Molecular-genetic characteristics of strain Escherichia coli serogroup O26 causing diarrheal diseases in children

Abstract


Aim. To determine the serotype and virulence factors of the E. coli serogroup O26 isolated from children with diarrheal syndrome. Materials and methods. Fifty-three strains of E. coli O26 isolated in 2014-2016 from the stool of children with clinical manifestations of acute intestinal infection in Saint Petersburg were studied. Phenotypic (enzymatic and antigenic properties), molecular genetic [detection of virulence genes of enteropathogenic (EPEC - eae, bfp, hlyA), and enterohemorrhagic (EHEC - eae, stx1, stx2, ehxA), genes encoding O- and H-antigens (rfb and fliC), genes, defining phylogenetic group (chuA, yjaA и TspE)] methods were used. The phylogenetic group and the production Shiga toxins were determined. Results. All strains were identical to the antigen characteristics of serotype O26:H11 and phylogenetic group B1. Two pathogroups were created based on the set of virulence genes: a-EPEC (64.2%) and EHEC (35.8%). Strains EHEC produced Shiga-toxin 1, encoding gen stx1. No differences in enzymatic activities were found between the strains of E. coli О26:H11 for EPEC and EHEC strains. Conclusion. In the population of E. coli O26:H11, which caused acute intestinal infection in children in Saint Petersburg, more than 30% of the strains belonged to the highly virulent group EHEC. Molecular-genetic methods should be used for reliable detection of pathogens.

Введение Острые кишечные инфекции (ОКИ) продолжают оставаться глобальной медико-социальной проблемой: распространены повсеместно, контагиозные, многие этиологические формы, в том числе эшерихиозы, обусловленные энтерогеморрагическими E. coli, способны к широкому эпидемическому распространению [1]. По данным экспертов ВОЗ, у детей частота синдрома диареи составляет не менее трех случаев на одного ребенка в год, при этом в развивающихся странах диарейные заболевания характеризуются достаточно высоким уровнем летальности. В Российской Федерации, по данным Федеральной службы государственной статистики, за последние пять лет ежегодно регистрировалось более 700 тысяч случаев кишечных инфекций [2]. Среди возбудителей, способных вызывать групповые заболевания и эпидемические вспышки ОКИ, особое место занимает группа энтерогеморрагических E. coli (EHEC), продуцирующих экзотоксины (шига-токсины/Vero-токсины). У пациентов после перенесенного или на фоне развития заболевания, обусловленного ЕНЕС, нередко возникают осложнения в виде тяжелых поражений почек, таких как гемолитико-уремический синдром (ГУС) и острая почечная недостаточность (ОПН). Осложнения отмечаются приблизительно у 15 % детей младшего возраста с EHEC-инфекцией, вызванной E. coli O157:H7 [3]. E. coli О157:Н7 представляет собой наиболее известный, хорошо изученный возбудитель ОКИ человека, для выделения которого разработаны специальные питательные среды, тест-системы для быстрой идентификации. ОКИ, обусловленные этим патогеном, регистрируют практически во всех странах [4, 5]. По данным литературы последних десятилетий, несмотря на то, что E. coli O157: H7 служит основной причиной развития ГУС и ОПН во многих странах, EHEC серотипа O26:H11/Н- (подвижный и неподвижный вариант) стали наиболее распространенными возбудителями EHEC-инфекций человека после E. coli O157:H7 в Европе, США, Южной Америке, Азии и Австралии [6]. Отмечено, что EHEC O26 могут вызывать такие же тяжелые заболевания у детей с развитием осложнений (ГУС), как и EHEC O157 [7]. Известно, что штаммы EHEC O26:H11/Н- продуцируют шига-токсины двух разновидностей, обозначаемых как шига-токсин 1 и шига-токсин 2 (Stx1 и Stx2) и кодируемых генами stx1 и stx2 соответственно. Штаммы ЕНЕС любого серотипа могут содержать один или оба гена, кодирующих продукцию шига-токсина [8]. Большинство штаммов EHEC O26, выделенных от пациентов с ОКИ, продуцировали только Stx1 [9]. В Германии в середине 1990-х гг. впервые были выделены штаммы EHEC O26, продуцирующие Stx2 (ген stx2), которые обусловливают более тяжелое течение заболевания [10]. В настоящее время такие штаммы часто обнаруживают в европейских странах и США [11, 12]. В Российской Федерации в диагностических бактериологических лабораториях E. coli О26 часто выделяют при ОКИ у детей, как правило, их относят к группе ЕРЕС, а детекция факторов вирулентности или генов, кодирующих факторы вирулентности, не проводится. Цель исследования - определить серотиповую принадлежность и факторы вирулентности штаммов E. coli О26, выделенных от детей с диарейным синдромом. Материалы и методы исследования Изучены биологические свойства 53 штаммов E. coli серогруппы О26, выделенных в 2014-2016 гг. из проб испражнений детей с клиническими проявлениями ОКИ в Санкт-Петербурге, с применением классического бактериологического и молекулярно-генетического методов. В практических бактериологических лабораториях ферментативные свойства и О-антигенная характеристика были определены общепринятыми фенотипическими методами. Все изученные E. coli О26 были отнесены к группе ЕРЕС на основании положительной реакции агглютинации в «диагностической эшерихиозной О26 групповой адсорбированной сыворотке». В лаборатории кишечных инфекций ФБУН «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» было проведено дальнейшее субтипирование штаммов классическими бактериологическими и молекулярно-генетическими методами. Родовую и видовую идентификацию (широкий спектр ферментативных свойств) определяли, используя бактериологический анализатор Vitek 2 Compact (Biomerieux, Франция), а также тест-систему ЭНТЕРОТЕСТ-24 (Эрба, Чехия). Для характеристики антигенной структуры штаммов выполняли молекулярное серотипирование (амплификация генов rfb и fliC, кодирующих антигены О26 и Н11 соответственно, в ПЦР с электрофоретической детекцией). Принадлежность штаммов к патогруппам (ЕРЕС или ЕНЕС) определяли с использованием набора реагентов для выявления и дифференциации ДНК диареегенных E. coli методом РВ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Эшерихиозы-FL» согласно инструкции производителя («ИнтерЛабСервис», Россия). Гены вирулентности ЕРЕС и ЕНЕС (eae, bfp, sxt1, sxt2, hlyА, ehxA), а также гены, характеризующие филогенетическую принадлежность (chuA, yjaA, TspE), изучали в формате мультиплексной ПЦР с электрофоретической детекцией. В качестве положительных контролей служили штаммы энтеробактерий - E. coli 217 (гены bfp, eae) и EDL 933 (гены sxt1, sxt2, ehxA), в качестве отрицательного контроля - E. coli НВ 101. Сиквенсы праймеров, использованных в работе, представлены в табл. 1. Продукцию токсинов подтверждали иммунохроматографической тест-системой (RIDA Quick Verotoxin, Германия). ДНК выделяли при помощи InstaGene Matrix, Bio-Rad. Полученные пробы хранили при температуре -20 °C для дальнейшего использования в качестве источника матрицы для амплификации. Для постановки ПЦР применяли наборы Master Mix (Bio-Rad, США). ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл в амплификаторе С1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в 2 % агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров молекулярного веса использовали GeneRuler 100pb DNA Ladder (Fermentas, Литва). Результаты и их обсуждение Штаммы, выделенные от детей с ОКИ, имели культурально-ферментативные свойства, типичные для бактерий рода Escherichia, вида E. coli, обладали гемолизирующей активностью, выявляемой на питательном агаре с эритроцитами барана, и были идентичны по антигенной характеристике - относились к серогруппе О26, серотипу О26:Н11 и филогенетической группе В1. Принадлежность к серологической группе О26 подтверждена в реакции агглютинации и по наличию гена rfb, кодирующего О-антиген 26. Все штаммы были подвижные, но из-за отсутствия отечественных агглютинирующих Н-сывороток фенотипическими методами серотиповая принадлежность не могла быть выявлена, поэтому серотип О26:Н11 был установлен на основании наличия у всех штаммов гена fliC, кодирующего продукцию белка флагеллина (Н антигена 11). Результаты РВ-ПЦР с набором реагентов «АмплиСенс® Эшерихиозы-FL» показали, что популяция E. coli О26:Н11 по набору генов вирулентности была гетерогенна и включала штаммы двух патогрупп - ЕРЕС и ЕНЕС. К группе ЕРЕС относились 34 штамма (64,2 %), которые содержали ген еае, кодирующий адгезин (интимин), и ген hlyА, кодирующий продукцию α-гемолизина. Отсутствие в штаммах гена bfp, кодирующего адгезию (bundle forming pili), свидетельствовало об их принадлежности к группе а-ЕРЕС - «атипичные» энтеропатогенные E. coli [19]. К группе ЕНЕС относились 19 штаммов (35,8 %), которые содержали гены еае, stx1, ehxA, кодирующие адгезию, продукцию Stx1 и энтерогемолизина. Продукция Stx1 была подтверждена в иммунохроматографическом тесте. Штаммы О26:Н11 с аналогичным набором генов вирулентности широко циркулируют в странах Европы [9]. Штаммы характеризовались ферментативной активностью в отношении глюкозы, лактозы, маннита, сахарозы, арабинозы, сорбита. Рамнозу и дульцит ферментировали все штаммы ЕНЕС и 50 % штаммов ЕРЕС. Мальтозу ферментировали все штаммы ЕРЕС и 84 % ЕНЕС. Практически все штаммы декарбоксилировали аминокислоту лизин, а орнитин - каждый второй штамм ЕНЕС (52,6 %). Особенности ферментативных свойств не позволили дифференцировать штаммы E. coli О26:Н11 на группы ЕРЕС и ЕНЕС. Тем не менее по ферментативным свойствам штаммы ЕРЕС и ЕНЕС включали несколько ферментативных вариантов. Возможно, эти данные свидетельствуют о наличии клоновых линий внутри каждой патогруппы E. coli О26:Н11, которые имеют эпидемиологическое значение. Дальнейшее углубленное изучение штаммов (генотипирование методами MLST и PFGE) позволит выявить эпидемиологические особенности диарейных заболеваний, обусловленных возбудителем E. coli О26:Н11. В табл. 2 и 3 представлены сравнительные характеристики штаммов О26:Н11 групп ЕРЕС и ЕНЕС по содержанию генов вирулентности и ферментативной активности. Заключение Впервые E. coli 026 были выделены от детей с диарейным синдромом в 1951 г. в Дании. Через пять лет, в 1956 г., Э.М. Новгородская (Ленинградский НИИЭМ имени Пастера) сообщила о выделении из проб испражнений четырех детей, страдавших «диспепсией» (колиэнтеритом), аналогичных штаммов E. coli 026. Клинико-эпидемиологические наблюдения, проведенные в те годы, подтвердили гетерогенность популяции этого возбудителя. Было отмечено, что «колиэнтериты» детей раннего возраста, вызванные E. coli 026, могут протекать как в тяжелой, так и в легкой форме. При спорадических случаях дети старшего возраста и взрослые переносили заболевание в легкой форме, и нередко отмечалось здоровое «носительство». По мнению отдельных клиницистов, «эшерихиоз 026» часто протекал очень тяжело. В 1958 г. были зарегистрированы две вспышки ОКИ, этиологически связанные с E. coli 026: одна - среди взрослых, протекавшая по типу пищевой интоксикации, и вторая - среди 43 новорожденных детей, 9 из которых умерли. Наши исследования подтвердили серотиповую принадлежность штаммов, циркулирующих в настоящее время, к E. coli О26:Н11 и показали, что современная популяция гетерогенна по наличию генов, контролирующих факторы вирулентности. Данные литературных источников свидетельствуют о том, что тяжелые формы ОКИ у детей и взрослых вызывают E. coli О26, продуцирующие шига-токсины (ЕНЕС). Заболевания, вызванные E. coli О26 (ЕРЕС), протекают чаще в легкой форме. Сравнительные исследования, проведенные в Санкт-Петербурге, продемонстрировали, что ПЦР-диагностика выявила широкую распространенность у детей с ОКИ патогенных E. coli О26. По частоте обнаружения доминировали ЕРЕС - 64,2 %, доля ЕНЕС составляла 35,8 % [20]. Бактериологическим методом диареегенные E. coli О26 не могли быть разделены на ЕРЕС и ЕНЕС. Выводы Популяция E. coli О26:Н11 включает штаммы с генотипами вирулентности ЕРЕС и ЕНЕС, которые не могут быть достоверно идентифицированы при классическом бактериологическом исследовании. Методы детекции шига-токсинов/генов, ответственных за их продукцию, необходимо внедрять в клиническую практику врачей-бактериологов для диагностики ЕНЕС-инфекции. При ранней диагностике ЕНЕС-ассоциированных гемоколитов возможна коррекция терапии пациентов (исключение/ограничение применения антибактериальных препаратов бактерицидного действия) для снижения риска развития ГУС и ОПН как инвалидизирующих осложнений. Молекулярно-генетические методы расширяют аналитические и диагностические возможности лабораторных исследований при диарейных заболеваниях эшерихиозной этиологии.

M A Makarova

Saint Petersburg Pasteur Institute

A V Dmitriev

Institute of Experimental Medicine

Z N Matveeva

Saint Petersburg Pasteur Institute

K A Kaftyreva

Saint Petersburg Pasteur Institute

  1. Кафтырева Л.А., Егорова С.А., Макарова М.А., и др. Характеристика биологических свойств E. coli О104:Н4 - возбудителя крупной пищевой вспышки, возникшей в Германии в мае 2011 г. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2012. - № 1. - С. 44-47. [Kaftyreva LA, Egorova SA, Makarova MA, et al. The characteristics of biological properties of E. coli O104:H4 - the causative agent of large-scale alimentary ictus in Germany May 2001. Klin Lab Diagn. 2012;(1):44-47. (In Russ.)]
  2. Федеральная служба государственной статистики (Росстат). Здравоохранение в России - 2017. Статистический сборник. - М., 2017. [Federal’naya sluzhba gosudarstvennoy statistiki (Rosstat). Zdravookhranenie v Rossii - 2017. Statisticheskiy sbornik. Moscow; 2017. (In Russ.)]
  3. Bell BP, Griffin PM, Lozano P, et al. Predictors of hemolytic uremic syndrome in children during a large outbreak of Escherichia coli O157:H7 infections. Pediatrics. 1997;100(1):E12. doi: 10.1542/peds.100.1.e12.
  4. Bielaszewska M, Zhang W, Tarr PI, et al. Molecular profiling and phenotype analysis of Escherichia coli O26:H11 and O26:NM: secular and geographic consistency of enterohemorrhagic and enteropathogenic isolates. J Clin Microbiol. 2005;43(8):4225-4228. doi: 10.1128/JCM.43.8.4225-4228.2005.
  5. Онищенко Г.Г., Дятлов И.А, Светоч Э.А., и др. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсинпродуцирующих Escherichia coli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в Санкт-Петербурге в 2013 году // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2015. - Т. 70. - № 1. - С. 70-81. [Onishchenko GG, Dyatlov IA, Svetoch EA, et al. Molecular-genetic Characterization of Shiga-Toxin Producing Escherichia сoli Isolated During a Food-Borne Outbreak in Saint Petersburg in 2013. Annals of the Russian academy of medical sciences. 2015;70(1):70-81. (In Russ.)]. doi: 10.15690/vramn.v70i1.1234.
  6. Bielaszewska M, Mellmann A, Bletz S, et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli O26:H11/H-: a new virulent clone emerges in Europe. Clin Infect Dis. 2013;56(10):1373-1381. doi: 10.1093/cid/cit055.
  7. Misselwitz J, Karch H, Bielazewska M, et al. Cluster of hemolytic-uremic syndrome caused by Shiga toxin-producing Escherichia coli O26:H11. Pediatr Infect Dis J. 2003;22(4):349-354. doi: 10.1097/01.inf.0000059338.38673.ae.
  8. Nataro JP, Kaper JB. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin Microbiol Rev. 1998;11(1):142-201. doi: 10.1128/CMR.11.1.142.
  9. Kruger A, Lucchesi PM, Sanso AM, et al. Genetic characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli O26:H11 strains isolated from animal, food, and clinical samples. Front Cell Infect Microbiol. 2015;5:74. doi: 10.3389/fcimb.2015.00074.
  10. Vygen-Bonnet S, Rosner B, Wilking H, et al. Ongoing haemolytic uraemic syndrome (HUS) outbreak caused by sorbitol-fermenting (SF) Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O157, Germany, December 2016 to May 2017. Euro Surveill. 2017;22(21). doi: 10.2807/1560-7917.ES.2017.22.21.30541.
  11. Bonardi S, Alpigiani I, Tozzoli R, et al. Shiga toxin-producing Escherichia coli O157, O26 and O111 in cattle faeces and hides in Italy. Vet Rec Open. 2015;2(1):e000061. doi: 10.1136/vetreco-2014-000061.
  12. Brooks JT, Sowers EG, Wells JG, et al. Non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli infections in the United States, 1983-2002. J Infect Dis. 2005;192(8):1422-1429. doi: 10.1086/466536.
  13. Durso LM, Bono JL, Keen JE. Molecular serotyping of Escherichia coli O26:H11. Appl Environ Microbiol. 2005;71(8):4941-4944. doi: 10.1128/AEM.71.8.4941-4944.2005.
  14. Guion CE, Ochoa TJ, Walker CM, et al. Detection of diarrheagenic Escherichia coli by use of melting-curve analysis and real-time multiplex PCR. J Clin Microbiol. 2008;46(5):1752-1757. doi: 10.1128/JCM.02341-07.
  15. Tobias J, Vutukuru SR. Simple and rapid multiplex PCR for identification of the main human diarrheagenic Escherichia coli. Microbiol Res. 2012;167(9):564-570. doi: 10.1016/j.micres.2011.11.006.
  16. El-Rami FE, Rahal E, Sleiman FT, Abdelnoor AM. Identification of virulence genes among antibacterial-resistant Escherichia coli. Adv Stud Biol. 2012;4(8):385-396.
  17. Slanec T, Fruth A, Creuzburg K, Schmidt H. Molecular analysis of virulence profiles and Shiga toxin genes in food-borne Shiga toxin-producing Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 2009;75(19):6187-6197. doi: 10.1128/AEM.00874-09.
  18. Clermont O, Bonacorsi S, Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl Environ Microbiol. 2000;66(10):4555-4558. doi: 10.1128/AEM.66.10.4555-4558.2000.
  19. Afset JE, Bergh K, Bevanger L. High prevalence of atypical enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) in Norwegian children with diarrhoea. J Med Microbiol. 2003;52(Pt 11):1015-1019. doi: 10.1099/jmm.0.05287-0.
  20. Соколова Е.Д., Галтаева А.М., Замурин О.Ю., и др. Полимеразно-цепная реакция в диагностике острых кишечных инфекций в детском инфекционном стационаре: возможности и проблемы // Инфекция и иммунитет. - 2016. - Т. 6. - № 3. - С. 225-231. [Sokolova ED, Galtaeva AM, Zamurin OY, et al. Acute enteric infections polymerase chain reaction assay in pediatric practice: opportunities and challenges. Russian journal of infection and immunity. 2016;6(3):225-231. (In Russ.)]. doi: 10.15789/2220-7619-2016-3-225-231.

Views

Abstract - 126

PDF (Russian) - 2

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Makarova M.A., Dmitriev A.V., Matveeva Z.N., Kaftyreva K.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies