Effect of intratumoral implantation of barium hexaferrite, magnetite, hematite, aluminium oxide and silica on the dynamics of Erlich tumor growth and survival value of tumor-carrying mice

Full Text

Введение

Анализ литературных данных свидетельствует, что заболеваемость в России злокачественными новообразованиями и смертность от них неуклонно растут [1, 2].

Несмотря на интенсификацию химиотерапии и использование для лечения новых таргетных и иммуноонкологических препаратов, применение различных методов лучевой терапии и хирургическое удаление опухоли, ни монотерапия, ни комбинированное лечение, прежде всего солидных опухолей, не привели к значимому увеличению медианы времени до прогрессирования, существенному увеличению общей выживаемости большинства онкологических больных и качества их жизни [3].

В связи с вышесказанным актуальным является поиск новых подходов к лечению злокачественных опухолей, в первую очередь изучение противоопухолевых воздействий на экспериментальных моделях злокачественных новообразований.

В наших предыдущих исследованиях было показано, что имплантирование в экспериментальные опухоли (объем опухолей — 2 см³) разного гистогенеза магнитожесткого ферромагнетика — гексаферрита бария, BaO ∙ 6Fe₂O₃ (ГФБ) — тормозило рост первичной опухоли, блокировало метастазирование и рецидивы после оперативного удаления опухолевого узла, а также способствовало увеличению средней продолжительности жизни мышей с опухолями. Мы установили, что остаточное магнитное поле имплантата ГФБ является постоянным и убывает от центра опухоли (имплантата ГФБ) к периферии [4–7]. Входящее в состав ГФБ железо с магнитным полем, близким к нулю, привлекло наше внимание из-за низкой токсичности частиц, содержащих оксиды железа [8].

В данной работе была оценена противоопухолевая активность окислов железа и ГФБ при имплантировании во внутримышечные опухоли Эрлиха большего размера (3 см³). В опухоль Эрлиха имплантировали как частицы со слабым остаточным магнитным полем — ГФБ, так и окислы железа с магнитным полем, близким к нулю, — магнетит (FeO ∙ Fe₂O₃) и гематит (Fe₂O₃), а в качестве контроля — не содержащие железо окись алюминия (Al₂O₃) и кремнезем (nSiO₂ ∙ mH₂O).

Материал и методы исследования

Эксперименты проведены на 70 белых мышах-самках массой 23–24 г из питомника «Рапполово», содержавшихся в стандартных условиях клиники лабораторных животных «РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова» при свободном доступе к воде и пище.

Для перевивки использовали злокачественную эпителиальную опухоль Эрлиха, характеристика которой дана в практическом руководстве «Экспериментальные опухоли» [9]. В камере Горяева подсчитывали общее число опухолевых клеток в 0,2 мл. В объеме 0,2 мл содержалось 5 ∙ 10⁶ опухолевых клеток. Взвесь опухолевых клеток Эрлиха в объеме 0,2 мл вводили внутримышечно в правую заднюю конечность 70 животным (первая серия состояла из 30 мышей, вторая — из 40).

В первой серии опытов на 9-е сутки после перевивки опухоли (объем опухоли в среднем составлял 3 см³) мыши-опухоленосители были разделены на три группы по 10 животных в группе. Мышам контрольной группы внутриопухолево вводили изотонический раствор натрия хлорида в объеме 0,1 мл. Мышам первой подопытной группы имплантировали в опухоль ферромагнетик — ГФБ, предварительно обработанный ультразвуком для разрушения механических агрегатов порошка. Размер частиц составлял от 0,5 до 10 мкм. Доза ГФБ — 2240 мг/кг, объем — 0,1 мл. Животным второй подопытной группы имплантировали в опухоль суспензию кремнезема с размером частиц 6–10 мкм в объеме 0,1 мл на мышь. Во второй серии опытов, когда объем опухолей на 7-е сутки после перевивки достиг в среднем 3 см³, мышей разделили на четыре группы по 10 животных в группе. Мышам контрольной группы вводили внутрь опухоли изотонический раствор натрия хлорида в объеме 0,1 мл. Животным первой опытной группе имплантировали в опухоль частицы магнетита по 0,1 мл на мышь, второй группы — частицы гематита в объеме 0,1 мл на мышь, третьей группы — частицы окиси алюминия нейтрального в объеме 0,1 мл на мышь. У животных первой и второй серий опытов опухоли измеряли в динамике.

Объем опухолевого узла (V) определяли по формуле эллипсоида: V = A ∙ B² ∙ p/6 = А ∙ В²/2, где A — наибольший диаметр опухолевого узла, В — перпендикулярный ему диаметр. Противоопухолевую активность оценивали по торможению роста опухоли (в процентах), а также по площади под кинетической кривой роста опухоли и индексу роста опухоли [10].

Торможение роста опухоли (T%) рассчитывали по формуле T% = V_к – V_э/V_к ∙ 100, где V_к — средний объем опухолей в контроле, V_э — средний объем опухолей в подопытной группе. Для измерения площади под кинетической кривой роста опухоли использовали метод трапеций, базирующийся на формуле

S = V_i + V_{i = 1}/2 ∙ t_i = = V₁ + V₂/2 ∙ t₁ + V₂ + V₃/2 ∙ t₂ + V_{n – 1} + V_n ∙ t_{n – 1},

где S — площадь под кинетической кривой роста опухоли; V_i — объем опухоли в соответствующем измерении под номером i; n — число измерений; t₁ — время в днях между первым и вторым измерениями; t₂ — время между вторым и третьим измерениями и т. д.; t_{n – 1} — время между предпоследним и последним измерениями.

Определяли количество выживших мышей через 4 нед. после перевивки опухоли. На 28-й день от момента перевивки опухоли в первой серии опытов и на 29-й день во второй серии опытов все выжившие к этому сроку животные были умерщвлены золетилом и подвергнуты патологоанатомическому вскрытию. Для оценки токсического эффекта изученных средств были взвешены следующие органы мышей: сердце, легкие, почки, надпочечники, селезенка, поджелудочная железа, печень, гипофиз, головной мозг, регионарные лимфатические узлы, опухоль и определены весовые коэффициенты по формуле: весовой коэффициент = вес органа (мг) / масса тела мыши (г). Материал был подвергнут статистической обработке с использованием критериев Фишера и Стьюдента.

Величину остаточного магнитного поля имплантов определяли с помощью высокочувствительного миллигауссметра со щупом DC Milligauss Meter (AlphaLab, Inc., США).

Результаты и обсуждение

Размер используемых для имплантации частиц в среднем составил несколько микрон, при этом сами частицы были достаточно однородны по размеру (рис. 1). Гексаферрит бария и в меньшей степени магнетит проявляли тенденцию к образованию цепочек и агрегатов, что скорее всего связано со статическим электричеством на поверхности пластиковых плашек, применяемых для фотографирования.

 

Рис. 1. Микрофотографии водной суспензии частиц, используемых в качестве имплантата: a — гексаферрит бария; b — магнетит; c — гематит; d — окись алюминия; e — кремнезем. Увеличение ×40, шкала — 20 мкм

Fig. 1. Microphotoes of the water suspension of particles being used as transplant: a — barium hexaferrite; b — magnetite; c — hematite; d — aluminium oxide; e — silica. Enlargement of ×40, scale — 20 micrometers

 

На рис. 2 представлены результаты первой серии опытов по влиянию однократного имплантирования в опухоль ГФБ и кремнезема на динамику роста опухоли Эрлиха, достигшей у белых мышей-самок к моменту имплантирования размера 3 см³ (условно соответствует III стадии рака у людей).

Как видно из рис. 2, после однократного имплантирования ГФБ в конечность с опухолью объемом 3 см³ (9-й день после перевивки) наблюдалось умеренное достоверное торможение роста опухоли Эрлиха во все последующие сроки наблюдения. Аналогичные данные были получены нами ранее, когда после имплантирования ГФБ в опухоль меньшего размера (2 см³) на 6-й день после перевивки зафиксировано более выраженное торможение роста опухоли (на 31 %) [5]. При имплантировании суспензии кремнезема, взятого в качестве контрольного вещества, заведомо не обладающего магнитными или парамагнитными свойствами, противоопухолевого эффекта выявлено не было на протяжении всего исследования. Выраженность и продолжительность эффекта ГФБ и кремнезема на рост бластомы оценивали по площади под кинетической кривой роста опухоли Эрлиха и индексу роста опухоли. Эти данные представлены в табл. 1.

 

Рис. 2. Влияние гексаферрита бария и кремнезема на динамику роста (объем) солидной опухоли Эрлиха у белых мышей-самок при имплантировании в центр опухолевого узла. 0 — день перевивки опухоли Эрлиха. По оси абсцисс — дни после перевивки опухоли. Стрелкой указан день имплантирования гексаферрита бария или кремнезема в центр опухоли. I — контрольные мыши (инъекция изотонического раствора натрия хлорида); II — гексаферрит бария; III — кремнезем

Fig. 2. Influence of BHF and silica on the dynamics of the growth (volume) of solid Erlich tumor in white female mice at implanting in the centre of the tumor node. 0 — a day of the transplantation of Erlich tumor. On the axis abscissa — days after transplantation of the tumor. The arrow shows the day of implanting BHF or silica in the tumor centre. I — control mice (injection of isotonic sodium chloride solution); II — BHF; III — silica

 

Таблица 1 / Table 1

Влияние гексаферрита бария или кремнезема на площадь под кинетической кривой и индекс роста опухоли Эрлиха у белых мышей-самок

Influence of barium hexaferrite or silica on the square under the kinetics curve and index of the Erlich tumor growth in white female mice

Экспериментальная группа	Число мышей в группе	Площадь под кинетической кривой, см2 ∙ сут	Индекс роста опухоли, %	Критерий достоверности, p
Контроль I: однократное внутриопухолевое введение изотонического раствора натрия хлорида	10	123,5 ± 5,1	100
Опыт II: однократное внутриопухолевое имплантирование гексаферрита бария в дозе 2240 мг/кг	10	101,1 ± 3,2	81	<0,05
Опыт III: однократное внутриопухолевое имплантирование кремнезема	10	134,1 ± 6,1	108	>0,05

 

Как видно из табл. 1, ГФБ достоверно уменьшает площадь опухоли под кинетической кривой. При стопроцентном росте опухоли у контрольных животных индекс роста опухоли под влиянием ГФБ уменьшился до 81 %. Это свидетельствует, что ферромагнетик на 19 % тормозит рост злокачественной опухоли Эрлиха. Напротив, кремнезем, имплантируемый в опухоль, проявлял тенденцию к некоторой стимуляции (статистически недостоверной) роста опухоли Эрлиха. К моменту окончания опыта (28-е сутки после перевивки опухоли) в контроле погибло 20 % мышей, в группе с имплантацией в опухоль ГФБ — 30 %. Удивительно, что в группе животных с имплантированным в опухоль кремнеземом ни одно не погибло, при этом мыши были подвижны, бегали по клетке, несмотря на большие опухоли, волосяной покров был блестящим, отсутствовали явления поноса или выпадения шерсти, что наблюдалось в контрольной группе. При патологоанатомическом вскрытии обращало внимание следующее: у животных контрольной группы и группы мышей, которым внутриопухолево имплантировали ГФБ, в центре опухолевого узла располагались участки некроза, в то время как в группе мышей, которым в опухоль имплантировали кремнезем, у всех животных опухоли оказались без видимых участков некроза, ткань была как бы «живая», равномерно розовой окраски. При взвешивании опухолевых узлов на 28-е сутки после перевивки опухоли (конечная точка наблюдения) средний вес опухоли в контрольной группе составил 11,5 ± 1 г, в группе с имплантацией в опухоль ГФБ — 10,1 ± 0,9 г, а в группе с имплантированным кремнеземом — 14,0 ± 1 г. В группе мышей, которым имплантировали в опухоль ГФБ, отмечалось торможение роста новообразования на 13 %, тогда как в группе животных, которым в опухоль имплантировали кремнезем, напротив, наблюдалась стимуляция роста опухоли на 24 %. При этом, как было указано выше, в группе с имплантацией кремнезема опухоли были без признаков некроза, равномерной розовой окраски, мыши не выглядели угнетенными, гибели животных в группе не было.

Для определения токсического эффекта имплантатов на органы животных с опухолями рассчитывали весовые коэффициенты. В табл. 2 представлены средние значения весовых коэффициентов различных органов мышей-опухоленосителей, которым в опухоль имплантировали ГФБ или кремнезем.

 

Таблица 2 / Table 2

Весовые коэффициенты (средние данные) органов мышей-опухоленосителей с однократной имплантацией в опухоль гексаферрита бария или кремнезема

Weight rate (average data) of organs of tumor-carrying mice with a single implantation of BHF or silica in the tumor

Орган	Контрольная группа с опухолью	Имплантация гексаферрита бария	Имплантация кремнезема
Сердце	4,01 ± 0,5	4,16 ± 0,4	4,08 ± 0,4
Легкие	7,64 ± 0,6	7,14 ± 0,5	7,1 ± 0,4
Печень	76,1 ± 7,0	59,8 ± 8	78,09 ± 6,0
Селезенка	11,2 ± 0,2	10,5 ± 0,5	12,12 ± 0,3
Поджелудочная железа	3,77 ± 0,3	3,37 ± 0,4	3,44 ± 0,3
Почки	13,17 ± 0,6	13,17 ± 0,6	14,13 ± 1,0
Надпочечники	0,42 ± 0,11	0,458 ± 0,15	0,72 ± 0,12
Головной мозг	9,07 ± 1,1	10,0 ± 0,8	8,23 ± 0,7
Опухоль	221,7 ± 12,0	300,1 ± 15,0	407,54 ± 1,13
Лимфатические узлы	6,68 ± 0,18	2,2 ± 0,3*	9,47 ± 0,4
Гипофиз	0,049 ± 0,01	0,089 ± 0,02	0,16 ± 0,01

Примечание. * разница статистически достоверна.

 

Исходя из табл. 2 можно заключить, что изученные имплантаты не оказывают токсического эффекта на большинство изученных органов. Исключение составляют лимфатические узлы (под влиянием ГФБ весовой коэффициент достоверно уменьшался), а также печень (весовой коэффициент тоже уменьшался), в связи с чем необходимы дальнейшие исследования. Уменьшение веса лимфатических узлов у животных с опухолью Эрлиха под влиянием ГФБ в какой-то мере объясняет ранее описанный нами эффект полного подавления региональных метастазов в аналогичных экспериментах, проведенных на опухоли ЛИО-1 [4]. Видимо, ГФБ предотвращает распространение опухолевых клеток в регионарные лимфатические узлы.

Во второй серии опытов на модели опухоли Эрлиха были изучены эффекты других имплантатов на рост бластомы. На рис. 3 показаны результаты опыта по влиянию магнетита, гематита и окиси алюминия на динамику роста солидной опухоли Эрлиха у мышей-самок при имплантировании суспензии вещества на 7-е сутки, когда опухоль достигала размера 3 см³.

 

Рис. 3. Влияние имплантатов магнетита, гематита и окиси алюминия на динамику роста солидной опухоли Эрлиха у белых мышей-самок. 0 — начальная точка эксперимента — перевивка опухоли Эрлиха. По оси абсцисс — дни после перевивки опухоли. Вертикальная стрелка — день имплантирования магнетита, гематита или окиси алюминия в центр опухоли. I — контрольные мыши (изотонический раствор натрия хлорида); II — магнетит; III — гематит; IV — окись алюминия. Разница между контрольной и опытными группами на всех сроках исследования статистически недостоверна

Fig. 3. Influence of implants of magnetite, hematite and aluminium oxide on the dynamics of the growth of Erlich solid tumor in white female mice. 0 — initial point of the trial — transplantation of Erlich tumor. On the axis abscissa — days after transplantation of the tumor. Vertical arrow — a day of implanting magnetite, hematite or aluminium oxide in the centre of tumor. I — control mice (isotonic sodium chloride solution); II — magnetite; III — hematite; IV — aluminium oxide. The difference between control and experienced groups for all the duration of the study is statistically unreliable

 

Рис. 4. Опухоль Эрлиха. 29-е сутки после перевивки. Слева — опухолевые клетки, справа — некротическая масса. Окраска гематоксилином и эозином, ×50

Fig. 4. Tumor of Erlich. 29^th days after transplantatio tumoris. On the left are tumor cages. On the right are tumor nekroz. Colouring by hematoxylin and eosin, ×50

 

Как следует из рис. 3, ни магнетит, ни гематит, ни окись алюминия не оказывали противоопухолевого эффекта в течение всего срока наблюдения. К концу опыта (29-е сутки после перевивки опухоли) в контрольной группе погибло 50 % мышей, такая же гибель наблюдалась в группе животных, которым имплантировали в опухоль окись алюминия (50 %). В группе мышей, которым в опухоль имплантировали магнетит, погибло 30 % животных, а при имплантации в опухоль гематита — 20 %.

При обследовании опухолевых узлов было выявлено, что центральная часть опухоли (около половины) представляет некротическую массу.

При патологоанатомическом обследовании оставшихся в живых к 29-му дню мышей-опухоленосителей не было обнаружено изменений в весовых коэффициентах. Вес опухолей в контрольной группе составил 11,4 ± 0,9 г, в группе мышей, которым в опухоль имплантировали магнетит, — 9,4 ± 1,0 г, в группе животных с имплантацией в опухоль гематита — 10,9 ± 1,0 г и в группе с имплантацией в опухоль окиси алюминия — 10,8 ± 0,9 г.

Следует отметить, что кристаллы магнетита (FeO · Fe₂O₃), как и ГФБ (BaO · 6Fe₂O₃), имеют структуру шпинели, обладают магнитными свойствами и во многих отношениях схожи. Тем не менее антибластомный эффект проявляет только ГФБ, что продемонстрировано в данной работе на примере опухоли Эрлиха достаточно большого размера (~3 см³ на момент инъекции ГФБ) и ранее в еще более выраженной форме на модели опухоли Эрлиха меньшего размера (~2 см³) — торможение роста бластомы на 66 % и увеличение продолжительности жизни на 65 % [4–6]. Проведенные нами ранее детальные исследования мембранного и дзета-потенциалов [6] показали, что в опухолевых клетках они снижаются после инъекции ГФБ с остаточным магнитным полем имплантата около 100–150 мГс (за вычетом магнитного поля Земли), то есть его действие ограничено размером опухоли. Это позволило предположить, что в основе противоопухолевого действия ГФБ лежат изменения мембран опухолевых клеток под действием слабого постоянного магнитного поля.

Выводы

1. Гексаферрит бария, имплантируемый в опухоль Эрлиха большого размера (3 см³ на момент инъекции ГФБ), оказывал умеренный противоопухолевый эффект на всех сроках исследования (до 28-го дня). Остаточное магнитное поле импланта ГФБ составляло около 150 мГс (после вычета магнитного поля Земли).
2. Окислы железа с остаточным магнитным полем, близким к нулю, — магнетит и гематит — не оказывали противоопухолевого действия.
3. Окись алюминия и кремнезем также не проявляли противоопухолевого эффекта на всех сроках исследования. Напротив, в отношении кремнезема наблюдалась даже некоторая тенденция к стимуляции роста бластомы.
4. В то время как во всех группах к 28–29-му дню после перевивки опухоли погибло от 20 до 50 % мышей-опухоленосителей, в группе с имплантацией в опухоль кремнезема выжили все животные, а сами опухоли были без признаков некроза.

Дополнительная информация

Финансирование. Работа выполнена в рамках госконтракта с Министерством здравоохранения РФ «Разработка инновационных технологий и набора реагентов для высокоэффективного выделения свободно циркулирующей ДНК крови на основе бифункционального ДНК-связывающего нанокомплекса».

Соблюдение этических норм. Выполнение исследования одобрено протоколом Комитета по этике № 08-19 от 22.11.2019.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список сокращений

ГФБ (BaO · 6Fe₂O₃) — гексаферрит бария; FeO ∙ Fe₂O₃ — магнетит; Fe₂O₃ — гематит; Al₂O₃ — окись алюминия; nSiO₂ ∙ mH₂O — синтетический кремнезем; V — объем опухолевого узла; Т% — торможение роста опухоли.

About the authors

Sofia F. Vershinina

Federal State Budget Institution Acad. A.M. Granov Russian Research Centre оf Radiology and Surgical Technologies Ministry of Healthcare of Russia

Author for correspondence.
Email: sofia.vershinina2010@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8751-9168
SPIN-code: 5864-5627

leading researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

Vladimir I. Evtushenko

Federal State Budget Institution Acad. A.M. Granov Russian Research Centre оf Radiology and Surgical Technologies Ministry of Healthcare of Russia

Email: sofia.vershinina2010@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1577-4178
SPIN-code: 6167-0141

head researcher

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files