Synergy of action of antimicrobial peptides PG-1 and ChBac3.4 with antiseptics against antibiotic-resistant bacteria

Cover Page
  • Authors: Zharkova M.S.1, Umnyakova E.S.1, Afinogenova A.G.2,3, Afinogenov G.E.3, Kolobov A.A.4, Shamova O.V.1
  • Affiliations:
    1. Institute of Experimental Medicine
    2. Saint Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology
    3. Saint Petersburg State University
    4. State Research Institute of Highly Pure Biopreparations
  • Issue: Vol 18, No 4 (2018)
  • Pages: 47-57
  • Section: Articles
  • URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/11685
  • DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ18447-57
  • Cite item

Abstract


We investigated the combined effects of antimicrobial peptides PG-1 and ChBac3.4 with antiseptics (sodium hypochlorite, dioxidine, prontosan, poviargolum, and etidronic acid) to identify combinations that display synergistic antimicrobial activity against antibiotic-resistant bacteria. We used the checker-board titration method to calculate fractional inhibitory concentration indices, and based on the indices the type of combined action was determined. The combined effect on the metabolic activity of bacteria was evaluated using the fluorescent marker resazurin, and the effect on the permeability of bacterial membranes for chromogenic markers was studied spectrophotometrically. The combined hemolytic activity of the combinations was investigated. Sodium hypochlorite was shown to be antagonistic with both antimicrobial peptides. With other antiseptics, combined action was characterized by additivity or synergy. Synergy was most pronounced with the preparation of highly dispersed silver poviargolum. Antiseptics accelerate the development of the antimicrobial effect of antimicrobial peptides but do not significantly affect the dynamics of the membranolytic action of antimicrobial peptides on bacterial cells. Synergy of hemolytic activity is rare. Thus, the combined use of antimicrobial peptides and antiseptics is promising for combating antibiotic-resistant bacteria and can be used to reduce the toxic effects of these compounds.


Full Text

Введение

В процессе мутагенеза и естественного отбора, а также под воздействием сублетальных концентраций антимикробных препаратов микроорганизмы могут приобретать к ним устойчивость, способную затем закрепляться в популяции. Благодаря возможности горизонтального переноса генов между различными видами микроорганизмов такая устойчивость может быстро распространяться среди патогенных штаммов. Антимикробные препараты, вошедшие начиная с 40-х гг. ХХ в. в широкую практику, во многом определяют лицо современной медицины. Распространение устойчивости является угрозой не только для успешного лечения непосредственно инфекционных заболеваний, но и для проведения любых медицинских манипуляций, связанных с риском инфекционных осложнений, в частности для хирургического вмешательства [1, 2]. Таким образом, борьба с распространением микробной устойчивости представляет собой общемировую задачу, стоящую перед современной медицинской наукой.

Согласно утвержденному Всемирной организацией здравоохранения плану по борьбе с антимикробной резистентностью, основными стратегиями для достижения поставленной цели являются контроль за разумным применением существующих антибиотиков и разработка новых эффективных антимикробных препаратов или их комбинаций [2]. Антимикробные пептиды (АМП) — эффекторные молекулы, принимающие участие в инактивации микробных патогенов системой врожденного иммунитета, — перспективный объект для создания новых противобактериальных средств [3–5]. Основным механизмом действия АМП является неферментативное повреждение ими мембран микроорганизмов. За счет относительной неспецифичности мишени они обладают широким спектром действия, включающим штаммы со множественной лекарственной устойчивостью [6, 7]. Тем не менее АМП обладают рядом недостатков, в том числе достаточно низкой селективностью: они часто проявляют токсические эффекты в отношении не только микробных, но и эукариотических клеток [8, 9]. Также существуют проблемы, касающиеся фармакокинетики данных пептидов: способов введения, таргетной доставки и обеспечения стабильности в различных биологических жидкостях [3]. Таким образом, наиболее доступной областью для внедрения препаратов на основе АМП в настоящее время является местное применение.

В свете этого факта представляет интерес вопрос взаимодействия АМП с антисептическими препаратами. Антисептики находят широкое применение в лечении гнойно-воспалительных заболеваний — при локальной обработке очагов воспаления на поверхности кожи и слизистых. Механизм их действия, как правило, также менее специфичен, чем у антибиотиков, они активны против многих антибиотикоустойчивых штаммов, а выработка устойчивой резистентности к самим антисептикам считается маловероятной. Тем не менее антисептики часто проявляют и токсические эффекты, которые, при возможности, желательно снизить [10–12].

Цель работы

В данном исследовании было рассмотрено совместное действие АМП и ряда антисептических препаратов с целью выявить возможности их синергетического взаимодействия в отношении антибиотикоустойчивых штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий. Также проводилась оценка, усиливается ли гемолитический эффект данных веществ в таких сочетаниях. С одной стороны, синергетические комбинации могут быть использованы для более эффективного преодоления устойчивости микроорганизмов. С другой стороны, синергетическое усиление активности препаратов позволяет снизить их эффективные дозы, повысить селективность антибактериального действия и уменьшить токсичность в отношении эукариотических клеток.

Для исследования были выбраны два антимикробных пептида: протегрин-1 свиньи (PG-1) и бактенецин козы массой 3,4 кДа (ChBac3.4). PG-1 обладает выраженным мембранолитическим типом действия, но также проявляет высокую гемолитическую и цитотоксическую активность [9, 13]. ChBac3.4 относится к группе обогащенных пролином пептидов, которые отличаются низкой токсичностью. Помимо мембранолитической активности, демонстрируемой ими в высоких концентрациях, пептиды данной группы могут действовать на внутриклеточные мишени: они способны нарушать шаперон-зависимый фолдинг белков, а также блокировать белковый синтез за счет связывания в аминоацильном центре бактериальных рибосом [14–16].

Среди антисептических средств рассматривали гипохлорит натрия, диоксидин (гидроксиметилхиноксилиндиоксид), пронтосан (0,1 % раствор полиаминопропила бигуанида (полигексанида) и ундециленового амидопропил-бетаина), повиаргол (высокодисперсный препарат серебра, стабилизированного поливинилпирролидоном) и этидроновую кислоту. Хотя этидроновая кислота относится к бисфосфонатам, которые традиционно применяются при лечении нарушений метаболизма в костной ткани, утверждена возможность ее применения в качестве антисептического средства при профилактике и лечении воспалительных заболеваний полости рта [17]. Также для этидроновой кислоты была выявлена способность ингибировать бактериальные β-лактамазы, включая металло-β-лактамазы [18].

Материалы и методы исследования

Использованные в работе АМП были получены путем твердофазного химического синтеза. ChBac3.4 был синтезирован с использованием Fmoc-стратегии по стандартной методике на пептидном синтезаторе Liberty microwave (CEM Corp., США). Очистку синтезированного пептида проводили с помощью полупрепаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на колонке Waters SymmetryPrep C18, 100 Å, 7 мкм, 9 × 300 мм (хроматограф Gilson, Франция). Согласно результатам аналитической ОФ ВЭЖХ на колонке Waters DeltaPak C18, 5 мкм, 100 Å (3,9 × 150 мм) чистота препарата составляла более 98 %. Чистоту препарата и соответствие молекулярной массы подтверждали также масс-спектрометрическим анализом MALDI-TOF. PG-1 был любезно предоставлен профессором Р. Лерером (Калифорнийский университет Лос-Анджелеса, США).

Грамотрицательный лабораторный штамм Escherichia coli ML-35p (устойчивый к ампициллину) был любезно предоставлен профессором Р. Лерером (Калифорнийский университет Лос-Анджелеса, США); клинические изоляты бактерий, а также сведения об их устойчивости к антибиотикам — сотрудниками МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова (эпидермальные стафилококки) и Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (остальные изоляты). Грамотрицательные клинические изоляты были представлены Escherichia coli ESBL (extended spectrum beta-lactamase, β-лактамаза расширенного спектра) 521/17 (устойчива к ампициллину, амоксициллину / клавулановой кислоте, цефотаксиму, цефтазидиму, цефелиму, азтреонаму, нетилмицину, ципрофлоксацину, триметоприму/сульфаметоксазолу), Acinetobacter baumannii 7226/16 (устойчива к имипенему, гентамицину, тобрамицину, ципрофлоксацину, триметоприму/сульфаметоксазолу), Pseudomonas aeruginosa MDR (multiple drug resistance, множественная устойчивость к антибиотикам) 522/17 (устойчива к меропенему, цефтазидиму, цефелиму, амикацину, гентамицину, нетилмицину, ципрофлоксацину, колистину), Klebsiella pneumoniae ESBL 344/17 (устойчива к ампициллину). Грамположительные изоляты включали штаммы Staphylococcus epidermidis 9/17 (устойчив к оксациллину, азитромицину, тобрамицину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину, норфлоксацину), 10/17 (устойчив к оксациллину, тобрамицину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину), 24/17 (утойчив к оксациллину, азитромицину, тобрамицину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину, норфлоксацину) и 33/17 (устойчив к оксациллину, ципрофлоксацину, офлоксацину, левофлоксацину, норфлоксацину), а также Staphylococcus aureus 1399/17 (устойчив к ампициллину, оксациллину, амикацину, гентамицину, офлоксацину).

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) исследуемых веществ определяли методом серийных разведений в жидкой питательной среде, содержащей микроорганизмы, по стандартной методике, оптимизированной для пептидных препаратов [19]. Бактерии культивировали в 2,1 % бульоне Мюллера – Хинтон M391 (HiMedia, Индия). Серийные разведения веществ производили в стерильных 60-луночных микрокамерах Терасаки; для разведения использовали 10 мМ натрий-фосфатный буфер pH 7,4, содержащий 0,1 % бычий сывороточный альбумин (БСА). Микропланшеты также предварительно инкубировали в течение часа с 0,1 % БСА для предотвращения неспецифического связывания пептидов со стенками лунок. В экспериментальные и контрольные (содержащие буфер без антимикробных веществ) лунки вносили эквивалентный объем суспензии бактерий в 2,1 % бульоне Мюллера – Хинтон в концентрации 1 × 105 КОЕ/мл.

Для определения характера совместного антимикробного действия использовали метод серийных разведений по схеме «шахматной доски» [20, 21]. В соответствии с данной схемой одно из исследуемой пары веществ разводили в лунках планшета по столбцам (горизонтально), второе — по срокам (вертикально), вследствие чего получали палитру сочетаний двух веществ с различным соотношением концентраций. В крайний столбец и крайнюю строку при этом вместо второго вещества вносился соответствующий объем буфера — чтобы иметь возможность контролировать значения МИК индивидуальных веществ непосредственно в эксперименте. На основании результатов, полученных данным методом, рассчитывали индексы фракционной ингибирующей концентрации (иФИК) в соответствии с формулой

иФИК = [A]/МИКA + [B]/МИКB,

где МИКA и МИКB — МИКи индивидуальных веществ A и B, а [A] и [B] — фракционные ингибирующие концентрации A и B в их комбинации. В зависимости от значения индексов совместное действие классифицировали как синергизм (иФИК ≤ 0,5), аддитивность (0,5 < иФИК ≤ 1,0), независимое действие (1 < иФИК ≤ 2) или антагонизм (иФИК > 2).

Использовали спектрофотометрический метод оценки проницаемости наружной и внутренней мембран E. coli ML-35p для хромогенных маркеров, описанный ранее [22, 23]. В качестве маркера проницаемости для наружной мембраны использовался субстрат периплазматической β-лактамазы нитроцефин (Sigma-Aldrich, США), для внутренней — субстрат цитоплазматической β-галактозидазы О-нитрофенил-β-D-галактопиранозид (ONPG; Sigma-Aldrich, США). Детекцию окрашенных продуктов расщепления производили спектрофотометрически на длинах волн 486 нм и 420 нм соответственно. В отсутствии пермеаз лактозы у рассматриваемого бактериального штамма при неповрежденной мембране маркерные субстраты не проникали к расщепляющим ферментам самопроизвольно. Исследование проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах с прозрачным дном. Лунки содержали 10 мМ натрий-фосфатный буфер с 100 мМ NaCl, E. coli ML-35p в стационарной фазе роста в концентрации 2,5 × 107 КОЕ/мл, исследуемые препараты в концентрациях эквивалентных 1/2 или 1/4 от их МИК, либо соответствующий объем буфера (в контроле), а также хромогенный субстрат (нитроцефин в концентрации 20 мкМ или ONPG в концентрации 2,5 мМ). Оптическую плотность (OD) измеряли на планшетном спектрофотометре SpectraMax 250 (Molecular Devices, США) с частотой 1 раз в минуту. Измерения проводили при постоянном перемешивании при +37 °C и начинали сразу после внесения бактериальной суспензии. Бактерию непосредственно перед экспериментом отмывали от питательной среды путем центрифугирования при 600 g в течение 10 минут с охлаждением до +4 °C и ресуспендирования в используемом буфере.

Для отслеживания метаболической активности бактерий под действием исследуемых препаратов и их сочетаний использовали метаболический маркер дыхательной активности резазурин [24]. В присутствии активно метаболизирующих клеток происходит реакция восстановления резазурина до флуоресцентного продукта — резоруфина. Интенсивность флуоресценции измеряли с помощью планшетного спектрофлуориметра Gemini EM (Molecular Devices, США) с частотой 1 раз в минуту при длине волны 590 нм с возбуждением на 560 нм при температуре +37 °С и постоянном перемешивании. Состав проб был аналогичен исследованию проницаемости мембран за исключением маркера (резазурин в концентрации 120 мкМ) и дополнительного внесения 0,1 % питательного бульона Мюллера – Хинтон.

Гемолитическую активность образцов определяли путем их инкубации с 2,5 об.% суспензией отмытых от плазмы эритроцитов человека по стандартной методике [19]. Забор периферической крови для получения суспензии производили у здоровых доноров. Гепаринизированную кровь 1 раз отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР) с 4 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и еще трижды ЗФР без дополнительных компонентов. Центрифугирование при отмывке проводили при 350 g в течение 10 минут с охлаждением до +4 °C; ресуспендировали эритроциты в 10 мл буфера. Осадок после последнего центрифугирования принимали за 100 % эритроцитов и использовали для приготовления суспензии необходимой концентрации в ЗФР. Инкубацию проб с суспензией эритроцитов проводили в течение 30 минут при +37 °C, после чего сравнивали величину поглощения для супернатантов тестовых проб и контрольных образцов интактных эритроцитов на длине волны 540 нм, чтобы оценить количество вышедшего в раствор гемоглобина.

Чтобы определить характер совместного гемолитического действия, использовали подход, сходный с примененным при исследовании антимикробной активности. Выявляли минимальную эффективную концентрацию (МЭК) исследуемых препаратов, при которой проявлялось статистически значимое отличие от интактного контроля эритроцитов (критерий Манна – Уитни n1, n2 = 3; p < 0,05), после чего исследовали сочетания веществ в концентрациях 1/2 МЭКА + 1/2 МЭКВ, что соответствует индексу фракционной эффективной концентрации иФЭК = 1 (пороговое значение для аддитивности), и 1/4 МЭКА + 1/4 МЭКВ, что соответствует иФЭК = 0,5 (пороговое значение для синергизма). При обнаружении статистически значимого отличия от интактного контроля (критерий Манна – Уитни n1, n2 = 3; p < 0,05) для обоих сочетаний взаимодействие препаратов считали синергетическим; если различие наблюдалось лишь для комбинации 1/2 МЭКА + 1/2 МЭКВ, — аддитивным; в остальных случаях гемолитическое действие принимали независимым.

Значения МИК и иФИК для антимикробной активности и МЭК и иФЭК для гемолитической активности рассчитывали как медианы по данным 3–5 независимых экспериментов. Все эксперименты проводили с использованием 2–3 параллельных проб.

Результаты и их обсуждение

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) характеризующие индивидуальное антибактериальное действие антимикробных пептидов PG-1, ChBac3.4 и антисептических агентов в отношении грамположительных и грамотрицательных антибиотикоустойчивых бактерий приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Минимальные ингибирующие концентрации веществ в отношении антибиотикоустойчивых грамположительных и грамотрицательных бактерий

Бактерия

PG-1

(мкМ)

ChBac3.4

(мкМ)

Этидроновая кислота

(мг/мл)

Диоксидин

(мкг/мл)

Повиаргол

(мкг/мл)

Пронтосан

(мкг/мл)

E. coli ML-35p

0,8

3,12

50

15,62

78,12

0,39

E. coli ESBL 521/17

0,4

6,25

50

15,62

78,12

0,39

P. aeruginosa MDR 522/17

6,25

6,25

25

62,5

78,12

3,91

K. pneumoniae ESBL 344/17

3,12

6,25

50

31,25

78,12

1,95

A. baumannii 7226/16

6,25

12,5

12,5

31,25

78,12

31,25

S. epidermidis 9/17

0,8

6,25

5,0

1000

312,5

0,2

S. epidermidis 10/17

3,12

12,5

2,5

125

312,5

0,2

S. epidermidis 24/17

1,6

3,12

5,0

500

156,25

0,39

S. epidermidis 33/17

3,12

3,12

5,0

500

156,25

0,39

S. aureus 1399/17

0,4

12,5

50

250

156,25

0,62

Примечание. ChBac3.4 — бактенецин домашней козы (Capra hircus) массой 3,4 кДа, PG-1 — протегрин-1 свиньи.

 

Этидроновая кислота в отношении ряда клинических изолятов показала несколько сниженную активность по сравнению с рекомендуемой терапевтической концентрацией 2 % (20 мг/мл) [17]. Также можно отметить, что диоксидин был заметно более эффективен против грамотрицательных бактерий, чем против грамположительных, для которых МИКи этого антисептика были выше на 1–2 порядка. В меньшей степени подобный эффект наблюдался для повиаргола. В сравнении с другими клиническими изолятами штамм A. baumannii7226/16 показал повышенную устойчивость к полигексанидному антисептическому препарату пронтосану, тем не менее МИК пронтосана в отношении данной бактерии был существенно ниже 0,1 % (1 мг/мл) — концентрации полигексанида в коммерческом растворе «Пронтосан» для промывания ран. В целом, все препараты, как антисептики, так и антимикробные пептиды, показали активность в отношении рассматриваемых антибиотикоустойчивых бактерий.

При исследовании антибактериального действия сочетаний АМП с антисептиками было обнаружено, что гипохлорит натрия является антагонистом как для PG-1, так и для ChBac3.4, поэтому он был исключен из дальнейшего рассмотрения, и данные о его активности не приводятся. При сочетанном применении АМП с гипохлоритом натрия концентрации компонентов, необходимые для подавления роста большинства рассмотренных бактерий, возрастали в 4 и более раз. Данный феномен, вероятно, является следствием того, что высокая концентрация гипохлорит-анионов может препятствовать эффективному связыванию положительно заряженных молекул АМП с отрицательно заряженными компонентами бактериальных мембран. Таким образом, антимикробные вещества в подобном сочетании частично нейтрализуют друг друга.

Взаимодействие АМП с другими рассматриваемыми антисептиками характеризовалось в основном аддитивностью или синергизмом. Минимальные значения иФИК для исследованных комбинаций представлены в табл. 2. Наиболее широко случаи синергизма были выявлены при сочетанном действии АМП с повиарголом против как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Данные о подобном синергетическом взаимодействии согласуются с проведенными нами ранее исследованиями антибактериальной активности комбинаций АМП с наночастицами серебра большего размера, а также их конъюгатов [25]. Также синергизм был обнаружен для сочетания диоксидина с PG-1 в отношении грамположительных изолятов и сочетания диоксидина с ChBac3.4 в отношении грамотрицательных штаммов A. baumannii и K. pneumoniae. Против ряда грамположительных бактерий также был показан синергетический эффект АМП с пронтосаном.

 

Таблица 2. Индексы фракционной ингибирующей концентрации для сочетаний антимикробных пептидов и антисептиков в отношении антибиотикоустойчивых грамположительных и грамотрицательных бактерий

Бактерия

АМП

Антисептик

диоксидин

пронтосан

повиаргол

этидроновая кислота

E. coli

ML-35p

PG-1

1,125

0,5

0,5

0,5

ChBac3.4

0,625

0,75

0,75

0,5

E. coli

ESBL 521/17

PG-1

1,125

0,75

0,562

0,562

ChBac3.4

0,75

1

0,375

0,25

A. baumannii 7226/16

PG-1

0,75

0,625

0,625

1

ChBac3.4

0,5

0,75

0,75

0,5

P. aeruginosa

MDR 522/17

PG-1

1

1

0,5

1,125

ChBac3.4

1

0,75

0,625

0,75

K. pneumoniae

ESBL 344/17

PG-1

0,625

0,75

0,5

1,125

ChBac3.4

0,5

0,625

0,5

1

S. epidermidis

9/17

PG-1

0,5

0,625

0,625

1

ChBac3.4

0,75

0,625

0,5

0,625

S. epidermidis

10/17

PG-1

0,75

0,562

0,562

0,75

ChBac3.4

0,75

0,75

0,25

0,75

S. epidermidis

24/17

PG-1

0,5

0,5

0,562

1

ChBac3.4

0,625

0,5

0,625

0,625

S. epidermidis

33/17

PG-1

0,5

0,5

0,5

0,625

ChBac3.4

0,625

0,625

0,375

0,5

S. aureus

1399/17

PG-1

0,625

1

0,5

0,5

ChBac3.4

0,75

0,375

0,5

0,375

Примечание: АМП — антимикробный пептид, ChBac3.4 — бактенецин домашней козы (Capra hircus) массой 3,4 кДа, PG-1 — протегрин-1 свиньи. Значения, соответствующие синергизму, выделены полужирным шрифтом.

 

Синергизм антимикробного действия этидроновой кислоты как с PG-1, так и с ChBac3.4 был выявлен в отношении лабораторного и клинического штаммов E. coli и штамма S. aureus 1399/17, а в сочетании с ChBac3.4 также в отношении A. baumannii 7226/16 и S. epidermidis 33/17. Интересно отметить, что ранее нами был описан синергизм в действии антимикробного пептида ChBac3.4 и β-лактамного антибиотика оксациллина в отношении устойчивого к последнему штамма MRSA ATCC 33591 [26]. Также случаи синергетического взаимодействия АМП и β-лактамных антибиотиков достаточно широко описаны в литературе [27–29], что указывает на дополнительные перспективы при рассмотрении тройных сочетаний, включающих АМП, антибиотик и этидроновую кислоту, которая способна ингибировать β-лактамазы бактерий.

Поскольку метод серийных разведений дает возможность оценивать антибактериальный эффект препаратов лишь спустя 18–20 часов после начала воздействия, был использован также флуориметрический метод оценки метаболической активности бактерий, чтобы проанализировать антибактериальную активность сочетаний АМП и антисептиков в динамике. Примеры типичных кривых, полученных при исследовании метаболической активности E. coli ML-35p под действием сочетаний АМП и антисептиков в подпороговых концентрациях, равных 1/4 МИК данных веществ, представлены на рис. 1. Выход кривых на плато соответствует прекращению накопления флуоресцентного продукта в связи с истощением метаболического маркера (в случае достижения уровня, характерного для контроля интактной бактерии), либо в связи с полным подавлением метаболических процессов в бактериальных клетках.

 

Рис. 1. Кинетика накопления флуоресцентного продукта восстановления резазурина, отражающая интенсивность метаболических процессов в клетках E. coli ML-35p, при сочетанном действии антимикробного пептида (АМП) и антисептиков в концентрациях 1/4минимальной ингибирующей концентрации (МИК). ChBac3.4 — бактенецин домашней козы (Capra hircus) массой 3,4 кДа, PG-1 — протегрин-1 свиньи

 

Было выявлено, что в присутствии повиаргола развитие угнетающего эффекта как PG-1, так и ChBac3.4 на метаболическую активность бактерий существенно ускоряется, так что он становится сопоставим по действию 1/2 МИК этих пептидов. Подобная картина наблюдалась также для PG-1 в сочетаниях с диоксидином и пронтосаном. Данные по действию этидроновой кислоты с помощью выбранного метаболического маркера не были получены, поскольку она способна восстанавливать резазурин до резоруфина независимо от присутствия активно метаболизирующих клеток.

В связи с тем, что мембранолитическую активность полагают основным механизмом антибактериального действия большинства АМП, было исследовано, оказывает ли присутствие антисептиков влияние на данный процесс. Аналогично эксперименту по изучению метаболической активности бактерий рассматривали эффекты суббактерицидных концентраций препаратов, соответствующих 1/4 их МИК. Графики, представленные на рис. 2, демонстрируют, что в данных концентрациях диоксидин и пронтосан сами по себе практически не повышают проницаемость бактериальных мембран для хромогенных маркеров, а также не вызывают существенных изменений в динамике действия на эти мембраны антимикробных пептидов.

 

Рис. 2. Кинетика изменения проницаемости наружной и внутренней мембран E. coli ML-35p для хромогенных маркеров при сочетанном действии антимикробного пептида (АМП) и антисептиков в концентрациях 1/4 минимальной ингибирующей концентрации (МИК). ChBac3.4 — бактенецин домашней козы (Capra hircus) массой 3,4 кДа, PG-1 — протегрин-1 свиньи. OD — оптическая плотность

 

Тем не менее для случаев взаимодействия с повиарголом и этидроновой кислотой использованный метод оценки проницаемости бактериальных мембран с помощью хромогенных маркеров оказался малоинформативным. Для повиаргола было показано, что он, как и диоксидин или пронтосан, не оказывает значимого влияния на мембранолитическую активность АМП в отношении наружной мембраны E. coli ML-35p (данные не представлены). Этидроновая кислота ожидаемо препятствовала расщеплению β-лактамазой нитроцефина — использовавшегося для оценки проницаемости внешней мембраны маркера. Однако при исследовании проницаемости внутренней мембраны было установлено, что этидроновая кислота так же полностью блокирует расщепление ONPG β-галактозидазой, а присутствие повиаргола значительно замедляет протекание указанной реакции. Для верификации подобного вывода было проведено сравнение кривых, полученных в присутствии этидроновой кислоты или повиаргола для интактной бактерии, и для бактерии, предварительно лизированной мембранолитическим пептидом PG-1 в концентрации 4 × МИК. Картина расщепления (или его отсутствия) ONPG оказалась аналогичной в обоих случаях.

Отсутствие влияния антисептиков на мембранолитическую активность АМП в отношении бактерий давало основание предполагать, что при их сочетанном применении токсические эффекты АМП не будут усиливаться и в отношении эукариотических клеток, поскольку цитотоксичность данных веществ, в частности гемолитическое действие, также связывают с их мембранолитическими свойствами. Тем не менее для оценки возможного усиления повреждающего действия исследуемых препаратов на мембраны эукариотических клеток дополнительно проводили гемолитический тест. Минимальные эффективные концентрации (МЭК), вызывающие гемолитический эффект, статистически значимо отличающийся от интактного контроля, представлены в табл. 3. Следует отметить, что только для антимикробного пептида бактенецина ChBac3.4, диоксидина и повиаргола значения МЭК превышали любую из МИК установленных в отношении бактерий, рассмотренных при исследовании противомикробной активности, что подчеркивает важность снижения токсических эффектов АМП и антисептиков.

 

Таблица 3. Гемолитическая активность АМП и антисептиков

Вещество

PG-1

ChBac3.4

Этидроновая кислота

Диоксидин

Повиаргол

Пронтосан

МЭК, вызывающая гемолиз

0,5 мкМ

> 20 мкМ [принято = 40 мкМ]

5 мг/мл

> 1 мг/мл [принято = 2 мг/мл]

0,5 мг/мл

1,6 мкг/мл

Примечание: АМП — антимикробные пептиды, МЭК — минимальная эффективная концентрация, ChBac3.4 — бактенецин домашней козы (Capra hircus) массой 3,4 кДа, PG-1 — протегрин-1 свиньи.

 

Отсутствие «–» или наличие «+» статистически значимого отличия от интактного контроля при действии сочетаний АМП и антисептиков в концентрациях равных 1/2 или 1/4 их МЭК было оценено в серии из трех независимых экспериментов. Данные представлены в табл. 4; результирующие значения по трем опытам приведены в квадратных скобках. Расчетные индексы фракционной эффективной концентрации (иФЭК, определяемые аналогично иФИК), соответствующие синергетическому взаимодействию, выделены в таблице полужирным шрифтом. Среди комбинаций, которые показали синергизм противомикробной активности, синергизм гемолитического действия был выявлен только для комбинации мембранолитического пептида PG-1 с пронтосаном. Следует, однако, признать, что два этих вещества обладают наиболее выраженным индивидуальным гемолитическим эффектом среди рассмотренных соединений (см. табл. 3). С остальными антисептиками при гемолизе эритроцитов человека PG-1 показал аддитивное действие. Пролин-богатый пептид ChBac3.4 проявил аддитивность в сочетаниях с повиарголом и пронтосаном, тогда как с другими антисептическими препаратами действовал независимо.

 

Таблица 4. Гемолитический эффект сочетаний (1/2 МЭК A + 1/2 МЭК B) и (1/4 МЭК A + 1/4 МЭК B) АМП (А) и антисептиков (В) и соответствующие значения иФЭК

АМП (А)

Антисептик (В)

диоксидин

пронтосан

повиаргол

этидроновая кислота

1/2 A & 1/2 B

1/4 A & 1/4 B

иФЭК

1/2 A & 1/2 B

1/4 A & 1/4 B

иФЭК

1/2 A & 1/2 B

1/4 A & 1/4 B

иФЭК

1/2 A & 1/2 B

1/4 A & 1/4 B

иФЭК

PG-1

+ + –

[+]

– – –

[–]

1,0

+ + +

[+]

+ + +

[+]

0,5

+ + –

[+]

– – –

[–]

1,0

+ + +

[+]

– – –

[–]

1,0

ChBac3.4

– – –

[–]

– – –

[–]

> 1,0

+ + –

[+]

– – –

[–]

1,0

+ + +

[+]

– – –

[–]

1,0

– – –

[–]

– – –

[–]

> 1,0

Примечание: АМП — антимикробный пептид, иФЭК — индекс фракционной эффективной концентрации, МЭК — минимальная эффективная концентрация. В скобках — результирующие значения по трем опытам.

 

Заключение

С большинством рассмотренных в данном исследовании антисептиков АМП демонстрируют аддитивный или синергетический противомикробный эффект. Обнаруженные синергетические взаимодействия позволяют снизить концентрации компонентов, достаточные для ингибирования роста микроорганизмов, в 4–8 раз. При этом присутствие антисептиков, по данным оценки метаболической активности бактерий, ускоряет развитие бактерицидного эффекта пептидов. Среди протестированных в данном исследовании антисептиков наиболее широко синергизм антибактериального действия с АМП проявляется у препарата высокодисперсного серебра — повиаргола.

Таким образом, совместное использование АМП и антисептиков можно считать перспективной стратегией для усиления их действия против устойчивых к антибиотикам микроорганизмов. Кроме того, синергизм антибактериального действия между АМП и антисептиками редко сопровождается взаимным увеличением гемолитической активности, поэтому сочетанное применение может быть использовано также для снижения токсичности этих соединений.

Работа поддержана грантом РФФИ № 18-315-00333 и грантом РФФИ № 17-04-02177.

About the authors

Maria Sergeyevna Zharkova

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: zharkova.ms@yandex.ru

Russian Federation, 12, Academic Pavlov street, Saint-Petersburg, 197376

PhD in Biology, Senior Research Scientist, Department of General Pathology and Pathological Physiology

Ekaterina S. Umnyakova

Institute of Experimental Medicine

Email: umka-biolog@mail.ru

Russian Federation, 12, Academic Pavlov street, Saint-Petersburg, 197376

PhD in Biology, Senior Research Scientist, Department of General Pathology and Pathological Physiology

Anna G. Afinogenova

Saint Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology; Saint Petersburg State University

Email: pasteur.afinogenova@mail.ru

Russian Federation, 14, Mira street, Saint Petersburg, 197101; 7/9, Universitetskaya embankment, Saint-Petersburg, 199034

PhD in Biology, Leading research associate, Head of the Testing Laboratory Centre; Professor of the Department of Maxillofacial Surgery and Surgical Dentistry

Gennady E. Afinogenov

Saint Petersburg State University

Email: oshamova@yandex.ru

Russian Federation, MD, PhD, Professor, Professor of the Department of Maxillofacial Surgery and Surgical Dentistry

Aleksandr A. Kolobov

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations

Email: oshamova@yandex.ru

Russian Federation, 7, Pudozhskaya ul., Saint Petersburg, 197110

PhD in Biology, Head of the Peptide Chemistry Laboratory

Olga V. Shamova

Institute of Experimental Medicine

Email: oshamova@yandex.ru

Russian Federation, 12, Academic Pavlov street, Saint-Petersburg, 197376

PhD in Biology, Associate Professor, Head of the Department of General Pathology and Pathological Physiology, Deputy Director for Science

References

  1. Ventola CL. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P T. 2015;40(4):277-283.
  2. Who.int [Internet]. WHO. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance. Geneva: World Health Organization, 2015 [cited 22.09.2018]. Available from: http://www.who.int/antimicrobial-resistance/publications/global-action-plan/en/.
  3. Gordon YJ, Romanowski EG, McDermott AM. A review of antimicrobial peptides and their therapeutic potential as anti-infective drugs. Curr Eye Res. 2005;30(7):505-515. https://doi.org/10.1080/02713680590968637.
  4. Guani-Guerra E, Santos-Mendoza T, Lugo-Reyes SO, Teran LM. Antimicrobial peptides: general overview and clinical implications in human health and disease. Clin Immunol. 2010;135(1):1-11. https://doi.org/10.1016/j.clim.2009.12.004.
  5. Mahlapuu M, Hakansson J, Ringstad L, Bjorn C. Antimicrobial Peptides: An Emerging Category of Therapeutic Agents. Front Cell Infect Microbiol. 2016;6:194. https://doi.org/10.3389/fcimb.2016.00194.
  6. Guilhelmelli F, Vilela N, Albuquerque P, et al. Antibiotic development challenges: the various mechanisms of action of antimicrobial peptides and of bacterial resistance. Front Microbiol. 2013;4:353. https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00353.
  7. Haney EF, Mansour SC, Hancock RE. Antimicrobial Peptides: An Introduction. Methods Mol Biol. 2017;1548:3-22. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6737-7_1.
  8. Marr AK, Gooderham WJ, Hancock RE. Antibacterial peptides for therapeutic use: obstacles and realistic outlook. Curr Opin Pharmacol. 2006;6(5):468-472. https://doi.org/10.1016/j.coph.2006.04.006.
  9. Langham AA, Khandelia H, Schuster B, et al. Correlation between simulated physicochemical properties and hemolycity of protegrin-like antimicrobial peptides: predicting experimental toxicity. Peptides. 2008;29(7):1085-1093. https://doi.org/10.1016/j.peptides.2008.03.018.
  10. Echols K, Graves M, LeBlanc KG, et al. Role of antiseptics in the prevention of surgical site infections. Dermatol Surg. 2015;41(6):667-676. https://doi.org/10.1097/DSS.0000000000000375.
  11. McDonnell G, Russell AD. Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance. Clin Microbiol Rev. 1999;12(1):147-179. PMC88911. https://doi.org/10.1128/cmr.12.1.147.
  12. McCullough M, Carlson GW. Dakin’s solution: historical perspective and current practice. Ann Plast Surg. 2014;73(3):254-256. https://doi.org/10.1097/SAP.0b013e3182a634f7.
  13. Frecer V. QSAR analysis of antimicrobial and haemolytic effects of cyclic cationic antimicrobial peptides derived from protegrin-1. Bioorg Med Chem. 2006;14(17):6065-6074. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2006.05.005.
  14. Shamova O, Orlov D, Stegemann C, et al. ChBac3.4: A Novel Proline-Rich Antimicrobial Peptide from Goat Leukocytes. Int J Pept Res Therap. 2009;15(1):31-42. https://doi.org/10.1007/s10989-009-9170-7.
  15. Krizsan A, Prahl C, Goldbach T, et al. Short Proline-Rich Antimicrobial Peptides Inhibit Either the Bacterial 70S Ribosome or the Assembly of its Large 50S Subunit. Chembiochem. 2015;16(16):2304-2308. https://doi.org/10.1002/cbic.201500375.
  16. Zahn M, Berthold N, Kieslich B, et al. Structural studies on the forward and reverse binding modes of peptides to the chaperone DnaK. J Mol Biol. 2013;425(14):2463-2479. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2013.03.041.
  17. Лукоянова Т.В., Булгаков В.С., Кравцов Э.Г., и др. Эффективность применения этидроновой кислоты как средства профилактики воспалительных заболеваний полости рта // Российская стоматология. - 2011. - Т. 4. - № 2. - С. 26-28. [Lukoyanova TV, Bulgakov VS, Kravtsov EG, et al. Efficiency of etidronic acid for the prevention of inflammatory processes in the oral cavity. Russian journal of stomatology. 2011;4(2):26-28. (In Russ.)]
  18. Афиногенова А.Г., Ворошилова Т.М., Афиногенов Г.Е., Мадай Д.Ю. Оценка эффективности нового ингибитора металло-бета-лактамазы в условиях модельной системы in vitro // Инфекция и иммунитет. - 2016. - Т. 6. - № 4. - С. 335-344. [Afinogenova AG, Voroshilova TM, Afinogenov GE, Maday DY. The new metall-beta-lactamase’s inhibitor efficacy in a model system in vitro. Infektsiia Immun. 2016;6(4):335-344. (In Russ.)]. https://doi.org/10.15789/2220-7619-2016-4-335-344.
  19. Methods in Molecular Biology. Volume 78. Antibacterial Peptide Protocols. Ed. by WS Shafer. Totowa, NJ: The Humana Press; 1997. 259 p. https://doi.org/10.1385/0896034089.
  20. Orhan G, Bayram A, Zer Y, Balci I. Synergy tests by E test and checkerboard methods of antimicrobial combinations against Brucella melitensis. J Clin Microbiol. 2005;43(1):140-143. https://doi.org/10.1128/JCM.43.1.140-143.2005.
  21. Fassi Fehri L, Wroblewski H, Blanchard A. Activities of antimicrobial peptides and synergy with enrofloxacin against Mycoplasma pulmonis. Antimicrob Agents Chemother. 2007;51(2):468-474. https://doi.org/10.1128/AAC.01030-06.
  22. Lehrer RI, Barton A, Ganz T. Concurrent assessment of inner and outer membrane permeabilization and bacteriolysis in E. coli by multiple-wavelength spectrophotometry. J Immunol Methods. 1988;108(1-2):153-158. https://doi.org/10.1016/0022-1759(88)90414-0.
  23. Артамонов А.Ю., Шамова О.В., Кокряков В.Н., Орлов Д.С. Фото- и флюориметрические методы оценки проницаемости мембран E. coli ML-35P // Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 3. Биология. - 2008. - № 2. - С. 139-142. [Artamonov AY, SHamova OV, Kokryakov VN, Orlov DS. Color emetric and fluorometric microplate based assays for evaluation microbial membranes permeability. Vestnik SPbGU. Ser. 3. 2008;(2):139-142. (In Russ.)]
  24. Mariscal A, Lopez-Gigosos RM, Carnero-Varo M, Fernandez-Crehuet J. Fluorescent assay based on resazurin for detection of activity of disinfectants against bacterial biofilm. Appl Microbiol Biotechnol. 2009;82(4):773-783. https://doi.org/10.1007/s00253-009-1879-x.
  25. Жаркова М.С., Шамова О.В., Орлов Д.С., Голубева О.Ю. Антибактериальное и цитотоксическое действие биоконъюгатов природных антимикробных полипептидов с наночастицами серебра // Российский иммунологический журнал. - 2015. - Т. 9. - № 2-1. - С. 779-781. [Zharkova MS, Shamova OV, Orlov DS, Golubeva OY. Antibacterial and cytotoxic effects of natural antimicrobial polypeptides and silver nanoparticles bioconjugates. Ross Immunol Zhurnal. 2015;9(2-1):779-781. (In Russ.)]
  26. Жаркова М.С. Синергизм антибактериального действия антимикробных пептидов и конвенциальных антибиотиков // Российский иммунологический журнал. - 2014. - Т. 8. - № 3. - С. 792-795. [Zharkova MS. Synergy in antibacterial action of antimicrobial peptides and conventional antibiotics. Ross Immunol Zhurnal. 2014;8(3):792-795. (In Russ.)]
  27. Giacometti A, Cirioni O, Del Prete MS, et al. Combination studies between polycationic peptides and clinically used antibiotics against Gram-positive and Gram-negative bacteria. Peptides. 2000;21(8):1155-1160. https://doi.org/10.1016/s0196-9781(00)00254-0.
  28. Sanchez-Gomez S, Japelj B, Jerala R, et al. Structural features governing the activity of lactoferricin-derived peptides that act in synergy with antibiotics against Pseudomonas aeruginosa in vitro and in vivo. Antimicrob Agents Chemother. 2011;55(1):218-228. https://doi.org/10.1128/AAC.00904-10.
  29. Feng Q, Huang Y, Chen M, et al. Functional synergy of alpha-helical antimicrobial peptides and traditional antibiotics against Gram-negative and Gram-positive bacteria in vitro and in vivo. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2015;34(1):197-204. https://doi.org/10.1007/s10096-014-2219-3.

Supplementary files

Supplementary Files Action
1.
Fig. 1. The kinetics of accumulation of fluorescent product recovery of resazurin, reflecting the intensity of metabolic processes in E. coli cells ML-35p, with the combined action of the antimicrobial peptide (AMP) and antiseptics at concentrations of 1 / 4minimum inhibitory concentration (MIC). ChBac3.4 - domestic goat bactenecine (Capra hircus), 3.4 kDa, PG-1 - pig protegrin-1

Download (268KB) Indexing metadata
2.
Fig. 2. Kinetics of changes in the permeability of the outer and inner membranes of E. coli ML-35p for chromogenic markers under the combined action of the antimicrobial peptide (AMP) and antiseptics at concentrations of 1/4 of the minimum inhibitory concentration (MIC). ChBac3.4 is a domestic goat bactenecine (Capra hircus) with a mass of 3.4 kDa, PG-1 is pig protegrin-1. OD - optical density

Download (248KB) Indexing metadata

Statistics

Views

Abstract - 105

PDF (Russian) - 14

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Zharkova M.S., Umnyakova E.S., Afinogenova A.G., Afinogenov G.E., Kolobov A.A., Shamova O.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies