Impact of beta-D-glucan on survival and hematopoietic parameters of mice after exposure to X-rays

Full Text

Обоснование

Разработка противолучевых фармакологических препаратов — предмет активных исследований в течение многих десятилетий, однако создание идеальных по соотношению эффективности и безопасности противолучевых средств, несмотря на значительные научные достижения, все еще остается трудно разрешимой задачей [1]. Вместе с тем в XXI в. актуальность данных исследований существенно возрастает, что связано с повышением рисков локального или глобального радиационного заражения местности и поражения людей в результате применения ядерного оружия в военных целях или действий террористических группировок, а также возможных аварийных ситуаций на ядерно-опасных объектах [2, 3].

Серьезную проблему представляет возрастающая потребность в фармакологических средствах, способных минимизировать негативные последствия воздействия ионизирующих излучений на людей, в разных областях медицины, прежде всего, в онкологии — для селективной защиты здоровых тканей и органов, попадающих в зону лучевого воздействия при радиотерапии злокачественных новообразований [4], при облучении пациентов в диагностических целях [5], а также в космической медицине для защиты космонавтов от воздействия галактической радиации при осуществлении длительных пилотируемых полетов [6]. Неудачи исследователей при создании синтетических радиопротекторов, наиболее эффективные из которых нередко обладают высокой токсичностью и/или плохой переносимостью, что делает их непригодными для длительного применения и существенно снижает возможность широкого использования в клинической практике, обусловили поиск соединений с противолучевой активностью из природных источников. Среди наиболее перспективных классов соединений рассматриваются естественные лиганды толл-подобных рецепторов (TLR) [7], в частности белок жгутиков бактерий флагеллин [8]. Благодаря мощным антиоксидантным свойствам ценную альтернативу синтетическим соединениям для использования в качестве радиозащитных средств представляют растительные биологически активные вещества, в частности полифенолы [9]. Основное ограничение их масштабной разработки — сложность получения стабильной и удобной для применения лекарственной формы.

В последние годы в различных областях фармакологии отмечается значительное возрастание интереса к природным бета-D-глюканам — соединениям класса полисахаридов — структурных компонентов клеточной стенки некоторых растений (преимущественно злаковых), водорослей, одноклеточных и высших грибов [10]. Несмотря на многообразие естественных источников бета-D-глюканов, наиболее часто содержащие данный полисахарид препараты получают из дрожжей и некоторых базидиомицетов — лекарственных грибов, терапевтические свойства которых известны многие тысячелетия. Биологически активные формы бета-D-глюканов образованы длинной линейной цепью мономеров D-глюкозы, соединенных бета-1,3-гликозидными связями, с короткими боковыми ответвлениями той же структуры, которые присоединяются к основной цепи в положении 1, 6. Биологическая активность грибных бета-(1-3)(1-6)-D-глюканов многогранна: во многих экспериментальных исследованиях и клинических испытаниях подтверждены антиоксидантные, противомикробные, противоопухолевые, противовоспалительные, иммуномодулирующие, антигиперхолестеринемические, противодиабетические, гепатопротекторные и другие свойства [11, 12], что позволяет классифицировать данные соединения как модификаторы биологического ответа [13]. Кроме того, в научной литературе накапливаются данные, свидетельствующие о потенциале грибных бета-D-глюканов в качестве эффективных и безопасных средств снижения токсических эффектов лучевого поражения (рассмотрено в работе [14]).

Представители вида Pleurotus, хотя и не относятся к широко известным лекарственным грибам, обладают доказанными биологическими свойствами и эффектами, при этом благодаря своей пищевой ценности и превосходным вкусовым качествам являются одними из самых культивируемых пищевых грибов в мире [15, 16]. В частности, вид P. ostreatus (вешенка обыкновенная или устричная) по мировому объему производства занимает второе место в мире после шампиньона Agaricus bisporus [17]. Полифункциональность действия полисахаридов из P. ostreatus в совокупности с доступностью, низкой токсичностью, хорошей переносимостью и относительной простотой культивирования позволяют рассматривать P. ostreatus в качестве перспективного источника природных фармакологически активных соединений для лечения ряда заболеваний, а именно показана эффективность содержащего бета-D-глюкан экстракта из P. ostreatus в терапии острого назофарингита [18].

В проведенных нами ранее экспериментах на мышах было установлено, что бета-D-глюкан, полученный отечественными специалистами из базидиального гриба P. ostreatus, обладает противолучевой активностью при внутрижелудочном введении лабораторным грызунам [19], что открывает перспективы разработки пероральной формы радиозащитного средства, однако необходимы дальнейшие исследования, направленные на более детальное изучение выявленного эффекта и его механизмов.

Цель исследования — оценка противолучевой эффективности бета-D-глюкана из гриба P. ostreatus (вешенки обыкновенной) в условиях общего внешнего облучения мышей по показателям их выживаемости и гемопоэза.

Материалы и методы

Исследование проведено с использованием экспериментальной модели костномозговой формы острого радиационного синдрома на белых беспородных мышах-самцах (350 голов) массой тела 18–20 г, выращенных в питомнике лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область). Животных содержали в стандартных условиях вивария с соблюдением светового режима 12/12 ч и свободным доступом к воде и пище. Для кормления использовали полнорационный гранулированный комбикорм (ООО «Наш город», г. Ступино, Московская область); кормление и уход за животными осуществляли в первой половине дня.

После 14-дневного карантина перед началом исследований животные были распределены на сопоставимые группы по 12–15 голов в соответствии с протоколами экспериментов: интактные (биологический контроль), облученные без фармакологической коррекции (контроль – облучение) и облученные с применением радиозащитного препарата. Животные с признаками наличия заболеваний или иных повреждений были исключены из исследования. Все необходимые манипуляции выполняли с соблюдением правил гуманного обращения с лабораторными животными, используемыми в научных целях [20]. Решение о соответствии исследования этическим нормам и о допустимости проведения экспериментов с использованием животных было принято на заседании независимого Этического комитета при Военно-медицинской академии от 19.07.2022 (протокол № 267).

В работе была изучена противолучевая эффективность бета-D-глюкана — основного биологически активного компонента экстракта базидиального гриба вешенки обыкновенной (P. ostreatus), полученного с использованием методов микробиологического синтеза в ООО НПФ «Биос» (удостоверение качества и безопасности от 15.06.2022). Препарат бета-D-глюкана в виде водного раствора вводили экспериментальным животным (мышам) в желудок (в/ж) с помощью атравматичного зонда из расчета по 0,25 мл на 10 г массы тела грызуна.

Радиационное воздействие моделировали с применением рентгеновского терапевтического аппарата РУМ-17 (протокол поверки № 296-КЭП/2021 от 21.10.2021). Параметры облучения: 180 кВт, 14 мА, фильтр 0,5 мм Сu + + 1 мм Al, мощность дозы 0,328 Гр/мин, направление «спина – грудь», кожно-фокусное расстояние 50 см. Одновременно лучевому воздействию подвергали животных из разных экспериментальных групп. «Ложно облученных» мышей помещали в предназначенные для облучения пластиковые контейнеры и выдерживали при выключенной анодной трубке рентгеновского аппарата. При оценке эффективности бета-D-глюкана по параметрам выживаемости (30-суточная выживаемость, динамика гибели и средняя продолжительность жизни облученных мышей) проводили ежедневное наблюдение за общим состоянием животных с регистрацией погибших мышей; на протяжении всего периода наблюдения дважды в неделю осуществляли контроль массы тела.

Количественную оценку радиомодифицирующего эффекта, обусловленного применением бета-D-глюкана, проводили путем расчета фактора изменения дозы — отношения равноэффективных доз облучения, вызывающих гибель 50 % животных в течение 30 сут после облучения при применении радиозащитного препарата или без лечения (СД_50/30). Величину СД₅₀ рассчитывали методом пробит-анализа [21], прогнозируемое значение абсолютно смертельной дозы рентгеновского излучения (СД₁₀₀) определяли по формуле:

СД₁₀₀=СД₈₄+(СД₈₄-СД₅₀)/2,

где СД₅₀, СД₈₄ и СД₁₀₀ — дозы облучения, приводящие к гибели 50, 84 и 100 % животных.

Гематологические исследования осуществляли на гематологическом анализаторе MicroCC-20Plus-Vet (High Technology, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Образцы смешанной крови в объеме 40 мкл отбирали после декапитации животных в вакуумные пробирки с антикоагулянтом (этилендиаминтетрауксусная кислота, ЭДТА), анализ проводили в день забора биоматериала.

Определение количества колониеобразующих единиц на селезенке (КОЕ-с) проводили по методу эндогенного колониеобразования по J.E. Till, E.A. McCulloch [22] в модификации [23]. На 9-е сутки после облучения у умерщвленных мышей извлекали селезенки, фиксировали их на бумажных полосках, помещенных в чашки Петри, и заливали приготовленной ex tempore жидкостью Буэна (1,2 % раствор пикриновой кислоты, 40 % формальдегид и ледяная уксусная кислота в соотношении 15 : 5 : 1). Через 24 ч на свободной поверхности селезенки под бинокулярной лупой подсчитывали количество эндогенных колоний. Учитывали колонии диаметром не менее 0,4 мм.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 8.0 и с использованием непараметрических критериев: для множественных сравнений несвязанных групп применяли критерий Краскела – Уоллиса, для связанных выборок — критерий Вилкоксона, для оценки различий между двумя независимыми группами — критерии Лог – Ранка или Манна – Уитни. При проведении парных сравнений различия принимали статистически значимыми при р < 0,05, при сравнении нескольких групп применяли поправку Бонферрони. Результаты представлены в виде медианы (Ме) и нижнего и верхнего квартилей [Q₂₅; Q₇₅] [24].

Результаты и обсуждение

Исследование противолучевой активности бета-D-глюкана было выполнено в два этапа. Целью первого этапа стало проведение количественной оценки радиомодифицирующего эффекта во всех выявленных ранее эффективных схемах — за 15–30 мин до облучения (профилактическая схема), а также через 1 и 2 ч после рентгеновского воздействия (терапевтическое применение), для чего животных контрольных и опытных групп облучали в четырех дозах: 6,5, 7,0, 7,5 и 8,0 Гр. Бета-D-глюкан вводили животным однократно в оптимальной радиозащитной дозе 500 мг/кг. Результаты оценки влияния исследуемого препарата на параметры 30-суточной выживаемости облученных мышей приведены в табл. 1. Однократное общее рентгеновское излучение без фармакологической коррекции приводило к дозозависимому снижению выживаемости облученных мышей, при этом доза 8 Гр была минимальной абсолютно летальной, приведя к гибели всех мышей контрольной группы. Существенную защиту облученных животных от гибели обеспечивало профилактическое применение бета-D-глюкана за 15–30 мин до облучения, статистически значимые отличия с животными контрольных групп выявлялись при поглощенных дозах рентгеновского излучения в 7,0, 7,5 и 8,0 Гр.

 

Таблица 1. Параметры 30-суточной выживаемости мышей после общего рентгеновского облучения и однократного введения бета-D-глюкана в желудок в дозе 500 мг/кг

Table 1. Effect of beta-D-glucan (500 mg/kg, intragastric) on the mice survival after exposure to X-rays total body irradiation

Доза облучения, Гр	Группы животных		Выживаемость		Продолжительность жизни погибших от облучения мышей
	схема введения бета-D-глюкана	n	%	р* (критерий Лог – Ранка)	Me [Q25; Q75]	р* (критерий Манна – Уитни)
6,5	Облучение (контроль)	12	41,7 ± 14,2	0,208 (критерий Краскела – Уоллиса)	6 [3; 9]	0,189 (критерий Краскела – Уоллиса)
	15–30 мин до облучения	11	72,7 ± 13,4		9 [4; 12]
	1 ч после облучения	12	66,7 ± 13,6		9,5 [9; 13]
	2 ч после облучения	11	60 ± 15,5		10,5 [6; 17]
7	Облучение (контроль)	14	28,6 ± 12,1	–	10 [9; 11]	0,616 (критерий Краскела – Уоллиса)
	15–30 мин до облучения	14	66,7 ± 13,6	0,033	10 [10; 11]
	1 ч после облучения	13	30,8 ± 12,8	0,616	11 [10; 13]
	2 ч после облучения	14	42,9 ± 13,2	0,491	10 [8, 5; 12, 5]
7,5	Облучение (контроль)	15	20 ± 10,3	–	8 [3; 10, 5]	–
	15–30 мин до облучения	15	46,7 ± 12,9	0,026	12 [10; 16]	0,015
	1 ч после облучения	15	20 ± 10,3	0,531	8 [7; 10, 5]	0,621
	2 ч после облучения	15	26,7 ± 11,5	0,634	10 [8; 11]	0,135
8	Облучение (контроль)	15	0 ± 0,26	–	7 [6; 10]	–
	15-30 мин до облучения	15	33,3 ± 12,7	0,001	10 [10; 11]	0,023
	1 ч после облучения	15	6,7 ± 6,46	0,075	10 [9; 11]	0,013
	2 ч после облучения	15	13,3 ± 8,77	0,026	9 [8; 9]	0,30

* Значение р по сравнению с контрольной группой.

 

Использование бета-D-глюкана в профилактической схеме также оказывало значимое влияние на продолжительность жизни погибших от облучения мышей (табл. 1). При облучении в сублетальной дозе 6,5 Гр у многих животных репарационные механизмы, вероятно, не были критически повреждены, а жизнеспособность стволовых кроветворных клеток была сохранена на уровне, достаточно высоком для быстрого восстановления гемопоэза, что отразилось в высокой доле выживших после облучения мышей.

Данные о расчетных значениях летальных доз рентгеновского излучения в группах мышей без медикаментозной поддержки и с профилактическим или терапевтическим применением бета-D-глюкана, полученные методом пробит-анализа, представлены в табл. 2. При использовании бета-D-глюкана в профилактической схеме фактор изменения дозы по выживаемости мышей составил 1,16, при пострадиационном применении в обоих вариантах — 1,06. Повышение прогнозируемой величины СД_100/30 на фоне использования бета-D-глюкана носило сходную направленность — возрастание в 1,19 раза при введении бета-D-глюкана до облучения и в 1,05 и 1,13 раза при применении препарата через 1 или 2 ч после рентгеновского воздействия соответственно. Таким образом, подтверждены ранее полученные данные об эффективности исследуемого препарата при применении как в профилактической, так и терапевтической схемах, а также о преобладании у препарата радиопротекторных свойств над радиомитигаторными [19].

 

Таблица 2. Фактор изменения дозы рентгеновского излучения в условиях профилактического или терапевтического применения бета-D-глюкана в дозе 500 мг/кг

Table 2. Dose reduction factor of X-ray radiation during prophylactic or therapeutic use of beta-D-glucan (500 mg/kg)

Схема применения бета-D-глюкана	Вид СД	Величина СД	95 % доверительный интервал	ФИД	СД100
Контроль (облучение)	СД16	5,35 ± 0,02	5,11; 5,59	–	7,93
	СД50	6,38 ± 0,01	6,24; 6,51
	СД84	7,42 ± 0,01	7,34; 7,49
За 15–30 мин до облучения	СД16	6,09 ± 0,01	6,01; 6,18	1,17	9,44
	СД50	7,44 ± 0,003	7,40; 7,47
	СД84	8,78 ± 0,01	8,67; 8,88
Через 1 ч после облучения	СД16	5,95 ± 0,01	5,84; 6,06	1,06	8,37
	СД50	6,76 ± 0,01	6,70; 6,81
	СД84	7,56 ± 0,01	7,50; 7,62
Через 2 ч после облучения	СД16	5,70 ± 0,002	5,68; 5,72	1,06	8,99
	СД50	6,79 ± 0,001	6,79; 6,80
	СД84	7,89 ± 0,001	7,88; 7,90

Примечание: СД — смертельная доза; ФИД — фактор изменения дозы, отношение равноэффективных доз облучения, вызывающих гибель 50 % животных при применении радиозащитного препарата или без лечения.

 

В ходе проведения экспериментальных исследований дважды в неделю проводили мониторинг массы тела у животных после облучения и применения бета-D-глюкана. Представленные на рис. 1, а данные о динамике массы тела у интактных мышей и мышей после перорального применения бета-D-глюкана свидетельствуют, что однократное применение биоактивного соединения в дозе 500 мг/кг способствовало замедлению прироста массы тела грызунов в течение 12 сут. Эти результаты согласуются с представленными в научной литературе о способности грибных бета-D-глюканов, в частности из P. ostreatus, стабилизировать массу тела путем нормализации обмена глюкозы и липидов [25].

 

Рис. 1. Динамика массы тела у интактных мышей (К) и после однократного внутрижелудочного введения бета-D-глюкана (БГ; 500 мг/кг) (a); на фоне общего рентгеновского облучения в дозе 8 Гр (b), Ме [Q₂₅; Q₇₅]. * Отличия статистически значимы с группой «К», р < 0,005; ** то же, р < 0,01 (критерий Манна – Уитни)

Fig. 1. Dynamics of body weight of non-irradiated mice (a) and mice following 8 Gy X-rays irradiation (b) with the use of beta-D-glucan (BG; 500 mg/kg, intragastrically), Ме [Q₂₅; Q₇₅]. * р < 0.005 vs the group “K”; ** р < 0,01 (Mann–Whitney U test)

 

После острого радиационного воздействия в разных дозах изменение массы тела мышей характеризовалось дозозависимым снижением, наиболее выраженными были изменения на фоне облучения в диапазоне летальных доз 7,5 и 8,0 Гр. Динамику массы тела животных, облученных в дозе 8,0 Гр с применением бета-D-глюкана в профилактической и терапевтических схемах или без лечения, отражает рис. 1, b (данные после облучения в других дозах не приведены). Наиболее отчетливо модифицирующее действие бета-D-глюкана из P. ostreatus проявлялось при профилактическом применении препарата, которое способствовало постепенному восстановлению массы тела облученных мышей, начиная с 12-х суток после радиационного воздействия. В целом результаты мониторинга массы тела мышей контрольных и опытных групп позволяют заключить, что пероральное применение бета-D-глюкана снижало интенсивность радиационно-индуцированной потери массы тела у облученных животных.

На следующем этапе работы были изучены возможные механизмы противолучевой эффективности бета-D-глюкана путем оценки функционального состояния системы кроветворения в период разгара острой лучевой болезни, вызванной воздействием разных доз рентгеновского излучения. До начала эксперимента мышей разделили на сопоставимые по весу группы, включающие от 12 до 15 животных в зависимости от ожидаемой гибели к 9-м суткам после облучения в дозах 6,5 (n = 12), 7,0 (n = 13) или 7,8 Гр (n = 15). Гемопоэтические показатели также были оценены у интактных животных того же привоза и у мышей после однократного применения исследуемого препарата (по 10 голов в группе). Животным опытных групп внутрижелудочно вводили бета-D-глюкан в дозе 500 мг/кг за 15–30 мин до облучения, контрольным животным — воду в тот же срок и в том же объеме.

Оценку жизнеспособности гемопоэтических клеток-предшественников проводили по тесту эндогенного колониеобразования, заключающего в подсчете числа эндогенных КОЕ-с, образованных в результате заселения на селезенках облученных мышей мигрировавших из костного мозга стволовых клеток. Как видно из представленных на рис. 2 данных, количество эндогенных 9-суточных КОЕ-с значимо снижалось при повышении дозы рентгеновского излучения (p = 0,002; критерий Краскела – Уоллеса), что может быть обусловлено как гибелью высокорадиочувствительных клеток стволового и пролиферативного пулов костномозговой ниши, так и гибелью спленоцитов и нарушением гистоархитектоники селезенки в результате радиационного воздействия. При использовании бета-D-глюкана существенное повышение количества селезеночных эндогенных колоний по сравнению с нелечеными животными отмечалось после облучения мышей в дозе 7,8 Гр с 1 (0; 1) в контрольной группе до 2,5 (1; 6) на фоне применения препарата (р = 0,024; критерий Манна – Уитни). Введение бета-D-глюкана до облучения мышей в дозе 7 Гр способствовало увеличению числа КОЕ-с с 0,5 (0; 4) до 2 (1; 7), однако из-за большого процента гибели животных контрольной группы на 9-е сутки после облучения в этой дозе отличия не были значимыми. У большинства облученных в дозе 6,5 Гр мышей на фоне применения защитного препарата наблюдалось более высокое количество КОЕ-с, чем в контрольной группе, однако на селезенках некоторых животных отмечался рост сливающихся эндогенных колоний, что затруднило их подсчет и отразилось на результатах.

 

Рис. 2. Количество эндогенных селезеночных колоний на 9-е сутки после облучения у мышей без лечения (К) и после применения бета-D-глюкана (БГ; 500 мг/кг, внутрижелудочно)

Fig. 2. Number of endogenous splenic colonies on day 9 after X-rays irradiation in mice without treatment (K) and after intragastric administration of beta-D-glucan (BG; 500 mg/kg)

 

Данные об общем содержании лейкоцитов в крови мышей экспериментальных и опытных групп проиллюстрированы на рис. 3 (пунктирной линией обозначены границы физиологической нормы для данного вида животных). На 9-е сутки рентгеновского воздействия во всем диапазоне доз у облученных мышей отмечалась глубокая лейкопения. Снижение уровня лейкоцитов при воздействии излучения в дозе 6,5 Гр составило 10 % от исходного уровня, в дозах 7,0 и 7,8 Гр — 4,4 и 2,8 % соответственно (р = 0,012, критерий Краскела – Уоллеса). При применении бета-D-глюкана отмечалось повышение уровня лейкоцитов в периферической крови облученных животных: после облучения в дозе 7 Гр с 0,2 (0,1; 0,3) · 10⁹/л в контрольной группе до 0,3 (0,3; 0,5) · 10⁹/л, в дозе 7,8 Гр — с 0,2 (0,2; 0,3) · 10⁹/л до 0,3 (0,2; 0,5) · 10⁹/л.

 

Рис. 3. Содержание лейкоцитов в крови облученных мышей на 9-е сутки после облучения, применения бета-D-глюкана (БГ) в дозе 500 мг/кг, внутрижелудочно, и у интактных животных (К)

Fig. 3. Whole white blood counts on day 9 after X-rays irradiation in mice without treatment (K) and after intragastric administration of beta-D-glucan (BG; 500 mg/kg)

 

На 9-е сутки после острого воздействия рентгеновского излучения в летальных дозах у животных развивалась тромбоцитопения (рис. 4). Содержание тромбоцитов в группах мышей, облученных в дозах 7,0 и 7,8 Гр без лечения, снизилось до критических значений — в 3–3,5 раза по сравнению с интактными животными. На фоне профилактического применения бета-D-глюкана отмечалось ослабление тяжести тромбоцитопении, регистрируемое по более высокому уровню тромбоцитов в периферической крови облученных мышей, при этом у 80 и 60 % животных после облучения в дозах 7,0 и 7,8 Гр соответственно количество данных клеток крови оставалось в пределах физиологической нормы (на рис. 4 границы обозначены пунктирными линиями).

 

Рис. 4. Влияние бета-D-глюкана (БГ, 500 мг/кг) на содержание тромбоцитов в периферической крови мышей на 9-е сутки после общего облучения, Ме [Q₂₅; Q₇₅]. * Отличия статистически значимы с группой «0 Гр», р < 0,005; ** то же, р < 0,01 (критерий Манна – Уитни). К — контроль (облучение без применения бета-D-глюкана)

Fig. 4. Effect of beta-D-glucan (BG; 500 mg/kg) on the number of platelets in the blood of mice on day 9 after total body X-rays irradiation, Ме [Q₂₅; Q₇₅]. * р < 0,005 vs the group “0 Gy”; ** р < 0,01 (Mann–Whitney U test). K – irradiation without beta-D-glucan

 

Уровень эритроцитов в периферической крови мышей на 9-е сутки после рентгеновского воздействия в разных дозах еще не подвергался существенным изменениям (табл. 3), что вполне закономерно, поскольку клетки функционального пула обладают высокой радиорезистентностью (среднелетальная доза, при которой выживает 37 % клеток, составляет >15 Гр; для стволовых и коммитированных клеток костного мозга — 1,5–1,9 Гр) [26], а эритроциты являются наиболее долгоживущими клетками крови и находятся в циркуляции около 100–120 сут. Вместе с тем полученные данные отчетливо демонстрируют нарастание нарушений эритропоэза, о чем свидетельствовало дозозависимое снижение количества красных клеток крови, при этом применение радиозащитного препарата способствовало поддержанию их более высокого уровня. Изменения уровня гемоглобина и гематокрита по направленности и выраженности носили сходный с эритроцитами характер.

 

Таблица 3. Показатели периферической крови мышей у интактных животных (К) и при применении бета-D-глюкана (БГ, 500 мг/кг, внутрижелудочно) на 9-е сутки после общего рентгеновского облучения, Ме [Q₂₅; Q₇₅]

Table 3. Effect of beta-D-glucan (BG; 500 mg/kg, intragastrically) on the blood parameters of mice on day 9 after total body X-rays irradiation, Ме [Q₂₅; Q₇₅]

Группы животных	Эритроциты, ×1012/л (норма 7–11)	Гемоглобин, г/л (норма 95–168)	Гематокрит, % (норма 35–50)
К	9,9 [9, 54; 10, 4]	152 [138; 166]	45,3 [43, 8; 49]
БГ	10,3 [9, 34; 10, 9]	150 [146; 158]	47,4 [43, 8; 50]
6,5 Гр	8,78 [8, 58; 9, 43]***, ###	118 [106; 129]**, ##	38,7 [31, 5; 41, 1]**, ##
БГ + 6,5 Гр	8,67 [7, 56; 9, 34]***, ###	130 [126; 138]*	40 [31, 5; 41, 1]***, ###
7 Гр	7,63 [5, 76; 9, 79]*, ##	92 [88; 123]**, ###	37,9 [36; 39, 6]#
БГ + 7 Гр	9,01 [5, 76; 9, 54]	121 [105; 132]**, ##	38,7 [31, 8; 42]***, ##
7,8 Гр	6,62 [6, 33;8, 31]***, ##	80 [71; 106]##	30,7 [32, 4; 40, 2]***, ##
БГ + 7,8 Гр	7,78 [7, 27; 8, 57]*, ##	118 [106; 137]*, #	35,7 [26, 7; 40, 8]***, #

* Отличия статистически значимы в сравнении с группой «бета-D-глюкан» (БГ), р < 0,05; ** то же, р < 0,01; *** то же, р < 0,005; ^# отличия статистически значимы в сравнении с группой «интактные», р < 0,05; ^## то же, р < 0,005; ^### то же, р < 0,001 (критерий Манна – Уитни).

 

Проведенные исследования подтверждают ранее полученные данные о противолучевой активности бета-D-глюкан-содержащего экстракта, полученного из базидиального гриба P. ostreatus, после однократного применения и перорального пути поступления в организм. Результаты количественной оценки величины противолучевого эффекта путем расчета фактора изменения дозы ионизирующего излучения показали, что препарат может быть использован как в профилактической схеме в целях повышения радиорезистентности организма, так и в качестве средства ранней терапии костномозговой формы острой лучевой болезни.

Острый радиационный костномозговой синдром, как известно, развивается при облучении всего тела (или большей его части) в дозах 1–10 Гр, при этом степень повреждения костного мозга, обеспечивающего в физиологических условиях поддержание постоянства количества клеток крови, и состоятельность репарационных механизмов определяют исход лучевого поражения и жизнеспособность организма. В настоящее время в мире для лечения в клинических условиях постлучевой супрессии гемопоэза одобрены гемопоэтические факторы роста – филграстим (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, Г-КСФ), сарграмостим (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, ГМ-КСФ) и пегфилграстим (пегилированный Г-КСФ) [27], которые путем стимулирования гемопоэтических прогениторных клеток способствуют формированию жизнеобеспечивающего пула клеточных элементов крови, преимущественно миелоидного ряда. Несмотря на то что данные препараты существенно повышают выживаемость при костномозговой форме острой лучевой болезни, они неспособны обеспечить достаточную защиту других органов и систем организма и предотвратить развитие отдаленных последствий острого лучевого воздействия, включая несостоятельность иммунной и кроветворной систем [28]. Потеря иммунокомпетентных клеток и снижение их функциональной способности может привести к развитию тяжелых оппортунистических инфекций и полиорганной дисфункции, которые без адекватной терапии имеют фатальные последствия. Поэтому основная стратегия лечения гемопоэтического синдрома заключается в использовании так называемых биологических модификаторов, способных оказывать комплексное воздействие на организм путем модуляции различных внутри- и межклеточных сигнальных путей, к которым относятся некоторые классы природных соединений, включая бета-D-глюканы.

Одним из первых описанных в литературе и в настоящее время достаточно хорошо изученных биологических эффектов природных бета-D-глюканов является стимулирующее действие на костный мозг и его клеточные элементы [29]. В работах ряда авторов показана способность бета-D-глюканов, выделенных из дрожжей Saccharomyces cerevisiae и некоторых базидиомицетов, стимулировать пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и гемопоэтических клеток-предшественников в условиях радиационного воздействия [30–33], в связи с чем в данном исследовании с помощью теста эндогенного колониеобразования и оценки показателей периферической крови облученных мышей было изучено влияние бета-D-глюкана из базидиомицета P. ostreatus на состояние системы кроветворения. Подсчет эндогенных КОЕ-с позволяет оценить эффективность применения противолучевых препаратов, поскольку количество образовавшихся колоний пропорционально числу сохранивших жизнеспособность стволовых гемопоэтических клеток-предшественников [22].

Полученные в работе данные показали, что однократное пероральное применение бета-D-глюкана из P. ostreatus в дозе 500 мг/кг за 15–30 мин до облучения мышей стимулировало рост эндогенных КОЕ-с, которые, как известно, путем экстрамедуллярного гемопоэза участвуют в восстановлении пула циркулирующих клеток крови. Возрастание числа эндогенных колоний при применении препарата по сравнению с группами нелеченых животных может свидетельствовать о защитном действии бета-D-глюкана на стволовые клетки костного мозга и о снижении их радиационно-индуцированной гибели. Повышение уровня лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови мышей при профилактическом применении полисахарида в условиях острого радиационного воздействия подтверждает гемопоэз-стимулирующее действие препарата.

Таким образом, на основании результатов исследования можно заключить, что повышение выживаемости мышей с острым радиационным костномозговым синдромом, вызванным летальными дозами рентгеновского излучения, при применении бета-D-глюкана из P. ostreatus обусловлено, прежде всего, защитным действием на костный мозг и стимуляцией восстановления гемопоэза. Однако, учитывая широкий спектр фармакологического действия на организм человека и млекопитающих грибных бета-D-глюканов [10–14], обусловленный эволюционно сложившимся разнообразием рецепторов, участвующих в их распознавании и локализованных на мембранах иммунных клеток разных типов [34], вполне очевидно, что противолучевые эффекты являются результатом комплексного воздействия на разные стороны патологического процесса. В связи с этим целесообразны дальнейшее изучение иммунофармакологических механизмов радиомодифицирующего действия бета-D-глюкана из гриба P. ostreatus и разработка противолучевой композиции на его основе.

Заключение

Пероральное применение содержащего бета-D-глюкан экстракта из пищевого гриба P. ostreatus обеспечивало повышение выживаемости мышей после облучения в летальных дозах, снижение интенсивности вызванной лучевым воздействием потери массы тела и облегчение течения острого радиационного гемопоэтического синдрома. При использовании полисахаридного комплекса в профилактической схеме фактор изменения дозы рентгеновского излучения составил 1,2, в терапевтической — 1,1, что свидетельствует о возможности применения препарата как превентивно в целях повышения радиорезистентности организма, так и в качестве средства ранней терапии костномозговой формы острой лучевой болезни. Противолучевая эффективность бета-D-глюкана ассоциировалась с повышением жизнеспособности стволовых клеток костного мозга, снижением тяжести лейкопении и тромбоцитопении у облученных мышей.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках реализации государственной программы стратегического академического лидерства «Приоритет-2030» (научно-исследовательский проект «Разработка новых медицинских средств профилактики и лечения нарушений здоровья при воздействии радиационных факторов»).

Соблюдение этических норм. Исследования проведены с соблюдением принципов гуманного обращения с животными в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. План проведения экспериментов одобрен на заседании независимого Этического комитета при Военно-медицинской академии от 19 июля 2022 г. (протокол № 267).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: Е.В. Мурзина, Г.А. Софронов, А.С. Симбирцев, Е.В. Воробейчиков — концепция и дизайн исследования; Е.В. Мурзина — обзор результатов, написание текста; Г.А. Софронов, А.С. Симбирцев, Н.В. Аксенова, Г.Г. Загородников, Н.А. Климов, Е.В. Воробейчиков — подготовка текста к публикации; Е.В. Мурзина, Н.В. Аксенова, Н.А. Жирнова, Е.В. Дмитриева, О.М. Веселова — получение и статистический анализ данных; Г.Г. Загородников — анализ данных; О.М. Веселова, Н.А. Климов, Е.В. Воробейчиков — сбор материалов для исследования.

Additional information

Funding source. The study was conducted within the framework of the state program of strategic academic leadership “Priority-2030” (research project “Development of medical countermeasures for radiation-induced health disorders”).

Ethical approval. The research was carried out in accordance with Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of the European Union of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. The experimental plan was approved at a meeting of the Independent Ethics Committee at the Military Medical Academy on July 19, 2022 (Protocol No. 267).

Conflict of interest. The authors declare the absence of explicit and potential conflicts of interest associated with the publication of this article.

Authors’ contribution. All authors made significant contributions to concept development, research and paper preparation, read and approved the final version before publication. The largest contribution is distributed as follows: E.V. Murzina, G.A. Sofronov, A.S. Simbirtsev, E.V. Vorobeychikov — concept and design of the study; E.V. Murzina — data acquisition and analysis, writing; G.A. Sofronov, A.S. Simbirtsev, N.V. Aksenova, G.G. Zagorodnikov, N.A. Klimov, E.V. Vorobeychikov — editing; E.V. Murzina, N.V. Aksenova, N.A. Zhirnova, E.V. Dmitrieva, O.M. Veselova — data acquisition and statistical analysis; G.G. Zagorodnikov — data analysis; O.M. Veselova, N.A. Klimov, E.V. Vorobeychikov — collection and processing of material.

Список сокращений

СД — смертельная доза; КОЕ — колониеобразующая единица; Гр — грей, единица поглощенной дозы ионизирующего излучения.

About the authors

Elena V. Murzina

Kirov Military Medical Academy

Email: elenmurzina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7052-3665
SPIN-code: 5188-0797

Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate of the Research Department of Experimental Medicine, Research Center

Russian Federation, Saint Petersburg

Genrikh A. Sofronov

Kirov Military Medical Academy; Институт экспериментальной медицины

Author for correspondence.
Email: gasofronov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8587-1328
SPIN-code: 7334-4881
Scopus Author ID: 7003953555
ResearcherId: G-4791-2015

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Head of the Research Laboratory of Medicinal and Environmental Toxicology of the Research Department of Experimental Medicine, Research Center; Scientific Director of the Institute

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Andrey S. Simbirtsev

Institute of Experimental Medicine

Email: simbas@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8228-4240
SPIN-code: 2064-7584
Scopus Author ID: 7003758888
ResearcherId: K-5061-2014

MD, Dr. Sci. (Med.), Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Chief Research Associate of the Department of General Pathology and Pathological Physiology

Russian Federation, Saint Petersburg

Natalia V. Aksenova

Kirov Military Medical Academy

Email: nataaks@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5645-7072
SPIN-code: 6821-6887

MD, Cand. Sci. (Med.), Statistician of the Research Department (All-Army Medical Register of the Ministry of Defense of the Russian Federation), Research Center

Russian Federation, Saint Petersburg

Gennady G. Zagorodnikov

Kirov Military Medical Academy

Email: gen73zag@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4859-0519
SPIN-code: 4465-5572

MD, Dr. Sci. (Med.), Head of the Research Department (All-Army Medical Register of the Ministry of Defense of the Russian Federation), Research Center

Russian Federation, Saint Petersburg

Olga M. Veselova

Kirov Military Medical Academy

Email: veselova28@mail.ru
SPIN-code: 4864-8391

Research Associate of the Research Department of Experimental Medicine, Research Center

Russian Federation, Saint Petersburg

Natalya A. Zhirnova

Kirov Military Medical Academy

Email: ji65@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9948-6260
SPIN-code: 8308-2139
ResearcherId: I-4804-2016

Cand. Sci. (Biol.), Research Associate of the Research Department of Experimental Medicine, Research Center

Russian Federation, Saint Petersburg

Elena V. Dmitrieva

Kirov Military Medical Academy

Email: ev.dmitrieva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6514-7837
SPIN-code: 6759-2407

Junior Research Associate of the Research Department of Experimental Medicine, Research Center

Russian Federation, Saint Petersburg

Nicolay A. Klimov

Institute of Experimental Medicine

Email: nklimov@mail.ru
SPIN-code: 6093-7430

MD, Cand. Sci. (Med.), Leading Research Associate of the Department of General Pathology and Pathological Physiology

Russian Federation, Saint Petersburg

Evgeniy V. Vorobeychikov

Saint-Petersburg State Institute of Technology; Research and Production Company “BIOS”

Email: evorobeychikov@gmail.com
SPIN-code: 3756-7955

MD, Cand. Sci. (Med.), Senior Research Associate of the Department of Technology of Microbiological Synthesis; Deputy General Director

Russian Federation, Saint-Petersburg; Saint Petersburg

References

Supplementary files