Localization and activity of recombinant streptavidin in cell fractions of Escherichia coli

Abstract


The authors provide a genetic construct for obtaining recombinant biologically active wild type streptavidin with high yield. Addition of leader peptide and oligohistidine sequence to the streptavidin sequence makes it possible to isolate soluble streptavidin from the culture medium and from the soluble fraction. Temperature conditions for inducing of protein synthesis were found to have a significant effect on the distribution profile of streptavidin between fractions. The obtained protein product is not contaminated with endogenous biotin. The provided method excludes denaturation and renaturation steps which are necessary for isolation of the desired product from inclusion bodies but substantially reduce the yield. Thus, the provided approach allows to increase the yield of biologically highly active strepatividin which is capable of binding biotin and biotin-containing compounds and can be used for various practical purposes.

Введение Функциональный аналог авидина яичного белка стрептавидин (SA) был выделен из бактерий Streptomyces avidinii. Природный SA представляет собой тетрамер, способный прочно связывать четыре молекулы биотина (BT). В настоящее время описано множество рекомбинантных SA, различающихся по способности связывать BT. Способность SA связывать BT с высоким сродством нашла применение для решения многих проблем фундаментальной биологии и медицины, а также широко используется в лабораторной диагностике. Комплекс SA с BT обладает высокой устойчивостью к воздействию органических растворителей, денатурирующих растворов, детергентов (например, додецилсульфат, тритон Х-100), протеолитических ферментов, экстремальных температур и рН [2], что является весьма полезным свойством для решения ряда специальных задач. SA и BT часто служат необходимыми компонентами методик идентификации различных природных соединений. Комплекс SA-BT находит применение в методах иммунопреципитации, в составе транспортных молекул и вирусных векторов, а также для изучения межмолекулярных взаимодействий. В связи с широким использованием SA в современных биохимических методах требуются достаточно большие количества этого белка в активной, способной связывать BT, форме. Поэтому в настоящее время применяются рекомбинантные препараты SA, получаемые из нескольких источников. Известен метод получения рекомбинантного SA дикого типа из телец включения E. coli [1]. Этот препарат эффективно связывает BT. Однако клетки E. coli способны синтезировать собственный BT, необходимый для нормального протекания метаболических процессов. Эндогенный BT E. coli может связываться с получаемым SA, инактивируя его. Для получения активного SA из бактериальной культуры требуются дополнительные стадии денатурации и ренатурации белка. Выделение SA из телец включения предполагает обработку сильными детергентами (гуанидин хлорид или мочевина) и удаление BT. Свободные от BT молекулы SA затем могут быть ренатурированы путем постепенного удаления детергента из раствора. Таким образом, с помощью данных манипуляций можно восстановить активность SA, инактивированного собственным BT клетки. Однако денатурация и ренатурация могут привести к мисфолдингу молекул SA с потерей биологической активности. Кроме того, наличие дополнительных стадий денатурации и ренатурации значительно повышает трудоемкость и ресурсозатратность процесса выделения SA. Известен также способ выделения активного SA непосредственно из периплазматической фракции E. coli, что позволяет избежать стадии денатурации-ренатурации белка [3]. Однако данный метод не может быть использован в промышленных масштабах из-за сложности его реализации, требующей четкого контроля качественных и количественных параметров выделения. Одним из основных продуцентов коммерческого SA является штамм бактерий S. avidinii АТСС 27419, но данный штамм обладает высокой природной устойчивостью к антибиотикам и требует длительного времени культивирования. Кроме того, при выделении SA из S. avidinii целевой белок часто загрязнен BT [4]. Таким образом, создание новых, более эффективных методов получения активного SA остается актуальной задачей. В данной работе представлены результаты разработки способа получения активного рекомбинантного SA из бактерий E. coli без стадий денатурации и ренатурации. У нас есть положительный опыт решения задачи растворимости целевого белка и его правильного фолдинга на этапе создания плазмиды. В частности, мы уже применяли бактериальный лидерный пептид для получения растворимого белка с «замкнутыми» внутримолекулярными дисульфидными связями [7]. Методика Для создания плазмиды, кодирующей последовательность SA дикого типа с pelB-лидерным пептидом и олигогистидиновой последовательностью (SAAH), был использован исходный вектор рET22b(+) (Novagen, США), для наработки исходного вектора рET22b(+) - штамм Escherichia coli DH5(α) (Promega, США). Для встраивания нуклеотидной последовательности гена SA в исходную плазмиду применяли «липкие концы», получаемые за счет обработки вектора эндонуклеазами рестрикции Nco I (3.1.21.4) и Xho I (3.1.21.4) (Fermentas, Литва). Необходимое количество гена целевого белка (SAAH) синтезировали при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), где в качестве матрицы использовали плазмиду [1], содержащую ген SA дикого типа. Для этого нами были подобраны специальные олигонуклеотиды в качестве праймеров: 5′-ctgtctagactgaagctggtatcacc - праймер с сайтом рестрикции для Nco I; r-SA-XHO: 5′-ctgctcgagggaagcagcggacggtt - праймер с сайтом рестрикции для Xho I. Оба праймера содержат нуклеотидную последовательность, комплементарную последовательности гена SA. Полученные продукты амплификации обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Xho I и Nco I и затем по идентичным «липким концам» лигировали в исходную плазмиду pET22b(+). Сайты эндонуклеаз рестрикции подбирали таким образом, чтобы перед последовательностью SA дикого типа находилась последовательность pelB-лидерного пептида и при этом оба фрагмента находились в одной рамке считывания. Соответствующей лигазной смесью были трансформированы компетентные клетки штамма E. coli DH5(α), которые высевали на селективную агаризованную культуральную среду с добавлением ампициллина (100 мкг/мл). Из нескольких выросших колоний была выделена плазмидная ДНК. Для поиска колоний, содержащих плазмиду со вставкой SAAH, проводили ПЦР-анализ. ПЦР проводили в реакционной смеси конечным объемом 30 мкл. Состав реакционной смеси: праймеры (прямой и обратный) по 10 пмоль, буфер для Taq-полимеразы x1, dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) 6 нмоль, MgCl2 50 нмоль, Taq-полимераза 1 единица. ПЦР проводили в микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 мл на аппарате «Терцик» (Россия). Температурный профиль ПЦР: 5 минут/95 °С; 30 циклов: 1 минута/95 °С, 1 минута/56 °C, 1 минута/72 °С; 5 минут/72 °С. Нуклеотидную последовательность ДНК определяли методом автоматического секвенирования по Сэнгеру. Данную процедуру осуществляли в компании «Бигль» (Санкт-Петербург). Полученной конструкцией, кодирующей ген SA дикого типа, сцепленного с олигогистидиновой последовательностью и pelB-лидерным пептидом (рET22b(+)-SAAH), были трансформированы клетки E. coli BL21(DE3) (Promega, США). Трансформированные клетки высевали на чашки Петри с селективной агаризованной культуральной средой, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Полученные трансформанты были названы E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-SAAH. Клетки E. coli выращивали в течение ночи в 10 мл среды Lysogeny Broth (LB) и затем инокулят вносили в 500 мл свежей среды с добавлением ампициллина (100 мкг/мл). E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-SAAH выращивали при 37 °С до OD600 = 0,6-0,7, индукцию синтеза белка ИПТГ (500 мкМ) проводили при 26 и 16 °С. Полученную биомассу клеток использовали для выделения белка из различных клеточных фракций. Бактериальные клетки отделяли от среды путем осаждения в течение 30 мин при 3500 об/мин (1500 g) и температуре 4 °С с помощью центрифуги К-23 (Janetzki, Польша). SA подвергали хроматографической очистке на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте (Invitrogen, США) (объем колонки 1,5 мл) согласно опубликованному ранее протоколу [5]. Для удаления неспецифично связавшихся белков колонку промывали 0,5 М раствором NaCl на 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 8,0), содержавшим 20 мМ имидазола. Элюирование целевого белка осуществляли с помощью буфера (рН = 8,0), содержащего 0,14 М NaCl и 200 мМ имидазола. После отделения бактериальных клеток путем осаждения периплазматическую фракцию клеток получали методом «осмотического шока» [6]. SA из периплазмы был аффинно очищен на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте указанным выше методом. Клетки, оставшиеся после выделения белка из периплазматической фракции, ресуспендировали в фосфатном буферном растворе (ФБР) (pH = 8; 0,05 М) и осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 1500 g и температуре 4 °С и затем разрушали с применением ультразвукового дезинтегратора (частота - 3 кГц, три интервала по 30 с) в условиях охлаждения. Затем супернатант отделяли центрифугированием в течение 20 минут при 14 000 g и температуре 4 °С, фильтровали через бумажный фильтр и подвергали хроматографической очистке на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте (объем колонки - 1,5 мл) с помощью указанного выше метода. Осадок разрушенных клеток, оставшийся после выделения из растворимой клеточной фракции, отмывали ФБР, растворяли в 6 М гуанидин хлориде (pH = 1,5), затем осаждали в течение 15 минут при 15 000 g и температуре 4 °С. Супернатант фильтровали через бумажный фильтр и очищали на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте, предварительно доведя pH супернатанта до 7,0. Трансформанты E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-SAAH (без pelB), синтезирующие SA дикого типа, сцепленный с олигогистидиновой последовательностью, но не несущий последовательности pelB-лидерного пептида (SAAH (без pelB)), культивировали при 37 °С в среде с добавлением ампициллина (100 мкг/мл), индукцию синтеза белка ИПТГ (500 мкМ) проводили при 37 °С. Полученную биомассу клеток использовали для выделения белка из различных клеточных фракций с помощью методов, указанных выше. На нитроцеллюлозный фильтр наносили по 1 мкл растворов SA различной концентрации. «Окрашивание» нитроцеллюлозного фильтра осуществляли с использованием следующих растворов: раствор I (3 % обезжиренное молоко (Sigma, США) на ФБР, раствор II (разведенный в 3 раза раствор I), раствор III (6 мг 4-хлор-1-нафтола, 2 мл 96 % этанола, ФБР до 12 мл, 6 мкл 30-33 % пероксида водорода). Нитроцеллюлозный фильтр инкубировали в растворе I в течение 30 минут при постоянном покачивании при комнатной температуре. Затем проводили инкубацию с биотинилированной пероксидазой хрена (4 мг/мл, разведение 1 : 2000) в растворе I (2 мл) в течение 1 часа при покачивании при комнатной температуре, отмывали 3 раза по 5 минут раствором II и окрашивали раствором III. Также SA на нитроцеллюлозных фильтрах выявляли методом усиленной хемилюминесценции путем засвечивания рентгеновской пленки в соответствии с протоколом фирмы-производителя Novex® ECL. Концентрацию очищенного белка измеряли с помощью спектрофотометра для микрообъемов Thermo Scientific NanoDrop 2000. Для расчета концентрации SA во фракциях принимали значение коэффициента экстинкции SA для длины волны 280 нм, ε280 для 0,1 % раствора SA равно 3 [1]. Для определения содержания SA в 1 л исходной культуры количества SA во фракциях суммировали. Результаты и их обсуждение Получена генетическая конструкция pET22b(+)-SAAH для синтеза SA дикого типа, сцепленного с pelB-лидерным пептидом и олигогистидиновой последовательностью. Секвенирование встроенного гена подтвердило, что генетическая конструкция соответствует планируемой. Таким образом, рекомбинантный SA имеет аминокислотную последовательность, приведенную на рис. 1. В экспериментах при температуре индукции 16 °С целевой белок (SAAH) был выделен в большем количестве из растворимой клеточной фракции E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-SAAH (рис. 2, а) и в меньшем количестве - из периплазматической клеточной фракции E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-SAAH (рис. 2, б). В тельцах включения и в культуральной среде значимого количества белка при этом обнаружить не удалось. Наличие белка во фракциях проверяли с помощью ДДС-электрофореза. Для этого на дорожки геля наносили пробы SA, предварительно денатурированные кипячением и восстановленные 2-меркаптоэтанолом, и пробы, не подвергнутые прогреванию в кипящей бане и воздействию 2-меркаптоэтанола. Тетрамер SA без прогревания и восстановления имеет кажущуюся молекулярную массу примерно 60 кДа. Прогревание в присутствии 2-меркаптоэтанола приводит к разрушению тетрамерной структуры данного белка и его диссоциации до мономеров, соответствующих зонам на геле с кажущейся молекулярной массой в области 15 кДа. В некоторых случаях добиться полной диссоциации тетрамеров до мономеров не удается, скорее всего, за счет недисульфидных поперечных сшивок. В экспериментах при температуре индукции 26 °С целевой белок (SAAH) был выделен в большем количестве из культуральной среды E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-SAAH (рис. 2, в) и в меньшем количестве - из растворимой клеточной фракции E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-SAAH (рис. 2, г). В периплазматической фракции и в тельцах включения белок в значимом количестве обнаружить не удалось. По данным электрофореза (см. рис. 2, в) с окраской Coomassie brilliant blue R-250 чистота SA из культуральной среды составляет более 95 %. Для сравнения с известными способами получения SA из телец включения был выделен белок с помощью конструкции pET22b(+)-SAAH (без pelB), не содержащий последовательности pelB-лидерного пептида (SAAH (без pelB)) [1] (рис. 2, д). Температура индукции в этом случае составляла 37 °С, что соответствует методике получения белка из телец включения. Как и ожидалось, в культуральной среде и растворимой клеточной фракции целевого белка обнаружено не было. Для получения активной формы SA осуществляли денатурацию белка в 6 М гуанидин хлориде с последующей ренатурацией по описанной ранее методике [1]. При этом изначально из телец включения удалось выделить большее количество SA, однако после стадий денатурации и ренатурации активность SA снизилась, скорее всего, из-за мисфолдинга молекул белка. На рис. 3, а показаны результаты дот-блоттинга рекомбинантного SA (SAAH) из различных клеточных фракций. В экспериментах при температуре индукции 26 °С активный SAAH был обнаружен в культуральной среде и в растворимой клеточной фракции. При температуре индукции 16 °С активный SAAH был обнаружен в растворимой фракции и в периплазматической фракции. На рис. 3, б представлены результаты дот-блоттинга SAAH (без pelB) из телец включения. Наличие пятен в областях нанесения проб SA, выделенного из телец включений, свидетельствует о наличии активного SA в данных фракциях. Результаты оценки наличия и активности SA в различных фракциях E. coli и культуральной среде во всех проведенных нами выделениях приведены в табл. 1. Для сравнения количества и активности SA в различных фракциях использовали пробы белка, выделенного из культуральной среды (индукция при 26 °С), растворимой фракции (индукция при 26 и 16 °С), периплазматической фракции (индукция при 16 °С) и телец включения (конструкция без pelB-лидерного пептида). Активный SA получали с помощью конструкции, кодирующей pelB-лидерный пептид, без процедуры денатурации и ренатурации. Исключением является белок, полученный из телец включения с помощью генетической конструкции без pelB-лидерного пептида, для восстановления активности которого применяли описанные в литературе стадии денатурации и ренатурации [1]. В табл. 2 представлены результаты расчета количества очищенного SA. Активность белка в пробах сравнивали с помощью дот-блоттинга (рис. 4). SA наносили на нитроцеллюлозную мембрану в количестве 0,3; 0,2; 0,1; 0,05 мкг в порядке убывания количества белка. На рис. 4 видно, что SA с дополнительными последовательностями, содержащийся во фракции, выделенной из культуральной среды (индукция при 26 °С) (дорожка 1), существенно превосходит по активности SA, выделенный из других фракций. Таким образом, максимальное количество активного SA удалось обнаружить в культуральной среде в условиях индукции синтеза белка при 26 °C. Целевой белок, выделенный из культуральной среды, наиболее активен по сравнению с образцами белка, выделенными из других клеточных фракций. Существующие способы получения рекомбинантного SA в культурах E. coli включают в себя денатурацию SA с последующей ренатурацией [1]. После ренатурации существенно уменьшается выход растворимой, активной и, соответственно, пригодной для дальнейшего использования формы, что приводит к удорожанию продукта. Необходимость денатурации связана также с тем, что в клетке E. coli постоянно синтезируется BT, который сразу связывается с нарабатываемым SA, делая целевой белок неактивным. Мы предположили, что в периплазме E. coli содержание BT не настолько велико, чтобы «испортить» большую часть молекул рекомбинантного SA. Поэтому мы создали экспрессионную генетическую конструкцию для синтеза SA, слитого с PelB-лидерным пептидом, который направляет целевой белок в периплазматическое пространство, там лидерная последовательность отщепляется и белок секретируется в культуральную среду. Качественно более высокая удельная активность белка из культуральной среды указывает на низкое содержание свободного BT в этой среде. В дальнейшем предполагается для повышения выхода целевого SA применить разработанный нами протокол роста культуры с использованием теплового шока [10, 11], химерных вариантов SA с зеленым флуоресцентным белком суперфолдером [8, 9] и частичной денатурации целевого белка [12]. Заключение Разработан способ получения рекомбинантного SA, пригодного для исследований в области молекулярной биологии и лабораторной диагностики, включающий создание рекомбинантной плазмиды с геном SA, который дополнительно кодирует pelB-лидерный пептид и олигогистидиновую последовательность. Показано, что оптимальной температурой индукции синтеза SA является 26 °С, при которой максимальное количество белка поступает в культуральную среду. Способ впервые позволяет получать значительные количества активного SA из культуральной среды и исключает необходимость денатурации и ренатурации рекомбинантного белка, которые могут сопровождаться частичной инактивацией. Благодарности Работа выполнена при поддержке гранта РНФ (№ 14-50-00069) и программы УМНИК (№ 10901ГУ/2016 от 29.12.2016).

D V Zotova

Institute of Experimental Medicine

N A Grudinina

Institute of Experimental Medicine

O I Antimonova

Institute of Experimental Medicine

M M Shavlovsky

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

D S Polyakov

Institute of Experimental Medicine

  1. Zhang M, Shao J, Xiao J, et al. A novel approach to make homogeneous protease-stable monovalent streptavidin. Biochem Biophys Res Commun. 2015;463(4):1059-1063. doi: 10.1016/j.bbrc.2015.06.058.
  2. Green NM. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 1990;184:51-67. doi: 10.1016/0076-6879(90)84259-j.
  3. Syrkina MS, Shirokov DA, Rubtsov MA, et al. Preparation and functional evaluation of RGD-modified streptavidin targeting to integrin-expressing melanoma cells. Protein Eng Des Sel. 2013;26(2):143-150. doi: 10.1093/protein/gzs076.
  4. Hofmann K, Wood SW, Brinton CC, et al. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980;77(8):4666-4668. doi: 10.1073/pnas.77.8.4666.
  5. Поляков Д.С., Грудинина Н.А., Соловьев К.В., и др. Бета2-микроглобулиновый амилоидоз: фибриллогенез природного и рекомбинантных бета2-микроглобулинов человека // Медицинский академический журнал. - 2010. - Т. 10. - № 2. - С. 40-49. [Polyakov DS, Grudinina NA, Solov’ev KV, et al. Bela2-microglobuline amyloidosis: Fibrillogenesis of natural and recombinant human beta2-microglobulines. Medical academic journal. 2010;10(2);40-49 (In Russ.)]
  6. Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Current Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons; 1989.
  7. Поляков Д.С., Грудинина Н.А., Соловьев К.В., и др. Получение рекомбинантного β2-микроглобулина человека и его фибриллогенез при низких и нейтральных значениях рН // Молекулярная медицина. - 2011. - № 2. - C. 36-39. [Polyakov DS, Grudinina NA, Solov’ev KV, et al. Production of recombinant human β2-microglobulin and its amyloid fibril formation at acidic and neutral pH. Molekuliarnaia meditsina. 2011;(2);36-39. (In Russ.)]
  8. Solovyov KV, Polyakov DS, Grudinina NA, et al. Expression in E. coli and purification of the fibrillogenic fusion proteins TTR-sfGFP and beta2M-sfGFP. Prep Biochem Biotechnol. 2011;41(4):337-349. doi: 10.1080/10826068.2010.548433.
  9. Поляков Д.С., Антимонова О.И., Сахабеев Р.Г., и др. Влияние наночастиц из полимолочной кислоты на иммуногенность связанного с ним белка // Инфекция и иммунитет. - 2017. - Т. 7. - № 2. - С. 123-129. [Polyakov DS, Antimonova OI, Sakhabeev RG, et al. Polylactic acid nanoparticles influence on immunogenicity of the protein bound with them. Russian Journal of Infection and Immunity. 2017;7(2):123-129. (In Russ.)] doi: 10.15789/2220-7619-2017-2-123-129.
  10. Solovyov KV, Kern АM, Grudinina NA, et al. Genetic structures and conditions of their expression, which allow receiving native recombinant proteins with high output. International Journal of biomedicine. 2012;2(1):45-49.
  11. Антимонова О.И., Грудинина Н.А., Егоров В.В., и др. Взаимодействие красителя конго красный с фибриллами лизоцима, бета2-микроглобулина и транстиретина // Цитология. - 2016. - Т. 58. - № 2. - С. 156-163. [Antimonova OI, Grudinina NA, Egorov VV, et al. Interaction of the dye congo red with fibrils of lysozyme, beta2-microglobultn and transthyretin. Cell and tissue biology. 2016;58(2):156-163. (In Russ.)]
  12. Поляков Д.С., Сахабеев Р.Г., Шавловский М.М. Частичная денатурация рекомбинантного белка для его аффинного выделения // Прикладная биохимия и микробиология. - 2016. - Т. 52. - № 1. - С. 122-127. [Polyakov DS, Sakhabeev RG, Shavlovskiy MM. Polylactic acid nanoparticles influence on immunogenicity of the protein bound with them. Applied biochemistry and microbiology. 2016;52(1):122-127. (In Russ.)]. doi: 10.7868/S0555109916010104.

Views

Abstract - 145

PDF (Russian) - 5

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Zotova D.V., Grudinina N.A., Antimonova O.I., Shavlovsky M.M., Polyakov D.S.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies