного мозга (рис. 1, г, е). Таким образом, двойная ИГХ-реакция на NeuN и GFAP позволяет одновременно визуализировать нейроны, астроциты и кровеносные сосуды головного мозга. Кроме того, использование именно этой пары антигенов удобно еще и потому, что можно получить дополнительную информацию не только количественного (число иммунопозитивных клеток), но и качественного (степень реакции клеток на повреждение) характера. Стоит отметить, что долгая инкубация в первичных антителах (4 суток) имеет ряд преимуществ. Во-первых, это позволяет разбить процесс окраски на два относительно коротких этапа: первый этап включает пункты с 1-го по 6-й предложенного протокола окраски, а второй - с 7-го по 12-й. Это дает возможность проводить первый этап, например, перед выходными или праздничными днями и уже затем приступать ко второму этапу обработки препаратов, что значительно сокращает трудозатраты и потерю времени и оптимизирует процесс окраски. Во-вторых, повышается качество самих препаратов, так как при долгой обработке препаратов в первичных антителах возникает необходимость снижать температуру инкубации, и это способствует лучшему удержанию срезов на стеклах, в отличие от инкубации при более высоких температурах. Также необходимо учитывать, что в предложенном протоколе демаскирование антигенов происходит в щадящем режиме - варка препаратов занимает 20 минут, что тоже способствует сохранению срезов в процессе обработки. Помимо этого в постановке ИГХ-реакции важным аспектом является фиксация материала и сохранность тканевых антигенов. В настоящем исследовании сравнивали две фиксирующие жидкости - 4 % параформальдегид (ПФА) и цинк-этанол-формальдегид (ЦЭФ). При анализе материала, фиксированного в 4 % ПФА и окрашенного иммуногистохимически на NeuN и GFAP, было установлено, что реакция на NeuN значительно слабее по сравнению с GFAP, в то время как материал, фиксированный в ЦЭФ, дает одинаково интенсивную реакцию на оба антигена, что говорит о большей эффективности данного фиксатора по сравнению с ПФА для ИГХ-исследования. Высокая сохранность антигенных детерминант была показана при сравнении ЦЭФ и с другими фиксаторами (10 % формалин, 96 % этанол, жидкость Буэна). Кроме того, было продемонстрировано, что использование ЦЭФ для определенных антигенов позволяет избежать процедуры теплового демаскирования антигенов, что дает возможность упростить и сократить протокол обработки препаратов [9]. Таким образом, фиксация материала в ЦЭФ значительно повышает чувствительность и эффективность иммуногистохимического метода. Заключение В работе рассмотрен новый способ иммуногистохимического определения двух антигенов (NeuN и GFAP) при помощи пероксидазной метки, который позволяет одновременно выявлять нейроны, астроциты и кровеносные сосуды. Эта методика значительно упрощает процесс обнаружения одновременно двух антигенов на препарате и способствует оптимизации процесса окрашивания и повышению качества получаемых препаратов. Кроме того, данное окрашивание дает возможность оценивать функциональное состояние нейронов и астроцитов и степень повреждения нервной ткани в ответ на патологическое воздействие, что можно использовать в гистологической практике. При сравнении материала, фиксированного в двух разных фиксаторах (4 % ПФА и ЦЭФ), было показано, что ЦЭФ повышал чувствительность и эффективность реакции, в связи с чем данный фиксатор может быть рекомендован для проведения иммуногистохимического окрашивания. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 18-315-00134.

Yu A Kalinina

Institute of Experimental Medicine; Trans-Technologies, Ltd

D A Sufieva

Institute of Experimental Medicine; Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry Russian Academy of Sciences

  1. Romijn HJ, van Uum JF, Breedijk I, et al. Double immunolabeling of neuropeptides in the human hypothalamus as analyzed by confocal laser scanning fluorescence microscopy. J Histochem Cytochem. 1999;47(2):229-236. doi: 10.1177/002215549904700211.
  2. Schulze W, Hayata-Takano A, Kamo T, et al. Simultaneous neuron- and astrocyte-specific fluorescent marking. Biochem Biophys Res Commun. 2015;459(1):81-86. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.02.073.
  3. Гиляров А.В., Кирик О.В., Коржевский Д.Э. Сравнительный анализ методологических подходов, применяемых для одновременного выявления нескольких антигенов при иммуногистохимическом исследовании // Морфология. - 2010. - Т. 138. - № 5. - С. 59-64. [Gilyarov AV, Kirik OV, Korzhevskii DE. Comparative analysis of methodological approaches applied for the simultaneous demonstration of several antigens in immunohistochemical studies. Morfologiia. 2010;138(5):59-64. (In Russ.)]
  4. Duan W, Zhang YP, Hou Z, et al. Novel Insights into NeuN: from Neuronal Marker to Splicing Regulator. Mol Neurobiol. 2016;53(3):1637-1647. doi: 10.1007/s12035-015-9122-5.
  5. Сухорукова Е.Г., Кирик О.В., Зеленкова Н.М., Коржевский Д.Э. Нейрональный ядерный антиген NeuN - показатель сохранности нервной ткани и пригодности ее для иммуногистохимического исследования // Медицинский академический журнал. - 2015. - Т. 15. - № 1. - С. 63-67. [Sukhorukova EG, Kirik OV, Zelenkova NM, Korzhevskii DE. Neuronal nuclear antigen NeuN as an indicator of the nervous tissue preservation and suitability for immunocytochemical study. Medical academic journal. 2015;15(1):63-67. (In Russ.)]
  6. Yang Z, Wang KK. Glial fibrillary acidic protein: from intermediate filament assembly and gliosis to neurobiomarker. Trends Neurosci. 2015;38(6):364-374. doi: 10.1016/j.tins.2015.04.003.
  7. Сухорукова Е.Г., Коржевский Д.Э., Алексеева О.С. Глиальный фибриллярный кислый белок - компонент промежуточных филаментов астроцитов мозга позвоночных // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2015. - Т. 51. - № 1. - С. 3-10. [Sukhorukova EG, Korzhevskii DE, Alekseeva OS. Glial fibrillary acidic protein: The component of iintermediate filaments in the vertebrate brain astrocytes. Zh Evol Biokhim Fiziol. 2015;51(1):3-10. (In Russ.)]
  8. Кирик О.В., Суфиева Д.А. GFAP-иммунопозитивные клетки в составе эпендимы III желудочка головного мозга крысы // Медицинский академический журнал. - 2017. - Т. 17. - № 3. - С. 32-37. [Kirik OV, Sufieva DA. GFAP-immunopositive cells among ependymocytes of the third ventricle of the rat brain. Medical academic journal. 2017;17(3):32-37. (In Russ.)]
  9. Korzhevskii DE, Sukhorukova EG, Gilerovich EG, et al. Advantages and Disadvantages of Zinc-Ethanol-Formaldehyde as a Fixative for Immunocytochemical Studies and Confocal Laser Microscopy. Neurosci Behav Physiol. 2014;44(5):542-545. doi: 10.1007/s11055-014-9948-8.
  10. Paxinos G, Watson С. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4rd ed. San Diego: Academic Press; 1998.
  11. Garcia-Cabezas MA, John YJ, Barbas H, Zikopoulos B. Distinction of Neurons, Glia and Endothelial Cells in the Cerebral Cortex: An Algorithm Based on Cytological Features. Front Neuroanat. 2016;10:107. doi: 10.3389/fnana.2016.00107.
  12. Коржевский Д.Э., Гилерович Е.Г., Кирик О.В., и др. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии: руководство / Под ред. Д.Э. Коржевского. - СПб.: СпецЛит, 2013. [Korzhevskii DE, Gilerovich EG, Kirik OV, et al. Morfologicheskaya diagnostika. Podgotovka materiala dlya gistologicheskogo issledovaniya i elektronnoy mikroskopii: rukovodstvo. Ed by D.E. Korzhevskii. Saint Petersburg: SpetsLit; 2013. (In Russ.)]
  13. Гусельникова В.В., Коржевский Д.Э. NeuN - нейрональный ядерный антиген и маркер дифференцировки нервных клеток // Acta Naturae. - 2015. - Т. 7. - № 2. - С. 46-51. [Gusel’nikova VV, Korzhevskiy DE. NeuN as neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 2015;7(2):46-51. (In Russ.)]
  14. Sofroniew MV, Vinters HV. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 2010;119(1):7-35. doi: 10.1007/s00401-009-0619-8.
  15. Коржевский Д.Э, Ленцман М.В., Гиляров А.В., и др. Морфологические проявления локальной функциональной активации астроцитов, вызванной кратковременной общей ишемией головного мозга // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2007. - Т. 43. - № 5. - С. 423-426. [Korzhevskii DE, Gilyarov AV, Otellin VA, et al. Morphological manifestations of local functional activation of astrocytes induced by transient global cerebral ischemia. Zh Evol Biokhim Fiziol. 2007;43(5):423-426. (In Russ.)]
  16. Panickar KS, Norenberg MD. Astrocytes in cerebral ischemic injury: morphological and general considerations. Glia. 2005;50(4):287-298. doi: 10.1002/glia.20181.

Views

Abstract - 120

PDF (Russian) - 1

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Kalinina Y.A., Sufieva D.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies