Proliferative activity of colorectal adenocarcinoma: objectification of criteria of morphological evaluation

Abstract


Aim of the study. To analyze the correlation between proliferative activities determined on the basis of routine histological staining and immunohistochemical reaction to the nuclear antigen Ki-67 in colorectal adenocarcinomas. Methods. Thirty adenocarcinomas of the colon and rectum were retrospectively evaluated. Evaluation of proliferative activity was performed on serial histological preparations stained with hematoxylin and eosin and treated with antibodies to Ki-67. Calculation was carried out in the “hot spots” under four microscope high power fields (≈1 mm2). Results. An estimate of the Kendall rank correlation coefficient demonstrated a high degree of direct relationship between the number of mitoses counted by routine staining and proliferative activity estimated by the immunohistochemical method (τ = 0.708, p < 0.05). All observations on the dispersion diagram could be divided into three “cloud” clusters with similar values for Ki-67 with practically the same number of mitoses. Conclusions. On the basis of routine histological examination, it is possible to separate colorectal carcinomas from tumors with a low (1-2/mm2), moderate (3-5/mm2), and high (≥6/mm2) mitotic activity corresponding to the proliferation index values of Ki-67 <30%, 30%-50%, and >50%, respectively.

Введение Не считая опухолей кожи, рак толстой и прямой кишок (колоректальный рак) - третий по распространенности вид злокачественных новообразований в мире. В структуре смертности населения России от злокачественных новообразований он занимает второе место [1]. В нашей стране каждый год диагностируется более 50 000 новых случаев этого заболевания (за последнее десятилетие XX века смертность от рака толстой кишки только в Москве и Санкт-Петербурге увеличилась на 16 и 18 % соответственно) [2]. В целом пятилетняя выживаемость при колоректальном раке составляет примерно 60 % в развитых странах и менее 40 % - в государствах с ограниченными ресурсами [3]. Из-за поздней диагностики колоректальных карцином, зачастую на III и IV стадиях онкологического процесса [4], большое значение в их лечении приобретают методы консервативной терапии: неоадъювантной и адъювантной. При определении показаний и противопоказаний к консервативной терапии наряду с состоянием микросателлитной стабильности и ряда генных мутаций учитывается и пролиферативная активность опухоли [5]. Пролиферативная активность - одна из главных характеристик, определяющих степень зрелости опухоли, важный предиктор клинического поведения новообразования, его прогноза и ответа на консервативную терапию [6-8]. В последние годы в онкологической клинике широкое распространение получили иммуногистохимические методы фиксации данного феномена, базирующиеся на экспрессии ядерных антигенов пролиферации. Наибольшей популярностью в практике крупных диагностических центров пользуется анализ, основанный на количественной и качественной оценках иммуногистохимической реакции на парафиновых срезах, обработанных антителами к белку Ki-67 - продукту гена MKI67, модулирующего активную фазу клеточного цикла [8, 9]. Однако продолжительность периодов этой фазы различна, и собственно митоз (М-фаза) занимает не столь уж длительное время. Поэтому светооптический подсчет фигур деления демонстрирует меньшие значения, и пролиферативный индекс по Ki-67 значительно превышает таковой, вычисленный при рутинном гистологическом исследовании [10] (рис. 1). Кроме того, при иммуногистохимическом анализе аденокарцином толстой кишки определение пролиферативной активности часто затрудняется наличием интра- и перитуморозного воспалительного и лимфоцитарного инфильтратов, клетки которых демонстрируют интенсивную экспрессию Ki-67, а также свойственных этим опухолям «мусорных некрозов», часто генерирующих артифициальные сигналы. Нельзя не учитывать и распространенные на практике дефекты фиксации операционного материала, искажающие результаты иммуногистохимического анализа. Цель исследования - анализ корреляции пролиферативной активности, определенной на основе рутинной гистологической окраски и иммуногистохимической реакции на ядерный антиген Ki-67, при колоректальных аденокарциномах. Материалы и методы Выполнена ретроспективная оценка 30 аденокарцином ободочной и прямой кишок у пациентов в возрасте 55-74 лет (11 мужчин и 19 женщин), полученных при оперативных вмешательствах на базе Городского клинического онкологического диспансера (Санкт-Петербург). Подсчет делящихся клеток осуществлен на «параллельных» (серийных) гистологических препаратах, изготовленных после парафиновой проводки, окрашенных гематоксилином и эозином и обработанных антителами к Ki-67 (рис. 1). Демаскировку антигена для иммуногистохимического исследования осуществляли в цитратном буфере (pH-9) в течение 30 минут в водяной бане при температуре 98 °C, затем препараты (после остывания) промывали дистиллированной водой. Срезы обводили парафиновым карандашом. Эндогенную пероксидазу ингибировали 3 % раствором пероксида водорода, стекла ополаскивали в промывочном буфере. После этого на срезы наносили первое антитело (Ki-67 клон MIB-1 в разведении 1 : 100): экспозиция - 60 минут при комнатной температуре во влажной камере. Для визуализации реакции применяли полимерную систему EnVision (Dako), в качестве хромогена использовали диаминобензидин, ядра докрашивали гематоксилином Майера. Подсчет митозов и Ki-67-положительных ядер выполняли в предварительно выделенных при обзорной микроскопии «горячих точках», на четыре поля зрения при большом увеличении микроскопа (×40, ≈1 мм2). В каждом случае оценивали не менее 10 полей зрения. При гистологической окраске учитывали только явные митотические фигуры, «сомнительные» (пикнотичные, апоптотические и др.) ядра исключали. Общий массив полученных данных по критерию Шапиро - Уилка (W) был распределен асимметрично (рис. 2), и поэтому для их анализа применен комплекс непараметрических методов. Результаты и их обсуждение Оценка по коэффициенту ранговой корреляции Кендалла продемонстрировала высокую степень прямой связи между числом митозов, подсчитанных при рутинной окраске, и пролиферативной активностью, оцененной иммуногистохимическим методом (t = 0,708, p < 0,05). При построении диаграммы рассеяния установлен нелинейный характер связи, что потребовало логарифмического преобразования модели: Ki-67 = 15,76 + 51,56 · log 10 (n), где n - число делящихся клеток. Коэффициенты корреляции (R) и детерминации (R2) свидетельствовали в пользу высокой предсказательной способности логарифмической модели - способности оценивать реакцию на Ki-67 по числу митозов, определенному при окраске гематоксилином и эозином (табл.). Для облегчения интерпретации результатов исследования все наблюдения на диаграмме рассеяния разделили на три кластера-«облака» с близкими значениями по Ki-67 при практически одинаковом числе митозов. Так, 1-2 митоза на 1 мм2 соответствовали менее чем 30 % пролиферативному индексу, определенному на основе иммуногистохимической реакции; 3-5 митозов на 1 мм2 - 30-50 %; 6 и более митозов на 1 мм2 - более 50 % (рис. 3). Тест Краскела - Уоллиса подтвердил значимость различий между описанными кластерами пролиферативной активности (H = 20, df = 2, p < 0,001). Заключение Оценка пролиферативной активности в колоректальных аденокарциномах на основе иммуногистохимической реакции с антителами к белку Ki-67 имеет ряд недостатков, к которым в первую очередь можно отнести увеличение общего числа меченых ядер за счет пери- и интратуморозной лейкоцитарной реакции, а также свойственных этим опухолям «мусорных некрозов», генерирующих ложноположительные (артифициальные) сигналы. Нельзя не учитывать и возможные аутолитические изменения операционного материала, возникающие при нарушении режима фиксации и резко снижающие эффективность иммуногистохимического исследования. Кроме того, иммуногистохимия доступна далеко не во всех патоморфологических лабораториях лечебно-профилактических учреждений России и постановка иммуногистохимических реакций увеличивает стоимость диагностического процесса. На основании рутинного гистологического исследования представляется возможным разделить колоректальные карциномы на опухоли с низкой (1-2/мм2), умеренной (3-5/мм2) и высокой (≥ 6/мм2) митотической активностью (соответствующей значениям индекса пролиферации по Ki-67 < 30 %, 30-50 % и >50 %), что поможет в клинике объективизировать критерии дифференцировки этих новообразований, уменьшить сроки патологоанатомического анализа биопсийного и операционного материала и снизить общую стоимость диагностических процедур.

D P Kovtun

City Clinical Oncology Center; North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

N M Anichkov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

O G Polushin

City Clinical Oncology Center

E V Ponomaryeva

City Clinical Oncology Center

A I Lyubimov

S.M. Kirov Military Medical Academy

E Yu Kalinina

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

  1. Давыдов М.И., Аксель Е.М. Смертность населения России и стран СНГ от злокачественных новообразований в 2009 г. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. - 2011. - Т. 22. - № 3 (прил. 1). - С. 93-123. [Davydov MI, Aksel EM. Smertnost’ naseleniya Rossii i stran SNG ot zlokachestvennykh novo-obrazovaniy v 2009 g. Journal of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS. 2011;22(3S1):93-123. (In Russ.)]
  2. Ковальский Г.Б., Юрин А.Г. Опухоли кишечника // Пальцев М.А., Аничков Н.М. Атлас патологии опухолей человека. - М.: Медицина, 2005. - С. 213-231. [Kovalskiy GB, Yurin AG. Opukholi kishechnika. In: Paltsev MA, Anichkov NM. Atlas patologii opukholey cheloveka. Moscow: Meditsina; 2005. P. 213-231. (In Russ.)]
  3. Papapolychroniadis C. Environmental and other risk factors for colorectal carcinogenesis. Tech Coloproctol. 2004;8 Suppl 1:s7-9. doi: 10.1007/s10151-004-0097-x.
  4. Пророков В.В., Николаев А.В., Власов О.А. Хирургическое лечение рака ободочной кишки: анализ отдаленных результатов // Онкологическая колопроктология. - 2012. - № 1. - С. 24-27. [Prorokov VV, Nikolayev AV, Vlasov OA. Surgical treatment of colon cancer: analysis of long-term outcome. Colorectal oncology. 2012;(1):24-27. (In Russ.)]
  5. Bartley AN, Hamilton SR, Alsabeh R, et al. Template for reporting results of biomarker testing of specimens from patients with carcinoma of the colon and rectum. Arch Pathol Lab Med. 2014;138(2):166-170. doi: 10.5858/arpa.2013-0231-CP.
  6. Раскин Г.А., Петров С.В. Низкий уровень пролиферации - неблагоприятный прогностический признак при аденокарциноме толстой кишки // Казанский медицинский журнал. - 2014. - Т. 95. - № 3. - С. 378-382. [Raskin GA, Petrov SV. Low proliferative level is a poor prognostic factor for colon adenocarcinoma. Kazan Med Zh. 2014;95(3):378-382. (In Russ.)]
  7. Hayashi H, Beppu T, Sakamoto Y, et al. Prognostic value of Ki-67 expression in conversion therapy for colorectal liver-limited metastases. Am J Cancer Res. 2015;5(3):1225-1233.
  8. Pap Z, Ilyes IA, Mocan SL, et al. Changes in immunoexpression of p53, Ki-67, Ets-1, APAF-1 and PTEN in serrated and conventional colon adenomas. Rom J Morphol Embryol. 2015;56(4):1389-1396.
  9. Ковтун Д.П., Аничков Н.М., Полушин О.Г., и др. Особенности патологоанатомической диагностики колоректального рака в онкохирургической клинике (обзор литературы) // Поволжский онкологический вестник. - 2018. - № 1. - С. 59-67. [Kovtun DP, Anichkov NM, Polushin OG, et al. The features of pathological diagnosis of colorectal cancer in oncosurgical clinic (review). Povolzhskii onkologicheskii vestnik. 2018;(1):59-67. (In Russ.)]
  10. Kriegsmann M, Warth A. What is better/reliable, mitosis counting or Ki67/MIB1 staining? Transl Lung Cancer Res. 2016;5(5):543-546. doi: 10.21037/tlcr.2016.10.11.

Views

Abstract - 95

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Kovtun D.P., Anichkov N.M., Polushin O.G., Ponomaryeva E.V., Lyubimov A.I., Kalinina E.Y.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies