Dexamethasone-induced changes in the expression profile of “neuroinflammatory” genes

Tatiana V. Tiutiunnik; Тютюнник Татьяна Валентиновна; Valentina M. Kudrinskaya; Кудринская Валентина Михайловна; Daria A. Obukhova; Обухова Дарья Алексеевна; Viktoriya A. Maystrenko; Майстренко Виктория Александровна; Nina S. Pestereva; Пестерева Нина Сергеевна

doi:10.17816/MAJ630012

Dexamethasone-induced changes in the expression profile of “neuroinflammatory” genes

Authors: Tiutiunnik T.V.¹, Kudrinskaya V.M.¹, Obukhova D.A.¹, Maystrenko V.A.¹, Pestereva N.S.¹
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
Issue: Vol 24, No 3 (2024)
Pages: 133-138
Section: Original research
Published: 24.12.2024
URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/630012
DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ630012
ID: 630012

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

BACKGROUND: Glucocorticoids play an important role in the development of the stress response in the organism. Synthetic glucocorticoids such as dexamethasone are widely used in medicine due to their anti-inflammatory effects. However, there is evidence that glucocorticoid-based drugs used in sufficiently high doses can induce pro-inflammatory effects by affecting predominantly the hippocampus in the central nervous system as the most plastic brain structure. It is important to note that the dose, route and timing of administration can affect the effects of glucocorticoids, and it is therefore an important biomedical task to choose the optimal parameters of glucocorticoid administration in order to achieve the most effective treatment results.

AIM: The aim of our study was to investigate the effect of peripheral administration of a synthetic glucocorticoid, dexamethasone, at a dose of 8 mg/kg on the development of neuroinflammation in the rat hippocampus at different periods after administration.

MATERIALS AND METHODS: Thirty-two sexually mature male Wistar rats distributed into 8 groups of 4 animals each were used in the experiment. The animals were injected with dexamethasone at a dose of 8 mg/kg and decapitated for different periods (1, 3, 9, 12, 18, 24, 48 hours — time of decapitation after administration), group К — control group with saline injection). Further, the cytokine profile expression was analyzed by real-time reverse transcription polymerase chain reaction method.

RESULTS: In this study, we found an increase in the expression of proinflammatory cytokines AIF1 (IBA-1) and IL-1β after 12 and TNF-α after 24 hours after dexamethasone administration at a dose of 8 mg/kg, which may indicate a neuroinflammatory effect of dexamethasone at this dose. It should be noted that the level of NF-êB gene, a marker of inflammation, remained unchanged, possibly due to the activation of compensatory mechanisms to control inflammation or stress.

CONCLUSIONS: The increase in mRNA of inflammatory markers IL-1β, TNF-α and AIF1, in the hippocampus after 12 hours after single dexamethasone administration to rats at a dose of 8 mg/kg may indicate a switch of the effect of this drug from antiinflammatory to proinflammatory, which should be taken into account when dexamethasone is used such a treatment during several diseases.

Keywords

dexamethasone, neuroinflammation, cytokines, hippocampus

Full Text

Обоснование

Глюкокортикоиды (ГК) — важный компонент адаптивного ответа организма на стрессогенные стимулы, их действие реализуется через гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую ось. Типичная стрессовая реакция сопровождается повышением уровня ГК, которые оказывают противовоспалительное, имунносупрессивное, противоаллергическое и антитоксическое действие на организм. Противовоспалительные эффекты ГК широко используют в клинической практике. Известно, что фармакологические агенты на основе ГК (дексаметазон, преднизолон и др.) применяют как противовоспалительные препараты. Например, при рассеянном склерозе суточная доза дексаметазона может достигать 30 мг/кг, а при однократном введении обычно используют дозу 5–12 мг/кг [1]. Однако ГК могут вызывать негативные побочные эффекты, в том числе индуцировать нейровоспаление [2]. Считается, что провоспалительные эффекты ГК могут инициировать или интенсифицировать процесс нейродегенерации.

Основная структура центральной нервной системы, на которую действуют ГК, — гиппокамп — область мозга, отвечающая за обучение и память. Считается, что гиппокамп наиболее уязвим для нейровоспаления и нейродегенерации из-за самой высокой плотности рецепторов ГК в мозге, что потенциально обусловливает высокую чувствительность клеток данной структуры к стрессу. Данные, описывающие про- и противовоспалительнное действие ГК, противоречивы. В зависимости от дозы, способа и схемы введения эффекты ГК могут быть диаметрально противоположными. Например, длительное повышение уровня ГК, в том числе за счет введения синтетеических аналогов ГК, активирует нейровоспаление в гиппокампе, изменяя и цитокиновый профиль, модулируя уровень экспрессии AIF1(IBA1), IL-1β, TNF-α и NF-êB, который, в свою очередь, контролирует экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла [2]. В высоких концентрациях ГК могут оказывать иммуносупрессивное действие. Бóльшая часть долгосрочных противовоспалительных эффектов ГК может быть вызвана важным негативным регуляторным механизмом, называемым трансрепрессией, а также косвенным воздействием ГК через повышение уровня эндоканнабиноидов, которые, как известно, оказывают комплексное влияние на воспаление. Все это может приводить к ингибированию генной экспрессиии цитокинов в периферических органах и мозге при остром и/или кратковременном воздействии ГК [2]. Таким образом, имеющихся данных недостаточно для понимания механизмов действия ГК на клетки центральной нервной системы.

Цель исследования — изучение влияния периферического введения синтетического ГК дексаметазона в дозе 8 мг/кг на развитие процесса нейровоспаления в гиппокампе крыс на разных сроках после введения.

Материалы и методы

Животные

Во всех экспериментах использовали взрослых самцов крыс Вистар (180 ± 20 г). Крысы были приобретены в питомнике «Рапполово» (Ленинградская область, Россия). Животных содержали в клетках по 4–5 особей в каждой, в помещении с контролируемыми условиями (температура 24 ± 1 °C, влажность 45–65 %, цикл свет/темнота 12 ч). Корм в гранулах и водопроводная вода были доступны ad libitum в течение всего экспериментального периода.

Все эксперименты проводили в соответствии с институциональными рекомендациями и Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здоровья (NIH), а также с национальным законодательством (Минздрав России № 267 от 19 июня 2003 г.; Руководство по использованию лабораторных животных, Москва, 2005).

Схема эксперимента

32 половозрелых самца крыс методом блочной рандомизации распределили на 8 групп по 4 головы в каждой. Животные получали внутрибрюшинную инъекцию дексаметазона в дозе 8 мг/кг. Далее проводили декапитацию на разных сроках (через 1, 3, 9, 12, 18, 24, 48 ч после введения), группа К — контрольная, животным внутрибрюшинно вводили 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида. Через разные сроки после инъекции крыс наркотизировали внутрибрюшинным введением Золетила 100 (35 мг/кг) и обезглавливали гильотиной (Open-Science AE1601, RPC OpenScience Ltd, Россия). Мозг крыс быстро извлекали и брали образцы гиппокампа. Области мозга идентифицировали с помощью атласа мозга [3]. Все собранные ткани немедленно замораживали и хранили при температуре –80 °С до анализа.

Выделение мРНК и обратная транскрипция

Тотальную мРНК выделяли из замороженных тканей (50–100 мг) с помощью набора ExtractRNA (#BC032, Евроген, Россия), следуя протоколам производителя для фенол-хлороформной экстракции. Концентрацию образцов РНК определяли на спектрофотометре NanoDrop2000 (Thermo Scientific, США), а чистоту проверяли по соотношению оптической плотности A260/A280 >1,9 для каждого образца. После этого образцы хранили при температуре –80 °C до дальнейшего анализа.

Для синтеза комплементарной ДНК использовали в общей сложности 2 мкг мРНК. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием коммерческого набора реагентов Reverta (#SK022S, Евроген, Россия) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную комплементарную ДНК хранили при температуре –20 °C для дальнейшего использования.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени

Количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени проводили с использованием системы BioRad CFX96 Real-TimeSystem (Bio-Rad Laboratories, США) и коммерческого набора реагентов qPCRmix-HSSYBR-5x (#PK147L, Евроген, Россия). Последовательности праймеров представлены в таблице. Программа полимеразной цепной реакции включала начальную денатурацию при 95 °C в течение 5 мин, 35 циклов реакции, состоящих из 20 с денатурации (94 °C), 40 с отжига (60 °C) и 50 с элонгации (72 °C). В качестве референсных генов для контроля нормализации были выбраны гены пептидил-пролил-изомеразы А (PPI) и 18S. Для определения относительных уровней экспрессии генов использовали метод delta-delta CT.

Таблица / Table

Праймеры, использованные для полимеразной цепной реакции

Primers used for real-time polymerase chain reaction

Имя	Последовательность праймеров (5′ → 3′)
PPI	F: GGATTTGGCTATAAGGGTTC R: GTTGTCCACAGTCGGAGA
18S	F: ACGGACCAGAGCGAAAGCAT R: TGTCAATCCTGTCCGTGTCC
IL-1β	F: TCTTCGAGGCACAAGGCA R: AGAGGTCCAGGTCCTGGAA
AIF1	F: GAAGCGAATGCTGGAGAAAC R: CCTCCAATTAGGGCAACTCA
TNF-α	F: CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAA R: CTCCTGGTATGAAATGGCAAATC
NF-êB	F: CATGCGTTTCCGTTACAAGTGCGA R: TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCTGT

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программы GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, США). Все данные представлены в виде медианы и экспериментальных точек. Статистические различия проверяли с помощью непараметрического теста Краскела – Уоллиса, с последующим применением post-hoc-теста Данна. Порог статистической значимости p < 0,05, H — статистика теста Краскела – Уоллиса.

Результаты и обсуждение

Известно, что прием высоких доз кортикостерона увеличивал экспрессию генов, связанных с воспалением, таких как мРНК AIF1 (IBA-1), в гиппокампе [4].

Действительно, оказалось (см. рисунок, a), что в клетках гиппокампа содержание мРНК AIF1 (IBA-1) (H = 17,45, p = 0,0147) в группе 12 было выше чем в контрольной группе К в 3,2 раза (р < 0,0096). Похожий результат наблюдали и для IL-1β (см. рисунок, b): содержание мРНК данного гена (H = 19,46, p = 0,0069) в группе 12 было выше чем в группе 48 в 4 раза (р < 0,0146). Так, на 12-м часу после введения дексаметазона в дозе 8 мг/кг наблюдается максимальное увеличение экспрессии мРНК AIF1 (IBA-1), что может говорить о пролонгированном провоспалительном действии дексаметазона в такой однократной высокой дозе или о «переключении» противовоспалительного действия на провоспалительное [5].

Рисунок. Уровень мРНК генов AIF1 (a), IL-1β (b), TNF-α (c), NF-κB (d) в гиппокампе крыс, получавших однократную внутрибрюшную инъекцию дексаметазона в дозе 8 мг/кг, на разных сроках после введения. По оси ординат показано относительное изменение экспрессии (2–ΔΔCT). Данные представлены в виде медианы и экспериментальных точек. * p < 0,01 относительно контрольной группы; ** p < 0,05 относительно группы 48; ^* p < 0,05 относительно группы 1 (тест Краскела – Уоллиса, post-hoc-тест Данна)

Figure. The mRNA of AIF1 (a), IL-1β (b), TNF-α (c) and NF-κB (d) levels in the hippocampus of rats receiving a single intraperitoneal injection of dexamethasone at a dose of 8 mg/kg at different time points after administration. The ordinate axis shows the relative value of the change in expression (2^–ΔΔCT). Data are presented as median and experimental points. * p < 0.01 relative the control group; ** p < 0.05 relative the group 48; ^* p < 0.05 relative the group 1 (Kruskel–Wallis test, post hoc Dunn’s test)

Более того, в микроглии гиппокампа, выделенной из головного мозга крыс, подвергшихся воздействию высоких уровней кортикостерона, наблюдалась повышенная экспрессия провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α [6].

Действительно, похожие результаты были в нашем исследовании при анализе изменения экспрессии TNF-α. Наблюдали увеличение экспрессии мРНК TNF-α (H = 15,56, p = 0,0295) (см. рисунок, с) на 24-м часе после введения относительно группы 1 в 3,4 раза (p = 0,0223).Таким образом, введение дексаметазона в дозе 8 мг/кг приводит к пику экспрессии данного провоспалительного гена на 24-м часе, что коррелирует с работой [7].

Удивительно, однако уровень мРНК провоспалительного гена NF-êB не менялся на разных сроках после введения дексаметазона (см. рисунок, d), хотя уровень экспрессии напрямую связан со взаимодействием с ГК, и введение их малых доз способствует уменьшению экспрессии NF-êB [2].

Заключение

Через 12 ч после однократного внутрибрюшинного введения дексаметазона в дозе 8 мг/кг в гиппокампе крыс было выявлено повышение экспрессии провоспалительных факторов IL-1β, TNF-α и AIF1 — молекулярных биомаркеров нейровоспаления.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания FGWG-2022-0008.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Наибольший вклад распределен следующим образом: Т.В. Тютюнник — методология, валидация, исследование, написание статьи; В.М. Кудринская — визуализация данных, редактирование статьи; Д.А. Обухова — проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени, редактирование статьи; В.А. Майстренко — статистический анализ, редактирование статьи; Н.С. Пестерева — методология, концептуализация, редактирование статьи.

Additional information

Funding source. The work was performed under the state assignment FGWG-2022-0008.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Personal contribution of each author: T.V. Tiutiunnik — methodology, validation, investigation, writing; V.M. Kudrinskaya — data visualization, editing; D.A. Obukhova — real-time polymerase chain reaction, editing; V.A. Maystrenko — statistical analysis, editing; N.S. Pestereva — conceptualization, editing.

About the authors