DNA fragmentation and hydroxymethylation in ejaculated spermatozoa in normozoospermia and pathozoospermia

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Низкий уровень рождаемости — одна из важнейших проблем развитых стран. С трудностями зачатия и вынашивания ребенка на сегодняшний день в России сталкивается каждая шестая супружеская пара. Причины бесплодия, как мужского, так и женского, могут быть обусловлены широким кругом факторов: анатомических, физиологических, гормональных, генетических [1–4]. В последние годы благодаря бурному развитию медицинских технологий в области вспомогательной репродукции достигнут значительный прогресс в выявлении причин бесплодия в паре, что является необходимым этапом составления и реализации индивидуального плана лечения пациентов. При этом серьезной проблемой современной репродуктологии становится высокая частота идиопатического бесплодия, когда причина ненаступления беременности остается невыясненной [5, 6]. В связи с этим особую актуальность приобретает поиск новых индикаторов качества гамет, дополняющих стандартные тесты, основанные в основном на оценке морфологических параметров. Учитывая особенности мужского гаметогенеза, а именно постоянное образование новых сперматозоидов и подверженность этого процесса внешним воздействиям, очевидно, что комплексная оценка эякулята важна не только для прогнозирования наступления беременности, но и для разработки адекватной терапии, направленной на улучшение качества мужских гамет.

В последнее десятилетие не вызывает сомнений, что корректная структурно-функциональная организация генетического аппарата сперматозоида критически важна для реализации репродуктивной функции. Такие характеристики мужских половых клеток, как целостность ДНК, содержание протаминов 1-го и 2-го типа, эпигенетические модификации, значительным образом влияют на эффективность оплодотворения, имплантации и последующее развитие эмбриона. Так, увеличение в эякуляте доли сперматозоидов со множественными одно- и двунитевыми разрывами ДНК может приводить к нарушениям репродуктивной функции, в том числе к снижению частоты наступления беременности в программах вспомогательных репродуктивных технологий [7], а также к привычному невынашиванию беременности в супружеской паре [8, 9]. Со снижением мужской фертильности связаны определенные однонуклеотидные замены в генах протаминов [10], а также изменение в соотношении между содержанием протаминов 1-го и 2-го типов в сперматозоидах [11]. Нарушения метилирования ДНК — основной эпигенетической модификации генома млекопитающих — ассоциированы с изменениями морфологии и подвижности сперматозоидов и оказывают негативное влияние на исходы экстракорпорального оплодотворения [12–14]. Важно отметить при этом, что в цикле метилирования/деметилирования ДНК, помимо 5-метилцитозина, задействованы и другие формы модифицированного цитозина — 5-гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-формилцитозин, 5-карбоксилцитозин, изменения паттернов которых также ассоциированы с патологиями сперматогенеза [15–17].

В наших предшествующих исследованиях установлено, что повышение уровня фрагментации ДНК в эякуляте негативно влияет на эффективность оплодотворения [18], а увеличение доли сперматозоидов с повышенным уровнем гидроксиметилирования ДНК коррелирует с ухудшением морфокинетических параметров спермы [19]. При этом также нами была выявлена интересная закономерность: при повышении в эякуляте содержания сперматозоидов с фрагментированной ДНК повышается и количество гипергидроксиметилированных сперматозоидов [19]. Это позволяет предполагать, что увеличение в эякуляте доли сперматозоидов с повышенным уровнем 5hmC, так же как и повышение фрагментации ДНК, может являться показателем снижения фертильности. При этом открытым остается вопрос, происходят ли оба процесса в одних и тех же сперматозоидах, и что лежит в основе выявленной закономерности.

Цель исследования

Оценка целостности ДНК и содержания 5hmC в одних и тех же эякулированных сперматозоидах, полученных от пациентов с нормозооспермией и патоспермией.

МЕТОДЫ

Образцы для исследования

Материалом для исследования послужили образцы эякулята 63 пациентов из пар с бесплодием (отсутствием беременности в течение года регулярной половой жизни без предохранения), обратившихся для обследования и/или лечения в отдел вспомогательных репродуктивных технологий Научно-исследовательского института акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта (НИИ АГиР им. Д.О. Отта, Санкт-Петербург). Возраст пациентов варьировал от 26 до 57 лет, средний возраст — 36,8 года (SD±6,051). Эякулят был получен пациентами путем самомастурбации после 3–5 дней воздержания от половой жизни.

Спермиологический анализ

Стандартный спермиологический анализ проводили согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения по исследованию и обработке эякулята [20]. Оценивали концентрацию сперматозоидов, долю прогрессивно- и не прогрессивно-подвижных сперматозоидов, доли морфологически нормальных и аномальных сперматозоидов.

Приготовление микроскопических препаратов

Микроскопические препараты эякулированных сперматозоидов готовили из нативного эякулята, согласно описанному ранее протоколу [21]. Аликвоту нативного эякулята сначала подвергали обработке гипотоническим раствором (0,9% цитрат натрия), а затем фиксировали раствором метанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Каплю зафиксированной суспензии сперматозоидов наносили на предметное стекло и растягивали по поверхности стекла ребром пастеровской пипетки. Стекла высушивали при комнатной температуре в течение 12 ч.

Метод TUNEL

Детекцию фрагментированной ДНК сперматозоидов на микроскопических препаратах проводили методом TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick-End Labelling) с использованием коммерческого набора реагентов с флуоресцеином (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein, Roche-11684795910, США), согласно рекомендованному производителем протоколу с собственными модификациями [22].

Проводили микроскопический анализ и получали цифровые фотоизображения разных полей зрения на препаратах с целью дальнейшего анализа 2000 сперматозоидов у каждого пациента. Наличие в ДНК сперматозоида одно- и/или двунитевых разрывов, свидетельствующих о фрагментации, определяли качественно по свечению головки.

Иммуноцитохимическая детекция 5hmC на препаратах эякулированных сперматозоидов

Детекцию 5hmC проводили методом непрямой иммунофлуоресценции на тех же препаратах эякулированных сперматозоидов, которые были окрашены методом TUNEL. Для денатурации ДНК препараты обрабатывали 2 М НCl в течение 30 мин. Для иммунофлуоресцентного окрашивания использовали антитела к 5hmC (rabbit anti-5hmC, Active Motif, 39769, США) в разведении 1:500 и вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa488 (goat anti-rabbit, Life technologies, США) в разведении 1:500 в соответствии с протоколом, описанным ранее с некоторыми модификациями [19].

Проводили микроскопический анализ и получали цифровые фотоизображения тех же полей зрения, что и после окрашивания методом TUNEL, с целью анализа содержания 5hmC в сперматозоидах с наличием/отсутствием фрагментированной ДНК. Гидроксиметилирование ДНК сперматозоидов оценивали качественно по наличию/отсутствию свечения в головке.

Микроскопический анализ

Микроскопический анализ препаратов эякулированных сперматозоидов после окрашивания методом TUNEL и иммуноцитохимической детекции 5hmC проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DM2500 (Германия), оборудованного объективами Fluotar 10×/0,3, 20×/0,50, 63×/0,70 и 100×/1,30–0,60, автоматической фотонасадкой, черно-белой камерой Leica DFC345 FC и блоком светофильтров для флуорохромов. Для получения фотоизображений использовали программное обеспечение Leica Application SuiteV.3.8.0.

Статистический анализ

Для статистической обработки данных использовали программу GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., США). Проверку на нормальность проводили с помощью критерия Д’Агостино–Пирсона, корреляционный анализ — с помощью критерия Спирмена. Для сравнения исследуемых групп использовали непарный t-критерий Стьюдента и непарный U-критерий Манна–Уитни при уровне статистической значимости p <0,05, для оценки взаимозависимости гидроксиметилирования и фрагментации ДНК в сперматозоидах — критерий χ² с поправкой Йейтса, отвергая нулевую гипотезу при p <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ целостности ДНК и уровня ее гидроксиметилирования в сперматозоидах пациентов из бесплодных пар

В настоящем исследовании был разработан оригинальный подход, позволивший оценить уровень гидроксиметилирования ДНК и ее целостность в одних и тех же сперматозоидах. Подход основан на последовательном выявлении в зафиксированных на предметном стекле сперматозоидах одно- и двунитевых разрывов в ДНК методом TUNEL, микроскопическом анализе и получении фотоизображений, иммунофлуоресцентной детекции 5hmC, получении фотоизображений тех же полей зрения и дальнейшем поклеточном анализе (рис. 1). Микроскопический анализ является достаточно трудоемким по сравнению с молекулярно-генетическими методами и не позволяет анализировать большое число образцов. Однако именно такой подход дал нам возможность провести поклеточный анализ гамет после каждого раунда окрашивания и оценить целостность ДНК и содержание 5hmC в одних и тех же сперматозоидах.

 

Рис. 1. Алгоритм последовательного выявления фрагментированной ДНК и 5-гидроксиметилцитозина в эякулированных сперматозоидах человека.

Fig. 1. Algorithm for the sequential detection of fragmented DNA and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in ejaculated human spermatozoa.

 

Анализ фрагментации и гидроксиметилирования ДНК проведен в 126 000 сперматозоидов от 63 индивидов из бесплодных пар. В результате окрашивания методом TUNEL установлено, что в большинстве сперматозоидов фрагментированная ДНК отсутствует. Однако 2,3–21% гамет у каждого индивида характеризовались ярким свечением, свидетельствующим о наличии в ДНК одно- и двунитевых разрывов. Схожую картину наблюдали и после иммунофлуоресцентной детекции 5hmC: для большинства сперматозоидов был характерен очень низкий (фоновый) уровень флуоресценции, свидетельствующий о низком уровне гидроксиметилирования ДНК. В то же время в отдельных клетках, доля которых составила 1,6–23% у разных индивидов, наблюдали контрастно яркую флуоресценцию, указывающую на повышенный уровень гидроксиметилирования ДНК (гипергидроксиметилирование).

На основании качественного анализа флуоресценции (яркая либо отсутствует, то есть фоновая) в одних и тех же клетках после окрашивания методом TUNEL и после иммунофлуоресцентной детекции 5hmC определено четыре типа сперматозоидов (рис. 2):

1. сперматозоиды с фрагментированной ДНК, без повышенного уровня гидроксиметилирования (TUNEL⁺/ 5hmC^–);
2. сперматозоиды без нарушений целостности ДНК, с повышенным уровнем гидроксиметилирования (TUNEL^–/ 5hmC⁺);
3. сперматозоиды с фрагментированной ДНК и повышенным уровнем гидроксиметилирования (TUNEL⁺/ 5hmC⁺);
4. сперматозоиды без нарушений целостности ДНК, без повышенного уровня гидроксиметилирования (TUNEL^–/5hmC^–).

 

Рис. 2. Сперматозоиды из эякулята человека после окрашивания методом TUNEL (а) и после иммунофлуоресцентной детекции 5-гидроксиметилцитозина (5hmC) (b). На рисунках представлены цифровые фотоизображения одной и той же области на препарате. ДНК визуализирована с помощью окрашивания красителем DAPI.

Fig. 2. Human spermatozoa after TUNEL staining (a) and after immunofluorescent detection of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) (b). The images show the same microscopic field. DNA was counterstained with DAPI.

 

Количественный анализ сперматозоидов четырех типов позволил установить у всех 63 пациентов преобладание сперматозоидов без нарушений целостности ДНК и без повышенного уровня гидроксиметилирования (TUNEL^–/5hmC^–): доля таких клеток в эякуляте составила 72,8–94,2%. Доля сперматозоидов без нарушений целостности ДНК, но с повышенным уровнем гидроксиметилирования (TUNEL^–/5hmC⁺) изменялась от 0,15 до 11,5%. Диапазон варьирования частоты сперматозоидов с фрагментированной ДНК и без повышенного уровня гидроксиметилирования (TUNEL⁺/5hmC^–) находился в пределах от 0,05 до 13,8%. Наконец, содержание в эякуляте сперматозоидов с фрагментированной ДНК и повышенным уровнем гидроксиметилирования (TUNEL⁺/5hmC⁺) составило 0,99–13,38%.

Таким образом, анализ целостности ДНК и статуса ее гидроксиметилирования в одних и тех же сперматозоидах позволил установить наличие в эякуляте гамет со всеми возможными сочетаниями анализируемых характеристик. При этом доли сперматозоидов разных типов характеризовались значительной межиндивидуальной вариабельностью.

Доля сперматозоидов разных типов, определенных на основании наличия фрагментированной ДНК и содержания 5hmC, у пациентов с нормозооспермией и патоспермией

На основании данных стандартного спермиологического анализа 63 пациента, эякулят которых изучали в данном исследовании, были разделены на две группы: пациенты с нормозооспермией — показатели спермиологического анализа в пределах референсных значений (n=33); пациенты с патоспермией — один или несколько показателей спермиологического анализа находятся за пределами референсных значений (n=30). В группу пациентов с патоспермией вошли 27 индивидов с тератозооспермией (сниженной долей морфологически нормальных сперматозоидов), и 3 индивида с сочетанной патологией (сниженной долей как морфологически нормальных, так и подвижных сперматозоидов).

Сравнение долей сперматозоидов разных типов между группами пациентов с нормозооспермией и патоспермией не позволило выявить отличий ни в одном случае (рис. 3). Полученные результаты свидетельствуют, что представленность гамет с разными сочетаниями характеристик целостности ДНК и уровня ее гидроксиметилирования не зависит от того, находятся ли спермиологические показатели в пределах референсных значений. Отсутствие отличий позволило на последующих этапах исследования объединить пациентов с нормозооспермией и патоспермией в одну группу.

 

Рис. 3. Сравнение долей сперматозоидов разных типов, определенных на основании наличия фрагментированной ДНК и содержания 5-гидроксиметилцитозина (5hmC), между группами пациентов с нормозооспермией и патоспермией.

Fig. 3. Comparison of the proportions of spermatozoa of different types, defined based on the presence of fragmented DNA and 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) content, between patients with normozoospermia and those with pathozoospermia.

 

Взаимосвязь процессов фрагментации и гидроксиметилирования ДНК в сперматозоидах человека

Проведен анализ взаимосвязи между содержанием в эякуляте сперматозоидов с фрагментированной ДНК, независимо от уровня ее гидроксиметилирования (сперматозоиды TUNEL⁺/5hmC^–, TUNEL⁺/5hmC⁺), и содержанием сперматозоидов с гидроксиметилированной ДНК, независимо от целостности их ДНК (сперматозоиды TUNEL^–/5hmC⁺, TUNEL⁺/5hmC⁺). В результате применения критерия Спирмена установлена положительная корреляция между этими двумя параметрами (ρ=0,48; p=6×10^–7) (рис. 4). Иными словами, при увеличении в эякуляте доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК увеличивается содержание сперматозоидов с повышенным уровнем 5hmC.

 

Рис. 4. Взаимосвязь содержания в эякуляте сперматозоидов с фрагментированной ДНК (TUNEL⁺/5hmC^–, TUNEL⁺/5hmC⁺) и сперматозоидов с повышенным уровнем гидроксиметилирования (TUNEL^–/5hmC⁺, TUNEL⁺/5hmC⁺). Показана линия регрессии, коэффициент корреляции Спирмена ρ и значение р. Установлена статистически значимая положительная зависимость.

Fig. 4. Relationship between the proportions of spermatozoa with DNA fragmentation (TUNEL⁺/5hmC^–, TUNEL⁺/5hmC⁺) and those with elevated hydroxymethylation (TUNEL^–/5hmC⁺, TUNEL⁺/5hmC⁺) in the ejaculate. The regression line, Spearman correlation coefficient (ρ), and р-value are shown. A statistically significant positive correlation was identified.

 

Для оценки взаимозависимости фрагментации ДНК и ее гидроксиметилирования была сформулирована гипотеза, что эти процессы протекают в сперматозоидах независимо друг от друга. Для проверки гипотезы использовали критерий χ²: сравнивали фактическое число сперматозоидов, содержащих и фрагментированную ДНК, и 5hmC (TUNEL⁺/5hmC⁺), у всех 63 пациентов с теоретически ожидаемым. В результате анализа гипотеза о независимости процессов фрагментации и гидроксиметилирования ДНК отвергнута (p <0,05), сделан вывод, что они взаимозависимы.

Таким образом, фрагментация и гидроксиметилирование ДНК в эякулированных сперматозоидах взаимозависимы, что приводит к неслучайному сочетанию этих параметров в сперматозоидах, и как результат — к высокой частоте гамет, содержащих фрагментированную ДНК с повышенным уровнем гидроксиметилирования.

ОБСУЖДЕНИЕ

Ключевым результатом настоящего исследования является установление взаимозависимости между фрагментацией ДНК и повышением уровня ее гидроксиметилирования в эякулированных сперматозоидах человека. Эта находка, в свою очередь, стала возможной благодаря разработке нами оригинального подхода, основанного на поклеточном микроскопическом анализе и позволяющего оценивать целостность ДНК и содержание в ней 5hmC в одних и тех же сперматозоидах. Отметим, что именно на анализе индивидуальных клеток, несмотря на его очевидную трудоемкость, основано большинство современных подходов к оценке качества эякулята [20]. Это оправдано как высокой информативностью метода, так и необходимостью искусственного отбора именно индивидуальных мужских гамет для оплодотворения с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит в рамках программ вспомогательной репродукции.

Безусловный интерес представляет вопрос, что лежит в основе выявленной взаимозависимости процессов фрагментации ДНК и повышения уровня ее гидроксиметилирования в эякулированных сперматозоидах человека. Наиболее вероятное объяснение — один или несколько общих механизмов, вызывающих как фрагментацию ДНК, так и ее гипергидроксиметилирование. Известны три основные причины повреждения ДНК в сперматозоидах: нарушение протаминизации, апоптоз и окислительный стресс. При этом возникновение одно- и двунитевых разрывов в ДНК сперматозоидов может быть результатом действия как одного, так и комбинации этих факторов [23]. Так, при нарушении протаминизации не происходит полноценной репарации разрывов ДНК как одного из этапов ремоделирования хроматина [24, 25]. Апоптоз как неотъемлемая часть сперматогенеза происходит главным образом в яичке до этапа спермиации. Если же процесс программируемой гибели клеток был запущен, но не был до конца завершен (так называемый абортивний апоптоз), или же его инициация произошла после спермиации, то в эякуляте оказываются сперматозоиды с признаками апоптоза, включая нарушение целостности ДНК [26]. Наконец, разрывы в ДНК сперматозоидов могут возникать в результате атаки свободными радикалами, в том числе активными формами кислорода (АФК), в избытке образующимися при окислительном стрессе [27]. Причинами окислительного стресса могут быть воспаление [28], курение [29], органические фосфаты [30], повышенная температура семенников [31], бисфенол [32], излучение мобильных телефонов [33] и др.

В отличие от фрагментации ДНК, происходящей в конкретной клетке под воздействием внутренних и внешних причин и часто носящей случайный характер, процесс образования 5hmC в определенных типах клеток и тканей в подавляющем большинстве случаев обусловлен программой развития организма. 5hmC — это промежуточный продукт в каскаде реакций активного деметилирования ДНК, опосредованного ферментами TET и имеющего критическое значение в глобальном эпигенетическом репрограммировании генома гамет и доимплантационных эмбрионов [34, 35]. Кроме того, накоплены данные, убедительно свидетельствующие, что 5hmC является стабильной эпигенетической модификацией и постоянно присутствует в геноме, выполняя множество регуляторных функций, в том числе активируя работу многих генов [36, 37].

Известно, что эндо- и/или экзогенные факторы могут вызывать изменения характера гидроксиметилирования ДНК [38]. В отношении сперматозоидов такой эффект показан для бисфенола А: у мужчин, подвергавшихся его воздействию, наблюдается повышение уровня 5hmC в ДНК сперматозоидов, в том числе в генах MLH1, CHD2, SPATA12 и SPATA20, участвующих в ответе клетки на повреждение ДНК [39]. По всей видимости, подобные изменения гидроксиметилирования можно рассматривать, по крайней мере отчасти, как адаптивный ответ на средовые воздействия, посредством которого клетка стремится к активации систем поддержания целостности ДНК. В пользу возможной протективной роли гидроксиметилирования также свидетельствуют исследования, показавшие ингибирование апоптоза при повышении уровня 5hmC за счет активной работы TET1 в стареющих овариальных клетках [40] и за счет активации TET3 в нейронах после инсульта [41]. Однако выявленное в настоящем исследовании гипергидроксиметилирование ДНК в некоторых сперматозоидах нельзя полностью объяснить ответом на повреждение ДНК в этих сперматозоидах. В этом случае повышение уровня 5hmC, являясь предусмотренным программой онтогенеза ответом на нарушение клеточных процессов, вероятнее всего, затрагивало бы все сперматозоиды с фрагментированной ДНК. Наши же результаты свидетельствуют о наличии в эякуляте сперматозоидов со всеми возможными сочетаниями анализируемых параметров, в том числе с фрагментированной ДНК, но не повышенным уровнем 5hmC и, наоборот, с гипергидроксиметилированной ДНК, но без нарушения ее целостности.

Наиболее вероятным представляется, что как разрывы в ДНК, так и повышение уровня гидроксиметилирования, выявленные нами в отдельных сперматозоидах, возникают спонтанно под воздействием определенного фактора. Принимая по внимание, что фрагментацию ДНК сперматозоидов могут вызывать АФК, не избирательно атакующие клетки, мы предполагаем, что именно окислительный стресс становится причиной и связующим фактором одновременного увеличения в эякуляте доли сперматозоидов с поврежденной и гипергидроксиметилированной ДНК. Безусловно, преимущественным и запрограммированным способом образования 5hmC является TET-опосредованное окисление 5-метилцитозина. Однако несколько лет назад было показано, что 5hmC может возникать без участия ферментативной системы в результате атаки метилированного цитозина гидроксильным радикалом [42, 43]. Очевидно, что этот процесс наиболее вероятен в условиях окислительного стресса, когда образуется избыток АФК, в том числе гидроксильных радикалов. Таким образом, как фрагментация ДНК, так и ее спонтанное гидроксиметилирование может происходить в результате воздействия на гаметы АФК, образующихся при окислительном стрессе. При этом наличие других не связанных между собой факторов, приводящих к повреждению ДНК или изменению уровня ее гидроксиметилирования, объясняет не 100% совпадение этих характеристик в сперматозоидах.

Особого внимания заслуживает выявленная нами одинаковая доля сперматозоидов с поврежденной и гипергидроксиметилированной ДНК у пациентов с нормозооспермией и патоспермией. Отметим, что пациенты с нормозооспермией, эякулят которых был исследован в настоящей работе, были из бесплодных пар. Эти данные, наряду с выявленной межиндивидуальной вариабельностью содержания гипергидроксиметилированных сперматозоидов, дополнительно свидетельствуют в пользу необходимости при оценке качества эякулята учитывать не только морфокинетические параметры, но и структурно-функциональную организацию генома гамет для выявления неочевидных причин снижения фертильности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные нами результаты, а именно установление взаимозависимости процессов фрагментации ДНК и ее гипергидроксиметилирования в эякулированных сперматозоидах человека, а также выявление определенной доли таких сперматозоидов у всех пациентов из бесплодных пар, независимо от данных их спермиологического анализа, представляют как фундаментальную, так и практическую ценность. С одной стороны, они расширяют наши представления о механизмах нарушений сперматогенеза, а с другой — указывают на перспективность использования сочетания двух параметров — фрагментации ДНК и уровня ее гидроксиметилирования в гаметах — для оценки качества эякулята и выявления потенциальных причин идиопатического бесплодия.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Я.М. Сагурова — сбор и обработка материала, выполнение экспериментальных процедур, анализ результатов, обзор литературы, подготовка иллюстраций; О.А. Ефимова — дизайн эксперимента, анализ результатов, написание и редактирование текста; М.И. Крапивин — выполнение экспериментальных процедур, статистический анализ результатов; М.А. Ищук — сбор и обработка материала, выполнение экспериментальных процедур; Д.А. Староверов, Е.Д. Трусова — сбор и обработка материала, выполнение экспериментальных процедур; Е.М. Комарова — дизайн эксперимента, сбор материала, анализ результатов; О.Н. Беспалова, А.А. Пендина — дизайн эксперимента, анализ результатов, редактирование текста. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой ее части.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Научно-исследовательского института акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта (№ 114 от 14.12.2021). Все участники исследования добровольно подписали форму информированного согласия на участие в исследовании. Исследование и его протокол не регистрировали.

Источники финансирования. Исследование выполнено в рамках темы фундаментального научного исследования № 1021062512052-5-3.2.2 на денежные средства Министерства науки и высшего образования Российской Федерации.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При проведении исследования и создании настоящей статьи авторы не использовали ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст, иллюстрации).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали внешний и внутренний рецензенты.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: Ya.M. Sagurova: investigation, data curation, formal analysis, visualization; O.A. Efimova: conceptualization, methodology, formal analysis, writing—original draft, writing—review & editing; M.I. Krapivin: investigation, formal analysis, statistical analysis; M.A. Ishchuk: investigation, data curation; D.A. Staroverov, E.D. Trusova: investigation; E.M. Komarova: conceptualization, methodology, investigation, formal analysis; O.N. Bespalova, A.A. Pendina: conceptualization, methodology, formal analysis, writing—review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study was approved by the local Ethics Committee of the Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott (Protocol No. 114 dated December 14, 2021). All participants provided written informed consent to participate in the study. The study and its protocol were not registered.

Funding sources: This study was part of fundamental research project No. 1021062512052-5-3.2.2, funded by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities or interests for the last three years related with for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The review process involved an external reviewer and an in-house reviewer.

About the authors

Yanina M. Sagurova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: yanina.sagurova96@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4947-8171
SPIN-code: 8908-7033
Russian Federation, Saint Petersburg

Olga A. Efimova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: efimova_o82@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4495-0983
SPIN-code: 6959-5014

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Mikhail I. Krapivin

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: krapivin-mihail@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1693-5973
SPIN-code: 4989-1932
Russian Federation, Saint Petersburg

Mariia A. Ishchuk

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: mashamazilina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4443-4287
SPIN-code: 1237-6373
Russian Federation, Saint Petersburg

Dmitrii A. Staroverov

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: st110982@student.spbu.ru
ORCID iD: 0009-0004-9716-4964
SPIN-code: 3438-7974
Russian Federation, Saint Petersburg

Ekaterina D. Trusova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: trusova.ek@mail.ru
ORCID iD: 0009-0005-6529-5799
Russian Federation, Saint Petersburg

Evgeniia M. Komarova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: evgmkomarova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9988-9879
SPIN-code: 1056-7821

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

Olesya N. Bespalova

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Email: shiggerra@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6542-5953
SPIN-code: 4732-8089

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Saint Petersburg

Anna A. Pendina

The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott

Author for correspondence.
Email: pendina@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9182-9188
SPIN-code: 3123-2133

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files