Dexamethasone-induced changes in the expression profile of “neuroinflammatory” genes

Tatiana V. Tiutiunnik; Тютюнник Татьяна Валентиновна; Valentina M. Kudrinskaya; Кудринская Валентина Михайловна; Daria A. Obukhova; Обухова Дарья Алексеевна; Viktoriya A. Maystrenko; Майстренко Виктория Александровна; Nina S. Pestereva; Пестерева Нина Сергеевна

doi:10.17816/MAJ630012

Дексаметазон-индуцированные изменения профиля экспрессии генов «нейровоспаления»

Авторы: Тютюнник Т.В.¹, Кудринская В.М.¹, Обухова Д.А.¹, Майстренко В.А.¹, Пестерева Н.С.¹
Учреждения:
1. Институт экспериментальной медицины
Выпуск: Том 24, № 3 (2024)
Страницы: 133-138
Раздел: Оригинальные исследования
Статья опубликована: 24.12.2024
URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/630012
DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ630012
ID: 630012

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Обоснование. Глюкокортикоиды играют важную роль в развитии стрессорного ответа организма. Синтетические глюкокортикоиды, такие как дексаметазон, широко применяются в медицине благодаря их противовоспалительным эффектам. Однако существуют данные, что лекарственные препараты на основе глюкокортикоидов, применяемые в достаточно больших дозах, могут вызывать провоспалительные эффекты, воздействуя преимущественно на гиппокамп в центральной нервной системе как на наиболее пластичную структуру мозга. Важно отметить, что доза, схема и время введения могут повлиять на эффекты, оказываемые глюкокортикоидами, и именно поэтому важной медико-биологической задачей является выбор оптимальных параметров введения глюкокортикоидов для достижения наиболее эффективных результатов лечения.

Цель — изучить влияние периферического введения синтетического глюкокортикоида дексаметазона в дозе 8 мг/кг на развитие нейровоспаления в гиппокампе крыс на разных сроках после введения.

Материалы и методы. В эксперименте использовали 32 половозрелых самца крыс Wistar, распределенных на 8 групп по 4 головы в каждой. Животным вводили дексаметазон в дозе 8 мг/кг и производили декапитацию на разных сроках (через 1, 3, 9, 12, 18, 24, 48 ч после введения), группа К — контрольная, животным вводили 0,9 % раствор натрия хлорида. Далее методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени производили анализ экспрессии генов «нейровоспаления».

Результаты. В настоящем исследовании мы обнаружили увеличение экспрессии генов провоспалительных цитокинов AIF1 (IBA-1) и IL-1β через 12 и TNF-α через 24 ч после введения дексаметазона в дозе 8 мг/кг, что может свидетельствовать о нейровоспалительном действии дексаметазона в данной дозе. При этом стоит отметить, что уровень экспрессии гена NF-êB остался неизменным, возможно, из-за активации компенсаторных механизмов для контроля воспаления или стресса.

Заключение. Повышение мРНК маркеров воспаления IL-1β, TNF-α и AIF1 через 12 ч после введения дексаметазона крысам в дозе 8 мг/кг в гиппокампе может свидетельствовать о переключении эффекта этого препарата с противовоспалительного на провоспалительный, что следует учитывать при назначении дексаметазона при лечении ряда заболеваний.

Ключевые слова

дексаметазон, нейровоспаление, цитокины, гиппокамп

Полный текст

Обоснование

Глюкокортикоиды (ГК) — важный компонент адаптивного ответа организма на стрессогенные стимулы, их действие реализуется через гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось. Типичная стрессовая реакция сопровождается повышением уровня ГК, которые оказывают противовоспалительное, имунносупрессивное, противоаллергическое и антитоксическое действие на организм. Противовоспалительные эффекты ГК широко используют в клинической практике. Известно, что фармакологические агенты на основе ГК (дексаметазон, преднизолон и др.) применяют как противовоспалительные препараты. Например, при рассеянном склерозе суточная доза дексаметазона может достигать 30 мг/кг, а при однократном введении обычно используют дозу 5–12 мг/кг [1]. Однако ГК могут вызывать негативные побочные эффекты, в том числе индуцировать нейровоспаление [2]. Считается, что провоспалительные эффекты ГК могут инициировать или интенсифицировать процесс нейродегенерации.

Основная структура центральной нервной системы, на которую действуют ГК, — гиппокамп — область мозга, отвечающая за обучение и память. Считается, что гиппокамп наиболее уязвим для нейровоспаления и нейродегенерации из-за самой высокой плотности рецепторов ГК в мозге, что потенциально обусловливает высокую чувствительность клеток данной структуры к стрессу. Данные, описывающие про- и противовоспалительнное действие ГК, противоречивы. В зависимости от дозы, способа и схемы введения эффекты ГК могут быть диаметрально противоположными. Например, длительное повышение уровня ГК, в том числе за счет введения синтетеических аналогов ГК, активирует нейровоспаление в гиппокампе, изменяя и цитокиновый профиль, модулируя уровень экспрессии AIF1(IBA1), IL-1β, TNF-α и NF-êB, который, в свою очередь, контролирует экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла [2]. В высоких концентрациях ГК могут оказывать иммуносупрессивное действие. Бóльшая часть долгосрочных противовоспалительных эффектов ГК может быть вызвана важным негативным регуляторным механизмом, называемым трансрепрессией, а также косвенным воздействием ГК через повышение уровня эндоканнабиноидов, которые, как известно, оказывают комплексное влияние на воспаление. Все это может приводить к ингибированию генной экспрессиии цитокинов в периферических органах и мозге при остром и/или кратковременном воздействии ГК [2]. Таким образом, имеющихся данных недостаточно для понимания механизмов действия ГК на клетки центральной нервной системы.

Цель исследования — изучение влияния периферического введения синтетического ГК дексаметазона в дозе 8 мг/кг на развитие процесса нейровоспаления в гиппокампе крыс на разных сроках после введения.

Материалы и методы

Животные

Во всех экспериментах использовали взрослых самцов крыс Вистар (180 ± 20 г). Крысы были приобретены в питомнике «Рапполово» (Ленинградская область, Россия). Животных содержали в клетках по 4–5 особей в каждой, в помещении с контролируемыми условиями (температура 24 ± 1 °C, влажность 45–65 %, цикл свет/темнота 12 ч). Корм в гранулах и водопроводная вода были доступны ad libitum в течение всего экспериментального периода.

Все эксперименты проводили в соответствии с институциональными рекомендациями и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здоровья (NIH), а также с национальным законодательством (Минздрав России № 267 от 19 июня 2003 г.; Руководство по использованию лабораторных животных, Москва, 2005).

Схема эксперимента

32 половозрелых самца крыс методом блочной рандомизации распределили на 8 групп по 4 головы в каждой. Животные получали внутрибрюшинную инъекцию дексаметазона в дозе 8 мг/кг. Далее проводили декапитацию на разных сроках (через 1, 3, 9, 12, 18, 24, 48 ч после введения), группа К — контрольная, животным внутрибрюшинно вводили 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Через разные сроки после инъекции крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением Золетила 100 (35 мг/кг) и обезглавливали гильотиной (Open-Science AE1601, RPC OpenScience Ltd, Россия). Мозг крыс быстро извлекали и брали образцы гиппокампа. Области мозга идентифицировали с помощью атласа мозга [3]. Все собранные ткани немедленно замораживали и хранили при температуре –80 °С до анализа.

Выделение мРНК и обратная транскрипция

Тотальную мРНК выделяли из замороженных тканей (50–100 мг) с помощью набора ExtractRNA (#BC032, Евроген, Россия), следуя протоколам производителя для фенол-хлороформной экстракции. Концентрацию образцов РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop2000 (Thermo Scientific, США), а чистоту проверяли по соотношению оптической плотности A260/A280 >1,9 для каждого образца. После этого образцы хранили при температуре –80 °C до дальнейшего анализа.

Для синтеза комплементарной ДНК использовали в общей сложности 2 мкг мРНК. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием коммерческого набора реагентов Reverta (#SK022S, Евроген, Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную комплементарную ДНК хранили при температуре –20 °C для дальнейшего использования.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили с использованием системы BioRad CFX96 Real-TimeSystem (Bio-Rad Laboratories, США) и коммерческого набора реагентов qPCRmix-HSSYBR-5x (#PK147L, Евроген, Россия). Последовательности праймеров представлены в таблице. Программа полимеразной цепной реакции включала начальную денатурацию при 95 °C в течение 5 мин, 35 циклов реакции, состоящих из 20 с денатурации (94 °C), 40 с отжига (60 °C) и 50 с элонгации (72 °C). В качестве референсных генов для контроля нормализации были выбраны гены пептидил-пролил-изомеразы А (PPI) и 18S. Для определения относительных уровней экспрессии генов использовали метод delta-delta CT.

Таблица / Table

Праймеры, использованные для полимеразной цепной реакции

Primers used for real-time polymerase chain reaction

Имя	Последовательность праймеров (5′ → 3′)
PPI	F: GGATTTGGCTATAAGGGTTC R: GTTGTCCACAGTCGGAGA
18S	F: ACGGACCAGAGCGAAAGCAT R: TGTCAATCCTGTCCGTGTCC
IL-1β	F: TCTTCGAGGCACAAGGCA R: AGAGGTCCAGGTCCTGGAA
AIF1	F: GAAGCGAATGCTGGAGAAAC R: CCTCCAATTAGGGCAACTCA
TNF-α	F: CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA R: CTCCTGGTATGAAATGGCAAATC
NF-êB	F: CATGCGTTTCCGTTACAAGTGCGA R: TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCTGT

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программы GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, США). Все данные представлены в виде медианы и экспериментальных точек. Статистические различия проверяли с помощью непараметрического теста Краскела – Уоллиса, с последующим применением post-hoc-теста Данна. Порог статистической значимости p < 0,05, H — статистика теста Краскела – Уоллиса.

Результаты и обсуждение

Известно, что прием высоких доз кортикостерона увеличивал экспрессию генов, связанных с воспалением, таких как мРНК AIF1 (IBA-1), в гиппокампе [4].

Действительно, оказалось (см. рисунок, a), что в клетках гиппокампа содержание мРНК AIF1 (IBA-1) (H = 17,45, p = 0,0147) в группе 12 было выше чем в контрольной группе К в 3,2 раза (р < 0,0096). Похожий результат наблюдали и для IL-1β (см. рисунок, b): содержание мРНК данного гена (H = 19,46, p = 0,0069) в группе 12 было выше чем в группе 48 в 4 раза (р < 0,0146). Так, на 12-м часу после введения дексаметазона в дозе 8 мг/кг наблюдается максимальное увеличение экспрессии мРНК AIF1 (IBA-1), что может говорить о пролонгированном провоспалительном действии дексаметазона в такой однократной высокой дозе или о «переключении» противовоспалительного действия на провоспалительное [5].

Рисунок. Уровень мРНК генов AIF1 (a), IL-1β (b), TNF-α (c), NF-κB (d) в гиппокампе крыс, получавших однократную внутрибрюшную инъекцию дексаметазона в дозе 8 мг/кг, на разных сроках после введения. По оси ординат показано относительное изменение экспрессии (2–ΔΔCT). Данные представлены в виде медианы и экспериментальных точек. * p < 0,01 относительно контрольной группы; ** p < 0,05 относительно группы 48; ^* p < 0,05 относительно группы 1 (тест Краскела – Уоллиса, post-hoc-тест Данна)

Figure. The mRNA of AIF1 (a), IL-1β (b), TNF-α (c) and NF-κB (d) levels in the hippocampus of rats receiving a single intraperitoneal injection of dexamethasone at a dose of 8 mg/kg at different time points after administration. The ordinate axis shows the relative value of the change in expression (2^–ΔΔCT). Data are presented as median and experimental points. * p < 0.01 relative the control group; ** p < 0.05 relative the group 48; ^* p < 0.05 relative the group 1 (Kruskel–Wallis test, post hoc Dunn’s test)

Более того, в микроглии гиппокампа, выделенной из головного мозга крыс, подвергшихся воздействию высоких уровней кортикостерона, наблюдалась повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α [6].

Действительно, похожие результаты были в нашем исследовании при анализе изменения экспрессии TNF-α. Наблюдали увеличение экспрессии мРНК TNF-α (H = 15,56, p = 0,0295) (см. рисунок, с) на 24-м часе после введения относительно группы 1 в 3,4 раза (p = 0,0223).Таким образом, введение дексаметазона в дозе 8 мг/кг приводит к пику экспрессии данного провоспалительного гена на 24-м часе, что коррелирует с работой [7].

Удивительно, однако уровень мРНК провоспалительного гена NF-êB не менялся на разных сроках после введения дексаметазона (см. рисунок, d), хотя уровень экспрессии напрямую связан со взаимодействием с ГК, и введение их малых доз способствует уменьшению экспрессии NF-êB [2].

Заключение

Через 12 ч после однократного внутрибрюшинного введения дексаметазона в дозе 8 мг/кг в гиппокампе крыс было выявлено повышение экспрессии провоспалительных факторов IL-1β, TNF-α и AIF1 — молекулярных биомаркеров нейровоспаления.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания FGWG-2022-0008.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Наибольший вклад распределен следующим образом: Т.В. Тютюнник — методология, валидация, исследование, написание статьи; В.М. Кудринская — визуализация данных, редактирование статьи; Д.А. Обухова — проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени, редактирование статьи; В.А. Майстренко — статистический анализ, редактирование статьи; Н.С. Пестерева — методология, концептуализация, редактирование статьи.

Additional information

Funding source. The work was performed under the state assignment FGWG-2022-0008.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Personal contribution of each author: T.V. Tiutiunnik — methodology, validation, investigation, writing; V.M. Kudrinskaya — data visualization, editing; D.A. Obukhova — real-time polymerase chain reaction, editing; V.A. Maystrenko — statistical analysis, editing; N.S. Pestereva — conceptualization, editing.