The influence of acizol into effects of picrotoxin, injected in rat’s neostriatum

Full Text

Введение

Несмотря на существенные успехи в изучении этиопатогенеза экстрапирамидных гиперкинезов (большой хореи — болезни Гентингтона, малой ревматической хореи и др.), до сих пор не разработано их эффективной лекарственной терапии. Так, в Европе зарегистрирован лишь один препарат для лечения болезни Гентингтона — тетрабеназин [1], но и его эффективность невелика. Одна из причин — недостаточность знаний о патогенезе заболевания. Наши исследования на модели хореомиоклонического гиперкинеза, воспроизводимого на крысах с помощью многократных внутристриарных микроинъекций блокатора ГАМК-А-рецепторов пикротоксина [2], продемонстрировали роль нарушения ионного гомеостазиса в генезе моторных дисфункций гиперкинетического типа. Описан положительный эффект ионов магния и цинка — возникновение гиперкинеза у крыс купировалось или его проявления минимизировались [3]. Однако протестированные нами соединения относились не к лекарственным средствам, а к химическим соединениям. Использованный в данной части работы донатор цинка ацизол относится к официнальным препаратам. Он разработан как антидот и протектор при отравлениях продуктами горения органических соединений (патент РФ № 2247558. Бабаниязова З.Х., Баринов В.А., Шилов В.Н. и др.) [4], но перспективен для применения и в других сферах, в том числе и в неврологической практике.

Цель — изучить влияние внутрибрюшинного введения ацизола (в дозах, близких к рекомендуемым при приеме ацизола человеком) на параметры хореомиоклонического гиперкинеза, индуцированного у крыс путем многократных введений в неостриатум пикротоксина, на вызываемые им нарушения избегательного условно-рефлекторного поведения крыс в челночной камере и спонтанного двигательного поведения в «открытом поле».

Материалы и методы

Работу с животными проводили в соответствии с принципами Хельсинской декларации в редакции 2002 г. и Руководством по использованию лабораторных животных для научных и учебных целей в СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (2002). В эксперименте использовали 31 белую крысу-самца Вистар массой 250 г с выработанным условным рефлексом активного избегания (УРАИ) в челночной камере. Камера представляет собой ящик из хлорвинила и прозрачного оргстекла (передняя стенка) размером 650 × 550 × 300 мм, разделенный на освещенную (левую) и затемненную (правую) половины; имеет проволочный пол (через который подается электрический ток силой 1 мА): крыс обучали покидать затемненную половину не позднее десяти секунд с начала действия условного раздражителя (тон 7000 Гц). В течение трех дней крыс адаптировали к челночной камере и раздражителям, после чего приступали к выработке условного рефлекса активного избегания темной половины камеры. Добивались выработки навыка не ниже 80 % уровня правильных ответов (отношение в процентах правильно выполненных реакций к общему числу предъявляемых условных раздражителей). При последующем тестировании за опыт подавали восемь сочетаний условного и безусловного раздражителя с промежутком 30–40 с. В установке «открытое поле» (ящик с квадратным дном, расчерченным на 16 квадратов размером 165×165 мм и стенками высотой 250 мм) оценивали спонтанную двигательную активность: пересечение границ квадратов пола и исследовательское поведение — по количеству стоек на задних лапах. В течение трех дней крыс помещали на 5 мин в «открытое поле» для адаптации к новым условиям и угашения реакции на новизну, после чего проводили контрольное тестирование (время тестирования — 3 мин).

Каждому из животных под нембуталовым наркозом (40–60 мг/кг) в область рострального отдела неостриатума по стереотаксическим координатам (ростральнее брегмы на 1,0–1,5 мм, латеральнее средней линии черепа на 2,0–2,5 мм и вентральнее его поверхности на 6,0–6,5 мм) вживляли гибкие микроинъекторы, заполненные раствором вещества, достаточного для 15–20 инъекций. Способ введения описан ранее [2].

Контрольной группе (11 животных) в ростральный неостриатум двусторонне инъецировали стерильный апирогенный 0,9 % раствор хлорида натрия. Животным второй (11 крыс) и третей (9 крыс) групп в стриатум инъецировали блокатор ГАМК-А-рецепторов пикротоксин (Serva, Германия) — 2 мкг. Объем одной микроинъекции (во всех группах) составлял 1 мкл. К инъекциям приступали через 3 дня после операции, а затем производили ежедневно в течение 15 дней. Кроме того, третьей группе животных внутрибрюшинно вводили ацизол — 0,1 мл, содержащий 6 мг препарата (24 мг/кг). Опираясь на полученные ранее данные [5, 6], ацизол начинали вводить за 10 дней до первой внутристриарной микроинъекции; всего было произведено три предварительные инъекции ацизола.

Тестирование проводили с промежутком в 1–3 дня. В дни тестирования ацизол вводили за 10 мин до микроинъекции пикротоксина, а через 15 мин после пикротоксина начинали исследование: вначале животных помещали в «открытое поле», а затем — в челночную камеру. Затем оценивали успешность реализации рефлекса (отношение своевременных переходов на светлую половину камеры к общему числу подаваемых условных раздражителей в процентах) и его латентный период (время в секундах от момента подачи условного раздражителя до исполнения навыка). После прекращения цикла введения препаратов эксперименты продолжали еще в течение недели с целью исследования возможной динамики восстановления нарушенных двигательных функций.

По окончании опытов осуществляли морфологический контроль локализации канюль. У всех животных кончики канюль располагали в области неостриатума (животные с иной локализацией канюль выбраковывали и полученные на них данные не учитывали). При статистическом анализе рассчитывали средние арифметические значения по группе животных, стандартные ошибки и стандартные отклонения. Показатели в очередной день введения препарата сравнивали с показателями этой группы до вживления канюль и с показателями в соответствующий день экспериментов у крыс контрольной группы; также производили сравнение показателей второй и третьей опытных групп. Данные оценивали с использованием непараметрических методов статистики (по Манну – Уитни, Вилкоксону, Фридману, дисперсионный анализ Фишера). По t-критерию Стьюдента различия считали значимыми при р < 0,05.

Результаты

У животных контрольной группы с микроинъекциями 0,9 % раствора хлорида натрия (рис. 1, а) в первый день введения наблюдалось снижение реализации УРАИ (возрастало число ошибок — крысы не покидали опасную половину челночной камеры за положенные 10 с), но это не привело к изменениям, которые достоверно отличались от этого показателя до начала опытов. Интенсивность спонтанной двигательной активности «в открытом поле» у них не изменялась, двигательные девиации отсутствовали.

 

Рис. 1. Динамика показателя точности реализации условного рефлекса активного избегания у крыс в челночной камере (средние значения по группе животных) на фоне внутристриарного введения 1 мкл 0,9 % раствора натрия хлорида (а), 2 мкг пикротоксина (b) и 2 мкг пикротоксина на фоне внутрибрюшинного введения 24 мг/кг ацизола (c). По оси абсцисс — дни опытов: I — фон, II — период инъекции препаратов, III — период после их окончания; по оси ординат — правильные ответы (от предъявленных за опыт), %. ** случаи достоверного отличия показателя в данный день опыта с показателями у крыс с введением 0,9 % раствора натрия хлорида (сравнение двух рядов по Стьюденту), p = 0,01

Fig. 1. Conditioned avoidance performance in a shuttle box (mean values) in rats with intrastriatal injection of 1 mcl physiological saline (a), 2 μg picrotoxin (b) and 2 μg picrotoxin with 24 mg/kg of acizol simultaneously (с). The abscissa shows experimental days: I —baseline before injections, II — days of treatment and III — withdrawal days. Ordinate: ratio between the number of conditioned responses and total number of presented conditioned stimuli; ** p = 0.01 compared to the control

 

Эффекты внутристриарного введения пикротоксина (вторая опытная группа) описаны в наших предыдущих публикациях [2, 3]. У этих крыс не только в период микроинъекций, но и после их окончания нарушалась реализация избегательного условно-рефлекторного навыка (рис. 1, b), спонтанная двигательная активность в «открытом поле» достоверно увеличивалась. Однако главным в эффектах пикротоксина является хореомиоклонический гиперкинез (неконтролируемые стереотипные движения различных частей тела), основные характеристики которого совпадают с таковыми при хорее Гентингтона у человека. Гиперкинез начинался с мелких подергиваний головы или лапы, их частота и амплитуда увеличивались, движения становились целостными и у части животных охватывали все тело. Такая генерализация гиперкинеза воспроизводилась у половины животных. Гиперкинез наблюдался у всех крыс второй группы, латентный период его возникновения (время от микроинъекции до первых его проявлений) в первый день эксперимента составил в среднем по группе 9,6 ± 4,2 мин (рис. 2, А, а); средняя продолжительность гиперкинеза составляла 88,4 ± 27,7 мин (рис. 2, B, а).

 

Рис. 2. Латентный период (А) и длительность (B) гиперкинеза, вызванного внутристриарными микроинъекциями 2 мкг пикротоксина (а) и микроинъекциями 2 мкг пикротоксина на фоне внутрибрюшинного введения 24 мг/кг ацизола (b). По оси ординат обозначено время (в минутах). ** случай достоверного отличия показателя гиперкинеза у крыс с введением пикротоксина и ацизола по сравнению с соответствующим значением у группы животных с введением одного пикротоксина (сравнение двух рядов по Стьюденту), p = 0,01

Fig. 2. Latency (A) and duration (B) of hyperkinesis, produced by 2 μg picrotoxin intrastriatal microinjection in rat’s with picrotoxin alone (a) and with 2 μg picrotoxin microinjection and with intraperitoneal injection of 24 mg/kg acizol (b). Ordinate: time in minutes; ** p = 0.01 compared to rat’s with picrotoxin microinjection alone

 

На эти достаточно драматические изменения в поведении животных, индуцируемые пикротоксином, существенно влиял ацизол. Хотя у животных третьей группы реализация УРАИ также страдала и формально при первых введениях пикротоксина в среднем по группе была даже ниже, чем у крыс второй группы (рис. 1, c), ни один метод статистической обработки не выявил достоверности отличий от крыс контрольной группы. Это связано с тем, что в третьей группе в эти дни были крысы как с полной потерей условно-рефлекторного навыка, так и с его достаточно высоким уровнем.

В последующие дни цикла введения препаратов показатели УРАИ у крыс третьей группы восстанавливались, различие между второй и третьей группами становилось очевидным. Особенно демонстративными различия стали в последние дни микроинъекций пикротоксина и после их прекращения: у крыс второй группы реализация УРАИ оставалась на низком уровне, в то время как у крыс, которым вводили ацизол, навык восстановился. Параметры пикротоксинового гиперкинеза также изменялись. Латентный период в первый день введений увеличивался в среднем по группе до 15,5 ± 6,7 мин; р = 0,01 (рис. 2, А, b), длительность сокращалась до 64,2 ± 20,2 мин. Не менее важно и то, что из 9 крыс, получавших ацизол, гиперкинез в первый день опытов был зарегистрирован только у половины животных. В последующие дни воспроизводимость была еще ниже, в силу чего статистический анализ параметров гиперкинеза стал невозможен.

Обсуждение

В данных экспериментах проявились антигиперкинетические свойства ацизола в отношении экспериментальной модели хореического экстрапирамидного гиперкинеза, вызванного блокадой ГАМК-А-рецепторов неостриатума. Было показано, что при повторных введениях ацизола содержание цинка в ткани головного мозга крыс возрастало [5], в наибольшей степени — в коре больших полушарий и подкорковых образованиях мозга [6]. Под влиянием многократных введений ацизола зарегистрированы определенные сдвиги (в центральной нервной системе, плазме крови, паренхиматозных органах — в печени и поджелудочной железе) в содержании других важных для деятельности мозга биоэлементов — селена, кальция, меди, железа [5].

Нейробиологическая роль цинка [7] много шире, чем просто антагониста ионных каналов мембранных рецепторов и фактора тормозных и возбудительных процессов в нервной ткани. Он активно захватывается глютаматергическим нейроном, везикулируется вместе с медиатором и потенциал-зависимо выбрасывается в синаптическую щель [8]. Есть основания считать нейрональный цинк фактором сложного модулирования синаптической передачи [9] за счет влияния не только на постсинаптические рецепторы, но и на пресинаптический и внесинаптический аппарат ряда медиаторных систем мозга [7]. В неостриатуме цинк, содержащийся в терминалях кортикостриарных нейронов [11], по-видимому, является участником регуляции баланса значимых для деятельности базальных ганглиев нейрональных потоков, идущих по «прямому» и «непрямому» эфферентным путям: чувствительность к цинку (и итоговый эффект) различна у подтипов NMDA-рецепторов, они по-разному представлены на указанных эфферентных нейронах. Дисбаланс в эфферентных потоках приводит к гиперкинезам [7, 10], который цинк нормализует. В пользу того что полученный в данных экспериментах поведенческий эффект связан с повышением содержания цинка в ткани неостриатума, свидетельствует и зарегистрированная динамика восстановления УРАИ, совпадающая с таковой в других наших исследованиях с введением цинка непосредственно в неостриатум крыс [3].

Выводы

1. Ацизол, многократно введенный крысам внутрибрюшинно в дозе 24 мг/кг, способствует восстановлению условного рефлекса активного избегания в челночной камере, нарушенного под влиянием внутристриарного введения антагониста ГАМК-А-рецепторов пикротоксина.
2. Ацизол предупреждает возникновение или снижает интенсивность развившегося у крыс под влиянием пикротоксина хореомиоклонического гиперкинеза.
3. Донатор цинка ацизол, благодаря отчетливому антигиперкинетическому действию, может быть использован в неврологической практике при терапии экстрапирамидных гиперкинезов у человека.

Дополнительная информация

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Соблюдение этических стандартов. Все международные, национальные и/или институциональные принципы ухода и использования животных были соблюдены.

Список сокращений

УРАИ — условный рефлекс активного избегания

About the authors

Аndrey F. Yakimovskii

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University; Pavlov Institute of Physiology, Russian Academy of Science

Author for correspondence.
Email: jakim2010@gmail.com

MD, Professor, Chief of Laboratory of Normal and Pathological Locomotor Behaviour; Senior Research Scientist in Laboratory of Physiology Higher Nervous Activity

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files