Коррекция нейроиммунных нарушений на модели поствирусного синдрома хронической усталости препаратом рецепторного антагониста IL-1

Полный текст

Список сокращений

СХУ — синдром хронической усталости; ПвСХУ — поствирусный синдром хронической усталости; Poly IC — полирибоинозитиловая:полирибоцитидиловая кислота; IL-1α и β — интерлейкин 1 альфа и бета; IL-1RA — антагонист рецептора интерлейкина 1

Обоснование

Синдром хронической усталости (СХУ) — это состояние неизвестного происхождения, которое характеризуется наличием сильной усталости в течение как минимум 6 мес. наряду с несколькими сопутствующими симптомами, такими как головные боли, боли в горле, в мышцах и суставах [1]. В последнем принятом в России пересмотре международной классификации болезней (МКБ 10) СХУ внесен как «Синдром хронической усталости / миалгический энцефаломиелит» (СХУ/МЭ, синдром утомляемости после перенесенной вирусной болезни, болезнь системной непереносимости нагрузок) [2].

Поствирусная усталость впервые была зафиксирована во время эпидемии испанского гриппа 1918 г., вызванного вирусом гриппа A (H1N1) [3]. Позднее во время пандемии 2003 г., вызванной вирусом гриппа H1N1, уровень утомляемости среди молодого населения в возрасте до 30 лет составил 2,8 % [4]. Утомляемость также отмечена после инфицирования вирусами Эбола (9–28 %) [5], Эпштейна – Барр (9 %) [6] и вирусной инфекции с клиническими чертами мононуклеоза (11–38 %) [7]. Впоследствии было показано, что коронавирус SARS-CoV-2, вызывающий тяжелый острый респираторный синдром, также приводит к длительной утомляемости. Поствирусная усталость при этой инфекции — частое явление, поражающее пациентов даже с легкой бессимптомной формой COVID-19. Все эти наблюдения сформировали представление о том, что хроническая усталость после перенесенной вирусной инфекции — обычное явление, причем физическая слабость сопровождается и когнитивными нарушениями [8].

Неврологические нарушения — важная характеристика СХУ. Их связывают со специфическим нейровоспалением, в которое вовлечены активированные клетки микроглии и астроциты, при этом наблюдаются нарушения серотониновой трансмиссии и признаки дисфункции гипоталамо-гипофизарной надпочечниковой оси, что приводит к низкому уровню циркулирующего кортизола [9]. Сходная симптоматика и неврологические нарушения наблюдаются и у лиц, перенесших COVID-19, особенно его «долгую» или «хроническую» форму [10, 11].

Для исследования патогенеза поствирусного СХУ (ПвСХУ) японский исследователь Т. Катафучи с соавторами [12] разработали соответствующую животную модель на грызунах, в которой для имитации вирусных инфекций использовали введение некодирующей двухцепочной РНК, которая, как и вирусная РНК, распознается через соответствующие сенсоры, в частности TLR3, RIG-1 и -2. Показано, что внутрибрюшинное введение синтетической полирибоинозитиловой:полирибоцитидиловой кислоты (Poly IC) в дозе 1–3 мг/кг индуцирует усталость продолжительностью около 2 нед., которая фиксируется по отказу от ориентировочных и игровых действий в поведенческих и локомоторных тестах.

Центральным регулятором восприятия усталости является мозг. Важную роль в развитии центральной усталости играют цитокины раннего воспалительного ответа, особенно интерлейкин 1 альфа (IL-1α) и интерлейкин 1 бета (IL-1β), что свидетельствует о связи между воспалением и процессами в центральной нервной системе [13]. Известно, что повышение в головном мозге уровня IL-1 способствует поведенческим изменениям, называемым «болезненным поведением», которые включают повышенное чувство усталости и депрессивное настроение, потерю интереса к социальным взаимодействиям и снижение физической активности, как у животных, так и у людей [14–17]. Цитокины IL-1α и IL-1β определены как важные инициаторы нейровоспаления. В модели ПвСХУ исследователями группы Т. Катафучи [18] было показано, что увеличение степени экспрессии гена IL-1 в гипоталамусе предшествует повышению экспрессии серотонинового транспортера 5НТТ, связанной с повышенной утомляемостью/усталостью.

Основная функциональная мишень IL-1α и IL-1β — рецептор IL-1 типа 1 (IL-1R1), блокирующим лигандом которого является цитокин антагонист рецептора IL-1 (IL-1RA) [19]. В мозге функциональная экспрессия IL-1R1 выявлена в астроцитах, микроглии, нейронах и эндотелиальных клетках [20]. Регуляторная роль IL-1R1 в активации врожденной иммунной системы делает его мишенью для блокирования последующих эффектов IL-1 [21]. Исследования с участием препарата IL-1RA (анакинры) предоставили убедительные доказательства влияния IL-1 на развитие усталости: назначение анакинры пациентам с ревматоидным артритом не только снижало активность заболевания, но и приводило к значительному и устойчивому снижению уровня усталости [22].

Цель настоящего исследования — определить возможность коррекции утомляемости/усталости препаратом рекомбинантного цитокина IL-1RA в условиях экспериментальной модели поствирусного СХУ у крыс.

Материалы и методы

Работа выполнена на крысах-самцах породы Wistar массой 230–250 г. Животных содержали в условиях вивария при комнатной температуре с 12-часовым циклом свет/темнота, свободным доступом к воде и пище, на стандартной диете в соответствии с нормами содержания лабораторных животных. Все процедуры с животными проводили в одно и то же время.

СХУ моделировали при помощи однократной внутрибрюшинной инъекции препарата Poly IC (Sigma) в дозе 3 мг/кг массы. Животных выводили из эксперимента на 7-й и 10-й день путем декапитации, с соблюдением правил эвтаназии согласно требованиям п. 12 Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном отношении к животным. Эксперименты проводили в соответствии с Национальным стандартом РФ ГОСТ Р-53434–2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» и Приказом Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики». Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены на заседании биоэтической комиссии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины».

Препарат рекомбинантного цитокина IL-1RA (ГосНИИОЧБ, Санкт-Петербург, Россия, зарегистрирован в Госреестре лекарственных средств как ЛСР-007452/10 от 30.07.2010) вводили подкожно в дозе 50 мг/кг массы тела животного в 0,5 мл изотонического раствора NaCl однократно в первые сутки после введения препарата Poly IC. Дозу рекомбинантного IL-1RA выбирали эмпирически, на основании ранее проведенных исследований в области нейропротекции при черепно-мозговой травме [23].

Для проведения эксперимента было сформировано пять групп животных:

1) контрольные — получавшие 0,5 мл изотонического раствора NaCl, n = 10;

2) получавшие однократную инъекцию Poly IC (модель СХУ), выводимые из эксперимента на 7-й день, n = 10;

3) получавшие однократную инъекцию Poly IC (модель СХУ), выводимые из эксперимента на 10-й день, n = 10;

4) получавшие однократную инъекцию Poly IC (модель СХУ, пролеченные) и лечение препаратом IL-1RA, выводимые из эксперимента на 7-й день, n = 10;

5) получавшие однократную инъекцию Poly IC (модель СХУ, пролеченные) и лечение препаратом IL-1RA, выводимые из эксперимента на 10-й день, n = 10.

Проведенные ранее исследования позволили определить, что снижение двигательной активности у крыс в данной модели ПвСХУ развивается на 3-и сутки, достигает максимума к 7-м суткам и восстанавливается на 14-е сутки после введения Poly IC [24]. В связи с этим обследование животных проводили на 7-е и 10-е сутки, когда проявления усталости были наиболее выражены.

Регистрацию поведенческих реакций животных проводили в тесте «открытое поле». Установка «открытое поле» представляла собой открытую ярко освещенную круглую арену диаметром 1 м и высотой стенок 40 см, расчерченную на центральные и периферические сектора, с отверстиями в дне. Животное помещали в центр арены и регистрировали поведение в течение 5 мин. Каждое животное помещали в арену однократно с целью избежать эффекта привыкания к условиям теста. Поведенческие реакции регистрировали и анализировали с использованием программного обеспечения VideoMot 2 (TSESystems, Германия), оценивая среднюю скорость передвижения, общую длину пройденного пути (пробег, дистанция), общую продолжительность актов грумминга и фризинга (замирание).

Для оценки физической активности использовали тест «принудительное плаванье», в котором регистрировали продолжительность плавания животных с утяжелением, равным 10 % массы тела.

Для оценки концентрации молочной кислоты в крови экспериментальных животных собирали кровь через 20 мин после форсированной нагрузки (плавание с утяжелением). Анализ проводили методом сопряженных реакций, катализируемых лактатдегидрогеназой и пероксидазой при помощи набора фирмы ООО «Ольвекс Диагностикум» (Россия) на спектрофлуориметре BMG PolarStar.

Определение цитотоксической активности лимфоцитов. Выделенные из селезенки и отмытые в изотоническом растворе NaCl лимфоциты разводили в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % инактивированной фетальной сыворотки (Биолот, Санкт-Петербург). Клетки (1 × 10⁵ клеток/мл) использовали для определения пролиферативной и цитотоксической активности. В качестве мишеней (2 × 10⁴ клеток/лунка) для определения специфической цитотоксичности спленоцитов крыс использовали клетки эритромиелолейкоза человека К-562 (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), которые поддерживали in vitro в среде RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной сыворотки, 2 ммоль/л глутамина, 1,2 ммоль/л HEPES (pH 7,3), 1,2 % глюкозы и 0,08 мг/мл пенициллина-стрептомицина (Биолот). Соотношение эффектор/мишень составляло 2 : 1, 5 : 1 и 10 : 1. Окрашивание проводили метаболическим красителем ресазурин, для измерения степени окраски использовали спектрофлуориметр BMG PolarStar.

Определение пролиферативной активности лимфоцитов селезенки осуществляли при помощи реакции бласттрансформации при добавлении к пробам лектина конканавалина А. Результат реакции оценивали методом проточной цитометрии. Клетки предварительно фиксировали в 70 % этаноле, обрабатывали РНКазой А и после отмывки окрашивали интеркалирующим красителем йодистый пропидий. Измеряли интенсивность окрашивания на проточном цитофлуориметре Navios (Beckman Coulter, США).

Для анализа экспрессии генов в гипоталамусе брали по 6 животных из каждой группы, после декапитации извлекали мозг и выделяли гипоталамус. Анализ выполнен методом полимераной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией. Выделение общего пула РНК из клеток гипоталамуса и постановку реакции обратной транскрипции проводили при помощи наборов производства компании Биолабмикс (Россия). Полимеразную цепную реакцию осуществляли при помощи готовой реакционной смеси фирмы ЗАО «Синтол» (Россия). Для выявления активности специфических генов использовали праймеры (ООО «Бигль», Россия), представленные в табл. 1.

 

Таблица 1. Последовательность праймеров генов-интереса

Table 1. Genes of interest primer sequence

Ген	Прямая последовательность	Обратная последовательность
IL-1β	tacctgtcctgtgtgatgaa	gatgtgctgatgtaccagtt
IL-10	gaagaccctctggatacagctgc	tgctccactgccttgctttt
INFα	cctgcctcatactcataacc	cttctctcagtcttcccatc
5-HTT	cttgtcatgcagttcaccac	ttagcatctggaaaggcgtca
TLR3	cggtcaaggtgttcaaga	ggatggtagaagcgtgtt
rpS18	ttttggggccttcgtgtccg	cagcaaaggcccaaagactcat

 

Расчет степени экспрессии генов-интереса проводили методом ΔΔСt относительно степени экспрессии референсного гена «домашнего хозяйства» rpS18.

Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического U-критерия Манна – Уитни с поправкой Холма – Бонферрони в связи с малым объемом выборки. Усредненные данные в табл. 2–6 представлены в виде М ± SD, где М — выборочное среднее арифметическое значение, SD — среднеквадратичное отклонение. Различия сравниваемых параметров считали значимыми при р < 0,05.

 

Таблица 2. Поведенческие параметры, концентрация лактата и эмоциональный статус животных на 7-й день после введения полирибоинозитиловой:полирибоцитидиловой кислоты (Poly IC) и терапии антагонистом рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA)

Table 2. Behavioral parameters, lactate concentration and emotional status of animals on the 7th day after administration of the polyinosinic:polycytidylic acid (Poly IC) and IL-1 receptor antagonist (IL-1RA) therapy

Группа животных	Лактат, ммоль/л	Продолжительность плавания, с	Пробег, м	Продолжительность фризинга, с	Продолжительность грумминга, с
Контроль	4,5 ± 1,0	190,6 ± 37,5	20,2 ± 2,4	6,0 ± 3,6	50,0 ± 17,6
Poly IC	7,3 ± 0,4*	102,2 ± 7,3*	15,1 ± 1,7*	34,0 ± 16,5*	24,0 ± 8,0*
Poly IC + IL-1RA	5,3 ± 0,13	99,0 ± 8,4*	17,7 ± 0,9	17,6 ± 7,5*, #	15,6 ± 11,9*

Примечание. Различия достоверны при p < 0,05 * по сравнению с контрольной группой, ^# по сравнению с группой Poly IC.

 

Таблица 3. Относительная степень экспрессии генов IL-1$\beta$, IL-10, INF$\alpha$, 5-HTT, TLR3 в гипоталамусе животных на 7-й день после введения полирибоинозитиловой:полирибоцитидиловой кислоты (Poly IC) и терапии антагонистом рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA)

Table 3. Expression of the IL-1$\beta$, IL-10, INF$\alpha$, 5-HTT, TLR3 genes in the hypothalamus of animals on the 7th day after administration of the polyinosinic:polycytidylic acid (Poly IC) and IL-1 receptor antagonist (IL-1RA) therapy

Группа животных	Экспрессия генов, отн. ед.
	IL-1$\beta$	IL-10	INF$\alpha$	5-HTT	TLR3
Контроль	0,03 ± 0,02	0,59 ± 0,31	0,33 ± 0,11	0,36 ± 0,11	0,91 ± 0,35
Poly IC	0,37 ± 0,19*	2,43 ± 0,78*	3,56 ± 1,10*	1,05 ± 0,29*	11,44 ± 4,06*
Poly IC + IL-1RA	0,06 ± 0,01	0,61 ± 0,14	1,22 ± 0,62*, #	0,75 ± 0,10*	4,12 ± 1,32*, #

Примечание. Различия достоверны при p < 0,05 * по сравнению с контрольной группой, ^# по сравнению с группой Poly IC.

 

Таблица 4. Концентрация молочной кислоты, физическая активность и эмоциональные параметры животных на 10-е сутки после введения полирибоинозитиловой:полирибоцитидиловой кислоты (Poly IC) и терапии антагонистом рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA)

Table 4. Lactic acid concentration, physical activity and emotional parameters of animals on the 10th day after administration of the polyinosinic:polycytidylic acid (Poly IC) and IL-1 receptor antagonist (IL-1RA) therapy

Группа животных	Лактат, ммоль/л	Продолжительность плавания, с	Пробег, м	Продолжительность фризинга, с	Продолжительность грумминга, с
Контроль	6,9 ± 0,2	190,6 ± 37,5	17,7 ± 1,9	6,1 ± 3,9	20,0 ± 6,6
Poly IC	6,5 ± 0,4	120,1 ± 24,1*	18,3 ± 0,8	8,8 ± 1,2	33,5 ± 11,4
Poly IC + IL-1RA	5,1 ± 0,5*	152,2 ± 42,4	20,7 ± 3,8	6,0 ± 1,5#	24,2 ± 11,2#

Примечание. Различия достоверны при p < 0,05 * по сравнению с контрольной группой, ^# по сравнению с группой Poly IC.

 

Таблица 5. Относительная степень экспрессии генов IL-1$\beta$, IL-10, INF$\alpha$, 5-HTT, TLR3 в гипоталамусе животных на 10-е сутки после введения полирибоинозитиловой:полирибоцитидиловой кислоты (Poly IC) и терапии антагонистом рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA)

Table 5. Expression of the IL-1$\beta$, IL-10, INF$\alpha$, 5-HTT, TLR3 genes in the hypothalamus of animals on the 10th day after administration of the polyinosinic:polycytidylic acid (Poly IC) and IL-1 receptor antagonist (IL-1RA) therapy

Группа животных	Экспрессия генов (отн. ед.)
	IL-1$\beta$	IL-10	INF$\alpha$	5-HTT	TLR3
Контроль	0,071 ± 0,029	0,009 ± 0,005	0,157 ± 0,058	0,470 ± 0,201	6,318 ± 2,231
Poly IC	0,062 ± 0,028	0,036 ± 0,013*	0,054 ± 0,020*	1,201 ± 0,502*	11,490 ± 3,888
Poly IC + IL-1RA	0,041 ± 0,021	0,006 ± 0,004	0,031 ± 0,017*	0,619 ± 0,180	11,349 ± 1,410*

Примечание. Различия достоверны при p < 0,05 * по сравнению с контрольной группой, ^# по сравнению с группой Poly IC.

 

Таблица 6. Цитотоксическая и пролиферативная активность лимфоцитов крыс Wistar после введения полирибоинозитиловой: полирибоцитидиловой кислоты (Poly IC) и терапии антагонистом рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA)

Table 6. Cytotoxic and proliferative activity of lymphocytes in Wistar rats after administration of the polyinosinic:polycytidylic acid (Poly IC) and IL-1 receptor antagonist (IL-1RA) therapy therapy

Группа животных	Цитотоксическая активность, %		Пролиферативная активность (in vitro), индекс стимуляции
	7-е сутки	10-е сутки	7-е сутки	10-е сутки
Контроль	11,80 ± 1,89	11,80 ± 1,89	3,25 ± 0,31	3,25 ± 0,31
Poly IC	10,07 ± 2,97	7,07 ± 2,97*	2,17 ± 0,43*	2,55 ± 0,38
Poly IC + IL-1RA	13,47 ± 1,71	12,24 ± 1,51#	2,85 ± 0,75	2,93 ± 0,63

* p < 0,05 по сравнению с показателем у интактных животных; ^# p < 0,05 по сравнению с показателем у животных после применения Poly IC.

 

Результаты

На 7-е сутки после введения Poly IC у крыс фиксировали значительное снижение физической активности (по времени плавания и пробегу) в тестах «принудительное плавание» и «открытое поле» (табл. 2), что может быть следствием как повышенной физической утомляемости, так и эмоционального угнетения животных. О метаболических нарушениях, связанных с физической утомляемостью, свидетельствует значительное повышение концентрации молочной кислоты (лактата) в плазме крови после плавания с утяжелением в группе животных с СХУ по сравнению с контрольными животными. При анализе эмоционального статуса в этой группе животных было выявлено значительное увеличение продолжительности фризинга и снижение продолжительности груминга по сравнению с контрольными животными, что свидетельствует о выраженной реакции тревожности/страха у крыс, получивших Poly IC.

В группе животных, получивших препарат IL-1RA после введения Poly IC, значимого снижения длины пробега в тесте «открытое поле» не выявлено, хотя время принудительного плавания было снижено, как и у нелеченых животных в группе СХУ. При этом концентрация молочной кислоты в сыворотке крови после форсированной нагрузки оставалась на уровне показателей контрольных животных. Продолжительность фризинга в группе пролеченных животных была выше, чем у контрольных животных, но существенно более короткой, чем у крыс группы СХУ, а продолжительность груминга незначимо отличалась от таковой в группе крыс с СХУ и была статистически значимо более короткой, чем у контрольных животных.

Исследование степени экспрессии генов, связанных с воспалением (IL-1β, IL-10, INFα, TLR3) и серотонинового транспортера (5-HTT) на 7-й день эксперимента в группе животных с экспериментальной моделью СХУ показало увеличение степени экспрессии всех исследуемых генов по сравнению с контрольными животными (табл. 3). В группе крыс, пролеченных препаратом IL-1RA, уровень экспрессии IL-1β и IL-10 не был существенно повышен относительно показателей контрольных животных, а экспрессия генов INFα, TLR3 и 5-HTT оставалась повышенной, но значительно более низкой, чем у животных, не получавших препарата IL-1RA.

В представленном эксперименте также прослеживается связь между экспрессией гена серотонинового транспортера 5-HTT и генами раннего воспалительного ответа IL-1 и INFα. Получены соответствующие корреляции IL-1β к 5-HTT (r = 0,737, p < 0,001) и INFα к 5-HTT (r = 0,733, p < 0,001) на 7-й день после введения Poly IC. Наличие подобной взаимосвязи хорошо согласуется с представлением о ведущей роли воспалительных цитокинов в развитии нарушений серотонинэргической системы при ПвСХУ.

На 10-е сутки эксперимента в группе СХУ без лечения не было выявлено различий в концентрации лактата в крови и длины пробега с показателями животных контрольной группы, однако продолжительность плавания все еще оставалась сниженной (табл. 4). Интересно отметить, что в группе крыс, получивших препарат IL-1RA, концентрация лактата после плавания с нагрузкой была даже ниже, чем в группе нелеченых крыс, при этом продолжительность плавания и длина пробега значимо не отличались от показателей контрольных животных. Показатели тревожности (груминг и фризинг) также улучшились у пролеченных животных по сравнению с крысами группы СХУ.

Исследование экспрессии генов в гипоталамусе на 10-е сутки эксперимента показали (табл. 5), что экспрессия IL-1β в обеих группах крыс, получавших Poly IC, не отличалась от показателей контрольных животных, при этом экспрессия генов IL-10, 5-HTT оставалась повышенной у крыс с СХУ, но нормализовалась у крыс, пролеченных IL-1RA. Следует отметить значительное снижение степени экспрессии гена INFα в обеих экспериментальных группах, при этом экспрессия TLR3 в этих же группах экспериментальных животных все еще оставалась повышенной.

Исследование состояния клеток иммунной системы показало, что при моделировании ПвСХУ активность цитотоксических лимфоцитов после введения Poly IC достоверно снижается на 10-е сутки эксперимента, но препарат IL-1RA повысил активность цитотоксических клеток до нормальных значений (табл. 6). У крыс, получивших Poly IC, пролиферативная активность лимфоцитов на 7-й день эксперимента достоверно снижалась, но в группе крыс, пролеченных IL-1RA, существенного изменения пролиферативной активности не выявлено.

Полученные данные свидетельствуют, что введение препарата IL-1RA животным с развивающимся СХУ на 7-е сутки эксперимента приводит к улучшению физической активности (по длине пробега в тесте «открытое поле»), уменьшению концентрации молочной кислоты в сыворотке крови после принудительного плавания и снижению состояния тревожности (продолжительность фризинга) по сравнению с нелечеными животными. При этом экспрессия генов цитокинов, связанных с воспалением и противовирусным ответом, а также гена серотонинового транспортера была существенно ближе к показателям контрольных животных, что может свидетельствовать о более легком течении СХУ в период его максимальных проявлений. Снижение пролиферативной активности лимфоцитов селезенки свидетельствует об угнетении периферических клеток иммунной системы после введения Poly IC и коррекции этого параметра препаратом IL-1RA.

На 10-е сутки эксперимента в группе пролеченных крыс нормализовались все показатели физической активности, цитотоксическая и пролиферативная активность лимфоцитов селезенки, показатели экспрессии генов цитокинов и серотонинового транспортера, показатели тревожности, и только экспрессия TLR3 все еще оставалась повышенной, так же как у нелеченых крыс.

Обсуждение

ПвСХУ связан с развитием нейровоспаления, однако основные механизмы, которые определяют развитие специфической симптоматики, остаются в значительной степени неопределенными. Поэтому особый интерес вызывают результаты, полученные при исследовании модели ПвСХУ на грызунах, в которой используется синтетическая двуцепочечная РНК, имитирующая вирус. Ранее проведенные в нашей лаборатории исследования нейроиммунных нарушений, развивающихся у крыс после введения Poly IC, показали, что в течение первой недели после индукции ПвСХУ развиваются физические, когнитивные и метаболические нарушения, проявляющиеся снижением уровня кортикостерона, цитотоксической активности естественных киллеров и пролиферативной активности лимфоцитов селезенки, а также дисфункцией серотонинергической системы, которая может быть скорректирована введением агониста серотониновых рецепторов (8-OH DRAT) [25–27].

Культуральные исследования глии, проведенные японскими исследователями [28], определили активацию микроглии и астроцитов как ключевой фактор развития ПвСХУ. Было показано, что предварительная обработка миноциклином — ингибитором активации микроглии — предотвращала снижение активности животных после введения Poly IC, в том числе в области префронтальной коры — области мозга, которая, как предполагают, ответственна за ощущения усталости. Инъекция Poly IC увеличивала экспрессию микроглиального IL-1β в этой же области коры, вызывала увеличение экспрессии 5-HTT в астроцитах крысы, которые также были ингибированы предварительной обработкой миноциклином и рекомбинантным IL-1RA. Сопоставляя данные экспериментов in vivo и in vitro, определили вероятную последовательность событий: введение Poly IC вызывает повышение проницаемости гематоэнцефалического барьера, активацию микроглии и макрофагов посредством передачи сигналов от TLR3, что усиливает секрецию IL-1β, IFNα, экспрессию серотонинового транспортера (5-НТТ) в астроцитах, это приводит к снижению внеклеточных уровней серотонина (5-НТ) и снижению активации рецептора подтипа 5-НТ1А [18, 29].

Поскольку повышение продукции IL-1β в центральной нервной системе — важный этап патогенеза ПвСХУ, можно было предполагать, что использование рекомбинантного IL-1RA, конкурентно ингибирующего связывание IL-1α и IL-1β, снизит активность нейровоспаления и уменьшит проявления утомляемости у крыс. Показано, что рекомбинантный IL-1RA (анакинра) при периферическом (системном) введении способен проникать в ткань мозга [30].

Клинические исследования, проведенные у больных ревматоидным артритом и синдромом Шегрена, у которых аутоиммунное воспаление сопровождается развитием постоянной усталости/утомляемости, показало, что лечение препаратами, блокирующими активность IL-1, существенно снижает утомляемость [31]. Однако рандомизированное клиническое исследование ингибирования периферического IL-1 с помощью анакинры в течение 4 нед. не показало значимого снижения утомляемости у женщин с тяжелой формой СХУ, что может быть связано с тем, что в исследование были включены пациенты не только с ПвСХУ [13]. Существенная трудность в подборе однородных пациентов с ПвСХУ для клинических исследований определяет интерес к изучению возможности коррекции при однородной патологии, что позволяет сделать используемая нами модель ПвСХУ.

Проведенное нами исследование выявило, что показатели состояния лимфоцитов селезенки, параметры физической активности и эмоционального состояния, а также экспрессия генов, связанных с воспалением, нормализовались у крыс, пролеченных препаратом IL-1Ra уже к 10-му дню после введения Poly IC, что опережает сроки восстановления нелеченых животных. Однако обращает на себя внимание тот факт, что экспрессия гена TLR3 у пролеченных крыс оставалась такой же высокой, как и у нелеченых. С учетом того, что проведение сигнала от TLR3, возникающего после лигирования Poly IC, расценивают как событие, приводящее к экспрессии интерферонов α/β и провоспалительных цитокинов, определяющих появление симптомов ПвСХУ [32], сохранение высокой экспрессии TLR3 при нормализации экспрессии генов упомянутых цитокинов — это неожиданный результат. Поскольку используемая нами модель ПвСХУ — самозавершающийся процесс, при котором исчезновение симптомов регистрируют на 14-е сутки после введения Poly IC, можно предположить, что сохранение высокой экспрессии TLR3 может быть связано с поствоспалительной регенерацией, при которой РНК, высвобождаемая из поврежденных клеток, образует относительно стабильные двуцепочечные РНК, которые активируют передачу сигналов через TLR3 и запускают репаративные морфогенетические программы [33].

Заключение

Полученные данные свидетельствуют, что применение препарата рекомбинантного IL-1RA в первые сутки после введения Poly IC облегчает проявления ПвСХУ у крыс и завершает патологический процесс к более раннему сроку (к 10-м, а не 14-м суткам). При включении препарата рекомбинантного IL-1RA в схему лечения ПвСХУ у человека также можно ожидать положительных результатов, учитывая эволюционную консервативность и идентичность процессов, связанных с регуляцией клеток иммунной и нервной системы через TLR3 и последующую продукцию провоспалительных цитокинов у крыс и человека.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в соответствии с плановыми исследованиями по теме FGWG-2022-0007 «Исследование молекулярно-клеточных механизмов нейроиммунных взаимодействий и поиск новых подходов для создания корректоров нарушений на основе пептидов системы врожденного иммунитета».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этический комитет. Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены на заседании биоэтической комиссии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» (Протокол заседания № 6/20 от 21.10.2020).

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Наибольший вклад распределен следующим образом: Т.А. Филатенкова — поведенческое исследование, проведение полимеразных цепных реакций, анализ концентрации лактата и полученных данных, написание текста; С.Н. Шанин — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, оценка цитотоксичности и пролиферации; Е.Е. Фомичева — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов; А.М. Ищенко — концепция и дизайн исследования; Н.Б. Серебряная — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, написание текста, обзор литературы, внесение окончательной правки.

Additional information

Funding source. The work was carried out in accordance with planned research on the topic FGWG-2022-0007 “Study of molecular-cellular mechanisms of neuroimmune interactions and the search for new approaches to creating correctors of disorders based on peptides of the innate immune system”.

Competing interest. The author declare that they have no conflict of interest.

Ethics approval. The study protocol was approved by the local ethics committee of the “Institute of Experimental Medicine” (Minutes of the meeting No. 6/20 of October 21, 2020).

Author contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study.

Personal contribution of each author: T.A. Filatenkova , behavioral testing, PCR, lactat concentration, data analysis, writing the text; S.N. Shanin , experimental design, collecting and preparation of samples, cytotoxicity and proliferation; E.E. Fomicheva , experimental design, collecting and preparation of samples; A.M. Ishchenko , experimental design; N.B. Serebryanaya , experimental design, collecting and preparation of samples, data analysis, writing the main part of the text, literature review, making final edits.

Об авторах

Татьяна Александровна Филатенкова

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: lero269@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6911-7456
SPIN-код: 4198-3636

научный сотрудник

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Сергей Николаевич Шанин

Институт экспериментальной медицины

Email: shanins@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8829-6552
SPIN-код: 6915-9098

канд. мед. наук

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Елена Евгеньевна Фомичева

Институт экспериментальной медицины

Email: eefomicheva@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-9271-9757
SPIN-код: 2655-3338

канд. биол. наук

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Александр Митрофанович Ищенко

Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Email: amischenko1946@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6661-6145
SPIN-код: 5860-4216

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург

Наталья Борисовна Серебряная

Институт экспериментальной медицины

Email: nbvma@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2418-9368

д-р мед. наук

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12

Список литературы

Дополнительные файлы