Влияние новых антимикробных пептидов медицинской пиявки Hirudo medicinalis на функциональную активность белков гранул нейтрофилов

Полный текст

Список сокращений

АМП — антимикробные пептиды; ЛФ — лактоферрин; МИК_max — максимальное значение среди минимальных концентраций АМП, необходимых для достижения 100 % ингибирования роста микроорганизмов; МПО — миелопероксидаза; НЭ — нейтрофильная эластаза; ПА_МПО — пероксидазная активность миелопероксидазы; HOCl — хлорноватистая кислота.

Обоснование

Антибиотикорезистентность — это серьезная проблема здравоохранения ввиду повышения глобальной доступности антибактериальных препаратов, ненадлежащего их назначения, нарушения дозировок и продолжительности курса при их приеме, а также использования таких препаратов в животноводстве. В связи с этим во всем мире проводятся широкомасштабные исследования по разработке новых нетрадиционных противоинфекционных методов лечения. Антимикробные пептиды (АМП) быстро привлекли внимание исследователей как перспективные кандидаты для создания на их основе препаратов, лишенных ряда недостатков традиционных антибиотиков [1]. АМП представляют многочисленную и разнообразную группу коротких (от 10 до 50 аминокислотных остатков), амфипатических и, как правило, положительно заряженных молекул, которые продуцируются многими тканями и типами клеток у различных видов беспозвоночных, растений и животных.

Механизмы действия АМП разнообразны: они нарушают целостность плазматической мембраны, ингибируют синтез компонентов клеточной стенки, модифицируют цитоплазматическую мембрану, ингибируя формирование септума/перегородки, запускают процессы автолизиса, связываются с ДНК и подавляют процессы репликации, транскрипции и трансляции, ингибируют активность ряда ферментов, а также проявляют микробицидный эффект за счет регуляции врожденного и приобретенного иммунитета [2]. Благодаря такому широкому спектру биологических активностей АМП представляются перспективными соединениями для разработки на их основе новых антибактериальных, противогрибковых, противовирусных и противораковых терапевтических средств [3, 4].

АМП могут быть получены из микроорганизмов, растений и животных. Такие АМП с низкой вероятностью могут вызывать побочные эффекты, в связи с чем природные АМП используют в качестве основы для создания новых синтетических АМП с различного рода модификациями, нацеленными на улучшение их антимикробной активности, стабильности и эффективности, уменьшение токсичности по отношению к собственным клеткам макроорганизма, а также повышение их устойчивости к пищеварительным ферментам [1, 5].

Секрет слюнных желез медицинской пиявки Hirudo medicinalic является гуморальным агентом гирудотерапии — широко применяемого метода лечения многих заболеваний путем приставления пиявок. Гирудотерапия оказывает многофакторное действие, среди которого особо необходимо выделить антимикробные и иммуностимулирующие эффекты, обусловленные в том числе антимикробными белками и пептидами [6, 7]. Ранее биоинформатический анализ генома медицинской пиявки Hirudo medicinalic позволил нам идентифицировать и синтезировать катионные пептиды, обладающие антимикробными свойствами: Phe-Arg-Ile-Met-Arg-Ile-Leu-Arg-Val-Leu-Lys (АМП 3967_1), Lys-Phe-Lys-Lys-Val-Ile-Trp-Lys-Ser-Phe-Leu (АМП 12530), Arg-Trp-Arg-Leu-Val-Cys-Phe-Leu-Cys-Arg-Arg-Lys-Lys-Val (АМП 536_1) и Arg-Pro-Ile-Leu-Ile-Arg-Val-Arg-Arg-Ile-Arg-Val-Ile (АМП 19347_2) [8]. Однако необходимо учитывать, что в случае использования АМП в качестве антибактериальных терапевтических средств в очагах инфекции данные соединения неизбежно будут контактировать с нейтрофилами — клетками, в первую очередь мигрирующими из кровяного русла к месту локализации патогена. Нейтрофильные гранулоциты служат важнейшими эффекторными клетками системы врожденного иммунитета и обеспечивают первичную линию защиты организма от инфекционных агентов [9]. Нейтрофильные гранулоциты обладают мощными кислородозависимыми и кислородонезависимыми механизмами, обеспечивающими выполнение микробицидной, цитотоксической и цитолитической функций, инициируя развитие базисной воспалительной реакции. Цитолитический и цитотоксический потенциал нейтрофилов сконцентрирован в гранулярном аппарате и секреторных везикулах [10, 11]. Необходимо отметить, что секреция содержимого гранул происходит не только во время фагоцитоза в местах воспаления. В плазме крови в норме всегда присутствуют гранулярные белки и пептиды, количество которых может меняться как при физиологических состояниях, так и при некоторых заболеваниях.

При взаимодействии АМП и гранулярных белков нейтрофилов биологические функции данных соединений могут изменяться. Например, в работе [12] было показано, что при связывании собственных АМП нейтрофилов дефенсинов с белками из семейства ингибиторов сериновых протеаз (серпинов) снижается ингибирующее действие последних в отношении протеаз, а также блокируется антимикробная активность дефенсинов. В работе [13] были получены данные, свидетельствующие в пользу предположения о возможности связывания дефенсинов и некоторых других АМП с белками из семейства серпинов, не проявляющими антипротеазной активности [кортикостероид-связывающим глобулином (транскортином) и тироксин-связывающим глобулином] и не модулирующими биологическую активность транскортина. В связи с этим интерес вызывает изучение влияния новых синтезированных АМП медицинской пиявки на биологическую активность основных гранулярных белков нейтрофилов: миелопероксидазы (МПО), нейтрофильной эластазы (НЭ), лактоферрина (ЛФ) и лизоцима.

Необходимо также учитывать, что в очагах воспаления в результате функционирования фермента азурофильных гранул нейтрофилов МПО неизбежно будет нарабатываться хлорноватистая кислота (HOCl), с одной стороны, являющаяся основным антимикробным агентом нейтрофилов, с другой — сохраняющая способность повреждать собственные биологически важные молекулы, в результате чего их основные функции могут измениться. Так, ранее было показано, что модификация НЭ высокими концентрациями HOCl (когда мольное соотношение HOCl/фермент превышало 10–40 раз) приводила к инактивации фермента [14]. Модифицированный HOCl лизоцим терял способность лизировать бактериальные клетки Micrococcus lysodeikticus [15]. Ранее нами было установлено, что после обработки HOCl в молекуле МПО происходит деградация гема, что ведет к резкому падению каталитической активности фермента [16]. После модификации HOCl железосвязывающая активность ЛФ снижается [17]. Изменится ли после модификации HOCl способность исследуемых катионных АМП медицинской пиявки регулировать биологическую активность основных гранулярных белков нейтрофилов — неизвестно.

В связи с вышесказанным цель настоящей работы состояла в изучении способности нативных и модифицированных HOCl новых искусственно синтезированных АМП медицинской пиявки Hirudo medicinalic модулировать биологическую активность основных гранулярных белков нейтрофилов — МПО, НЭ, ЛФ и лизоцима.

Материалы и методы

Реагенты

В работе использовали следующие реактивы: лизоцим, гипохлорит натрия (NaOCl), M. lysodeikticus и о-дианизидин фирмы Sigma-Aldrich (США); MeOSuc-AAPV-AMC фирмы Santa Crus Biotechnology (США); остальные реактивы — фирм «Реахим» (Россия) и «Белмедпрепараты» (Беларусь).

В работе также применяли МПО и НЭ, выделенные из замороженных лейкоцитов здоровых доноров с помощью аффинной хроматографии с использованием гепарин-сефарозы и апротинин-агарозы, гидрофобной хроматографии (фенил-сефароза) и гель-фильтрации (сефакрил S-200 HR), как это было описано ранее [18–20]. Соотношение величин поглощения препарата МПО на длине волны 430 и 280 нм (А₄₃₀/А₂₈₀) служило характеристикой чистоты и гомогенности выделенной МПО и обычно составляло не менее 0,85. Препарат НЭ был гомогенен по данным электрофореза и масс-спектрометрии, не содержал примесей катепсина G и протеиназы-3.

В данной работе также применяли рекомбинантный ЛФ человека, выделенный из молока трансгенных коз-продуцентов, выведенных в рамках научно-технической программы Союзного государства «Разработка технологий и организация опытного производства высокоэффективных и биологически безопасных лекарственных средств нового поколения и пищевых продуктов на основе лактоферрина человека, получаемого из молока животных-продуцентов» («БелРосТрансген-2») [21]. В работе [22] было показано, что рекомбинантный ЛФ по физическим, биохимическим и биологическим характеристикам аналогичен природному ЛФ человека, выделенному из женского молока.

В работе использовали четыре АМП, синтезированных на основе биоинформатического анализ генома медицинской пиявки Hirudo medicinalis. Характеристики данных АМП (аминокислотная последовательность, молекулярная масса, заряд, МИК_max — максимальное значение среди минимальных концентраций АМП, необходимых для достижения 100 % ингибирования роста микроорганизмов Escherichia coli, Chlamydia trachomatis и Bacillus subtilis в стандартном тесте) приведены в таблице.

 

Таблица / Table

Характеристики используемых в работе антимикробных пептидов

Characteristics of AMP used in the work

Код АМП	Аминокислотная последовательность АМП	Длина	Молекулярная масса, Да	Заряд	МИКmax, мкМ
3967_1	Phe-Arg-Ile-Met-Arg-Ile-Leu-Arg-Val-Leu-Lys	11	1444,89	+4	10
12530	Lys-Phe-Lys-Lys-Val-Ile-Trp-Lys-Ser-Phe-Leu	11	1423,81	+4	90
536_1	Arg-Trp-Arg-Leu-Val-Cys-Phe-Leu-Cys-Arg-Arg-Lys-Lys-Val	14	1863,36	+6	17
19347_2	Arg-Pro-Ile-Leu-Ile-Arg-Val-Arg-Arg-Ile-Arg-Val-Ile	13	1660,13	+5	77

Примечание. Полужирным отмечены наиболее чувствительные к действию HOCl аминокислоты.

 

Модификация антимикробных пептидов HOCl

Раствор NaOCl получали непосредственно перед экспериментом, разбавляя стоковый коммерческий раствор в фосфатно-солевом буфере (ФСБ: 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,7 мМ Na₂HPO₄, 1,5 мМ KH₂PO₄, pH 7,4). В силу того что pKa HOCl составляет 7,5 и при физиологических значениях рН в исследуемой среде молекулярная форма кислоты (HOCl) и ее анион (OCl^–) находятся примерно в равных количествах, под HOCl подразумевается смесь HOCl/OCl^–.

Поскольку в состав исследуемых АМП входит различное количество аминокислотных остатков, чувствительных к HOCl (см. таблицу), для каждого АМП индивидуально подбирали такое мольное соотношение АМП к HOCl, чтобы все молекулы HOCl провзаимодействовали с АМП. Отсутствие непрореагировавшей HOCl оценивали флуоресцентным методом с использованием скополетина, мгновенно окисляющегося в присутствии HOCl. Модификацию АМП проводили при комнатной температуре (23 °С) в течение 1,5–2 ч при умеренном перемешивании — один раз в начале и один раз в конце модификации. Мольное соотношение АМП : HOCl для АМП 536_1 составило 1 : 20, 12530 — 1 : 10, 3967_1 — 1 : 10, 19347_2 — 1 : 1.

Амидолитическая активность нейтрофильной эластазы

Активность НЭ оценивали флуоресцентным методом с помощью специфического субстрата MeOSuc-AAPV-AMC [18]. НЭ (50 нМ) в ФСБ, содержащем 1 мМ CaCl₂ и 0,5 мМ MgCl₂, инкубировали 3 мин при 37 °С с различными концентрациями нативных или модифицированных под действием HOCl АМП, после чего добавляли 20 мкМ субстрата MeOSuc-AAPV-AMC и регистрировали кинетику гидролиза субстрата НЭ, сопровождающегося высвобождением флуорофора — аминометилкумарина, по увеличению интенсивности флуоресценции на длине волны 460 нм (возбуждение — 380 нм). Для количественной характеристики показателя активности НЭ рассчитывали площадь под кинетической кривой изменения интенсивности флуоресценции на 10 мин после добавления НЭ, включающую как максимум величины интенсивности флуоресценции в результате образования флуоресцирующего реагента, так и скорость его образования.

Пероксидазная активность миелопероксидазы

Пероксидазную активность МПО (ПА_МПО) оценивали по скорости окисления ферментом о-дианизидина [23]. Препарат МПО (0,5 нМ), проинкубированный с различными концентрациями нативных или модифицированных под действием HOCl АМП в течение 5 мин при 23 °С, вносили в 0,1 М Na-фосфатный буфер (рН 6,2), содержащий о-дианизидин (380 мкМ), после чего к смеси добавляли Н₂О₂ (50 мкМ) и регистрировали изменение оптической плотности раствора на длине волны 460 нм при 23 °С. Для количественной оценки был вычислен тангенс начального угла наклона зарегистрированных кривых, который характеризовал скорость окисления o-дианизидина в присутствии МПО.

Муколитическая активность лизоцима

Активность лизоцима определяли по скорости лизиса бактериальных клеток M. lysodeikticus [24]. Лизоцим (50 мкг/мл) инкубировали с различными концентрациями нативных или модифицированных под действием HOCl АМП в течение 5 мин при 23 °С, добавляли к суспензии бактериальных клеток M. lysodeikticus в 0,1 М Na₂HPO₄/KH₂PO₄ буфере (pH 6,2) и при 37 °С регистрировали изменение светопропускания полученной суспензии на длине волны 540 нм. Для количественной характеристики активности лизоцима рассчитывали величину изменения светопропускания образцом по сравнению с начальным уровнем светопропускания через 3 мин после добавления к бактериальным клеткам лизоцима.

Железосвязывающая активность лактоферрина

Способность 10 мг/мл препарата ЛФ связывать ионы железа в отсутствие и в присутствии нативных или модифицированных под действием HOCl АМП в различных концентрациях регистрировали спектрофотометрическим методом по изменению поглощения исследуемого раствора на длине волны 465 нм при последовательном добавлении соли Fe³⁺ [NH₄Fe(SO₄)₂ · 12 H₂O] при 23 °С и постоянном перемешивании [17]. Для ЛФ в насыщенной железом форме характерно появление дополнительного максимума (по сравнению с апо-формой) в области 400–500 нм. Для количественной характеристики железосвязывающей активности ЛФ определяли площадь под кинетической кривой изменения оптической плотности раствора ЛФ после 20 последовательных добавок соли Fe³⁺ [NH₄Fe(SO₄)₂ · 12 H₂O].

Для реализации всех флуоресцентных методов был использован компьютеризированный спектрофлуориметр СМ2203 (СОЛАР, Беларусь), спектрофотометрических методов — компьютеризированный спектрофотометр PB2201 (СОЛАР, Беларусь).

Статистический анализ данных

Статистический анализ результатов был выполнен с помощью пакета программ Origin 7.0. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Для анализа различий между средними значениями использовали t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.

Результаты и обсуждение

МПО (донор: Н₂О₂-оксидоредуктаза, К.Ф. 1.11.2.2) относится к семейству гемсодержащих пероксидаз млекопитающих. Основной субстрат МПО — Н₂О₂, продуцируемый in vivo при респираторном взрыве нейтрофилов. В присутствии Н₂О₂ происходит превращение МПО в высокореакционное соединение I, которое обладает двумя окислительными эквивалентами и осуществляет последовательное одноэлектронное окисление различных субстратов (нитрита, аскорбата, тирозина и др.) через образование соединения II c возвращением фермента в исходную форму и замыканием так называемого пероксидазного цикла. В отличие от большинства пероксидаз, соединение I МПО способно также осуществлять сразу двухэлектронное окисление галогенидов с образованием гипогалоидных кислот [25, 26].

На рис. 1 представлены результаты оценки пероксидазной активности МПО в присутствии нативных и модифицированных под действием HOCl АМП медицинской пиявки Hirudo medicinalis. Видно, что наибольшее модулирующее действие оказывал АМП 536_1. Так, в присутствии АМП 536_1 ПА_МПО изменялась бифазным образом: увеличивалась (в ~1,2 раза) в концентрационном диапазоне 0,5–2,5 мкМ и значительно снижалась при концентрациях 20–40 мкМ (например, в присутствии АМП 536_1 в концентрации, соответствующей МИК_max, ПА_МПО уменьшалась в ~2 раза) (рис. 1, a). Менее выраженный ингибирующий эффект на ПА_МПО оказывал АМП 19347_2: в концентрациях, соответствующих МИК_max и выше, данный АМП концентрационно-зависимым образом ингибировал ПА_МПО (рис. 1, b). Исследование влияния АМП 536_1 и 19347_2 на кинетические параметры ПА_МПО показали, что данные соединения являются неконкурентными ингибиторами МПО поскольку не влияли на константу Михаэлиса для Н₂О₂ (данные не представлены). В присутствии АМП 12530 в концентрациях, соответствующих МИК_max и выше, ПА_МПО увеличивалась в ~1,2–1,3 раза (рис. 1, c), что может быть связано со стабилизацией нативной структуры фермента. АМП 3967_1 во всем исследуемом диапазоне концентраций не влиял на ПА_МПО (рис. 1, d).

После модификации HOCl способность АМП 536_1 модулировать ферментативную активность МПО снижалась (в малых концентрациях модифицированный АМП 536_1 терял способность усиливать ПА_МПО, а в больших концентрациях его ингибирующее действие уменьшалось в ~2 раза) (рис. 1, a). После обработки HOCl АМП 19347_2 терял способность ингибировать ферментативную активность МПО также в ~2 раза (рис. 1, b). В присутствии АМП 12530, модифицированного HOCl, ПА_МПО увеличивалась сильнее (в ~1,4–1,6 раза), чем в присутствии нативного АМП (рис. 1, c). ПА_МПО в присутствии модифицированного HOCl АМП 3967_1 увеличивалась: наиболее значительно (на ~30–40 %) в диапазоне малых (0,5–5 мкМ) концентраций АМП (рис. 1, d).

 

Рис. 1. Влияние нативных и модифицированных хлорноватистой кислотой (HOCl) антимикробных пептидов (АМП) 536_1 (a), 19347_2 (b) 12530 (c) и 3967_1 (d) в различных концентрациях на пероксидазную активность очищенной миелопероксидазы (ПАМПО) (0,5 нМ), регистрируемую по окислению ферментом хромогенного субстрата o-дианизидина (380 мкМ) в присутствии Н2О2 (50 мкМ). За 100 % принята ПАМПО в отсутствие АМП. * p < 0,05 по сравнению с ПАМПО в контроле (в отсутствие АМП)

Fig. 1. Effect of native and modified by HOCl AMP 536_1 (a), 19347_2 (b), 12530 (c), and 3967_1 (d) in various concentrations on MPO (0.5 nM) peroxidase activity (PA_MPO) which was recorded by the oxidation of chromogenic substrate o-DA (380 μM) in the presence of Н₂О₂ (50 μM). PA_MPO in the absence of AMP is accepted as 100 %. * p < 0.05 compared with the PA_MPO in the control (in the absence of AMP)

 

Из представленных данных можно сделать вывод, что АМП 536_1 и 19347_2 можно считать перспективными соединениями для синтеза на их основе более эффективных фармакологических ингибиторов МПО. Действительно, в ряде случаев для эффективного ингибирования активности МПО достаточно небольшой последовательности аминокислот, состоящей, например, из 10 аминокислотных остатков, как это было показано для фрагмента церулоплазмина в работе [27]. АМП 12530 усиливает каталитическую активность МПО, тем самым увеличивая продукцию бактерицидных высокореакционных активных форм галогенов, уничтожающих патоген. После модификации HOCl способность АМП регулировать ферментативную активность МПО изменяется. Полученные данные необходимо учитывать при разработке на основе АМП противоинфекционных терапевтических средств.

Затем нами было исследовано влияние АМП на еще один маркерный фермент азурофильных гранул нейтрофилов — НЭ. НЭ относится к группе сериновых протеаз, в активном центре которых содержится классическая консервативная триада из остатков Ser, His и Asp. Эти остатки образуют ансамбль, осуществляющий нуклеофильную атаку на пептидные связи белков, итогом которой является их гидролитическое расщепление. Протеазы данного класса обладают различной субстратной специфичностью. НЭ проявляет специфичность к пептидным связям, образованным Gly, Ala, Val, Leu, Ile, которые содержат гидрофобные радикалы [28]. Следует отметить, что при патологических процессах в зависимости от физико-химических факторов НЭ может выступать и как провоспалительный, и как противовоспалительный агент [29], поэтому поиск способов регуляции ее активности представляется актуальной задачей.

Поскольку исследуемые АМП могут модулировать активность МПО в концентрациях, сопоставимых с МИК_max, то для изучения влияния АМП на биологическую активность остальных гранулярных белков нейтрофилов данные соединения были использованы в концентрациях МИК_max и в 2 раза больших и в 2 раза меньших МИК_max. Как видно из данных, представленных на рис. 2, в присутствии АМП 3967_1 в исследованном диапазоне концентраций ферментативная активность НЭ увеличивалась примерно на 30 % (рис. 2, a и c). АМП 536_1 и 12530 в используемых концентрациях не оказывали достоверного влияния на ферментативную активность НЭ (рис. 2, c). АМП 19347_2 концентрационно-зависимым образом ингибировал способность НЭ расщеплять флуоресцентный субстрат (рис. 2, b и c). Ингибирующий эффект АМП 19347_2 на ферментативную активность НЭ может быть связан с тем, что среди всех применяемых нами АМП в состав АМП 19347_2 входит больше всего (7) алифатических аминокислотных остатков (4 Ile, 1 Leu и 2 Val). Пептидные связи, образованные этими аминокислотами, конкурируя с используемым нами субстратом для регистрации активности фермента, могут быть мишенями для НЭ. Модифицированные HOCl АМП не оказывали какого-либо отличного от их нативных аналогов действия на амидолитическую активность НЭ (данные не представлены).

 

Рис. 2. Влияние антимикробных пептидов (АМП) на ферментативную активность нейтрофильной эластазы (НЭ). Типичные кинетические кривые (a, b) увеличения интенсивности флуоресценции аминометилкумарина, образующегося при расщеплении специфического субстрата MeOSuc-AAPV-AMC (20 мкМ) очищенной НЭ (50 нМ) в отсутствие и в присутствии АМП 3967_1 (a) и 19347_2 (b) в различных концентрациях (указаны на легенде). Момент добавления НЭ отмечен стрелкой. Длина волны возбуждения флуоресценции — 380 нм, регистрации — 460 нм. Зависимость ферментативной активности очищенной НЭ от концентрации АМП (c). За 100 % принята активность НЭ в отсутствие АМП. МИКmax — максимальное значение среди минимальных концентраций АМП, необходимых для достижения 100 % ингибирования роста микроорганизмов Escherichia coli, Chlamydia trachomatis и Bacillus subtilis в стандартном тесте. *p < 0,05 по сравнению с активностью НЭ в контроле (в отсутствие АМП)

Fig. 2. Effect of AMP on NE enzymatic activity. Typical kinetic curves (a, b) of an increase in the fluorescence intensity of aminomethylcoumarin formed during the cleavage of a specific substrate MeOSuc-AAPV-AMC (20 μM) by purified NE (50 nM) in the absence and in the presence of AMP 3967_1 (a) and 19347_2 (b) at various concentrations. AMP concentrations are indicated on the legend to the figure. The arrow indicates the moment of NE addition. Fluorescence intensity was measured at 460 nm, excitation wavelength was 380 nm. Dependence of NE enzymatic activity on AMP concentration (c). NE activity in the absence of AMP is taken as 100%. MIC_max — minimal inhibitory concentrations against three bacterial species (Escherichia coli, Chlamydia thrachomatis and Bacillus subtilis). *p < 0.05 compared to NE activity in the control (in the absence of AMP)

 

ЛФ — катионный железосвязывающий гликопротеин семейства трансферринов. В основном ЛФ содержится в секретах экзокринных желез, дыхательной и репродуктивной систем, грудном молоке, слезах, синовиальной жидкости, слюне, что свидетельствует о важной роли ЛФ в неспецифической защите от вторжения патогенных микроорганизмов. Источником ЛФ в плазме крови служат нейтрофилы, в которых данный белок синтезируется в процессе их дифференцировки и созревания, хранится в специфических гранулах, а при воспалении успешно дегранулирует во внеклеточное пространство. ЛФ обладает антибактериальными, противовирусными, противогрибковыми, иммуномодулирующими, антиоксидантными и другими полезными свойствами [30]. Один из аспектов антимикробного действия ЛФ — это высокое сродство данной молекулы к ионам железа. Структурно молекула ЛФ разделена на две части, называемые N- и C-долями, каждая из которых содержит сайт связывания железа, состоящий из 1 Asp, 1 His и 2 Tyr [31]. Процесс связывания ионов железа является кооперативным — связывание железа в С-доле существенно стабилизирует этот процесс в N-доле.

При изучении влияния АМП на железосвязывающую активность ЛФ было показано, что ни один из исследуемых нами новых синтетических АМП медицинской пиявки в используемом диапазоне концентраций (МИК_max/2, МИК_max и 2 МИК_max) не оказывал достоверного влияния на способность ЛФ связывать ионы железа (рис. 3). АМП, модифицированные под действием HOCl, также не воздействовали на железосвязывающую активность ЛФ (данные не представлены).

 

Рис. 3. Влияние антимикробных пептидов (АМП) на железосвязывающую активность лактоферрина (ЛФ): a — типичные кинетические кривые изменения оптической плотности раствора ЛФ (10 мг/мл) на длине волны 465 нм, соответствующей пику поглощения насыщенной железом формы ЛФ (холо-ЛФ), в отсутствие и в присутствии АМП 536_1 в различных концентрациях после 20 последовательных добавок соли железа [NH4Fe(SO4)2 · 12 H2O] (по 16 мкМ); b — влияние АМП 536_1, 12530, 3967_1 и 19347_2 в различных концентрациях на железосвязывающую активность ЛФ. МИКmax — максимальное значение среди минимальных концентраций АМП, необходимых для достижения 100 % ингибирования роста микроорганизмов Escherichia coli, Chlamydia trachomatis и Bacillus subtilis в стандартном тесте. За 100 % принята железосвязывающая активность ЛФ в контроле (в отсутствие АМП)

Fig. 3. Effect of AMP on LF iron-binding activity: a — typical kinetic curves of LF solution (10 mg/ml) optical density changes at a wavelength of 465 nm, corresponding to the absorption peak of LF iron-saturated form (holo-LF), in the absence and in the presence of AMP 536_1 at various concentrations after 20 successive additions of iron salt [NH₄Fe(SO₄)₂ · 12 H₂O] (16 μM each); b — effect of AMP 536_1, 12530, 3967_1 and 19347_2 at various concentrations on LF iron-binding activity. MIC_max — minimal inhibitory concentrations against three bacterial species (Escherichia coli, Chlamydia thrachomatis and Bacillus subtilis). LF iron-binding activity in the control (in the absence of AMP) was taken as 100%

 

Затем нами было исследовано влияние АМП на биологическую активность лизоцима, содержащегося в азурофильных, специфических и желатиназных гранулах нейтрофилов. Лизоцим (мурамидаза) представляет собой низкомолекулярный катионный белок, фермент класса гидролаз, разрушающий клеточные стенки бактерий путем гидролиза â(1-4)-гликозидной связи между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином пептидогликанов, входящих в состав плазматической мембраны бактерий, тем самым обеспечивая защиту макроорганизма от экзогенной и эндогенной микрофлоры. Пептидогликан при этом связывается с активным центром лизоцима (в форме кармана), содержащим два аминокислотных остатка, являющихся критичными для функционирования фермента: Glu в положении 35 и Asp в положении 52 [32].

Лизоцим лизирует клетки различных бацилл, микрококков, стафилококков, кишечной палочки, сальмонелл, шигелл, актиномицетов, некоторых видов дрожжей и грибов. Стандартным тестом для определения муколитической активности лизоцима является регистрация лизиса бактерий M. lysodeikticus [33]. Однако учитывая способность исследуемых АМП медицинской пиявки встраиваться в клеточную стенку бактерий и нарушать ее проницаемость, вначале нами было изучено действие самих АМП на бактерии M. lysodeikticus, а затем — совместное действие синтезированных АМП и лизоцима на эти бактерии.

Установлено, что индивидуальная антимикробная активность исследуемых АМП медицинской пиявки в отношении M. lysodeikticus была достаточно низкой — добавление всех АМП к M. lysodeikticus приводило лишь к небольшому уменьшению светопропускания клеточных суспензий (данные не представлены), что может свидетельствовать о встраивании АМП в мембрану бактерий, нарушении ее проницаемости для ионов и, как следствие, набухании бактериальных клеток.

При изучении сочетанного действия АМП и лизоцима были выявлены синергетические эффекты (~20 %) против грамположительных бактерий M. lysodeikticus для комбинации лизоцима с АМП 12530 (во всем исследуемом концентрационном диапазоне АМП), а также АМП 3967_1 в концентрации 10 мкМ и меньше. Ингибирование антимикробной активности происходило при совместном добавлении лизоцима и АМП 3967_1 в концентрации 15 мкМ и выше, а также АМП 536_1 во всем исследованном концентрационном диапазоне (рис. 4). Сильное ингибирование муколитической активности лизоцима после предварительной инкубации с АМП 536_1 может быть ассоциировано со взаимодействием катионных аминокислотных остатков АМП 536_1 [у данного АМП наибольший положительный заряд (+6) среди всех исследуемых АМП] с отрицательно заряженными аминокислотными остатками активного центра лизоцима, играющими ключевую роль в ферментативном расщеплении пептидогликанов бактериальной стенки. В случае аддитивной комбинации лизоцима с АМП 19347_2 в концентрациях, меньших МИК_max, общий эффект равнялся индивидуальному действию лизоцима, при увеличении концентрации АМП 19347_2 антибактериальная активность исследуемой смеси снижалась (рис. 4), что опять же может быть связано с электростатическим взаимодействием отрицательно заряженных Asp и Glu в активном центре фермента с положительно заряженным (+5) АМП 19347_2.

 

Рис. 4. Влияние антимикробных пептидов (АМП) 536_1, 12530, 3967_1 и 19347_2 в различных концентрациях на способность лизоцима лизировать бактериальные клетки M. lysodeikticus. За 100 % принята муколитическая активность лизоцима в контроле (в отсутствие АМП). МИКmax — максимальное значение среди минимальных концентраций АМП, необходимых для достижения 100 % ингибирования роста микроорганизмов Escherichia coli, Chlamydia trachomatis и Bacillus subtilis в стандартном тесте. *p < 0,05 по сравнению с активностью лизоцима в контроле (в отсутствие АМП)

Fig. 4. Effect of AMP 536_1, 12530, 3967_1, and 19347_2 at various concentrations on lysozyme ability to lyse M. lysodeikticus bacterial cells. Lysozyme mucolytic activity in the control (in the absence of AMP) was taken as 100%. MIC_max — minimal inhibitory concentrations against three bacterial species (Escherichia coli, Chlamydia thrachomatis and Bacillus subtilis). *p < 0.05 compared to lysozyme activity in the control (in the absence of AMP)

 

После модификации HOCl способность АМП 536_1 и 19347_2 ингибировать муколитическую активность лизоцима сохранялась, но эффект был меньше, чем для нативных АМП (данные не представлены), что может быть следствием снижения катионного заряда АМП после обработки HOCl и уменьшением взаимодействия с анионными аминокислотными остатками, входящими в состав активного центра фермента. Интересно, что после модификации HOCl способность АМП 3967_1 усиливать литическую активность лизоцима увеличивалась, в то время как АМП 12530 после галогенирующей модификации ингибировал муколитическую активность лизоцима (данные не представлены).

Заключение

На основании полученных данных можно сделать вывод, что использование препаратов на основе исследуемых новых АМП медицинской пиявки открывает потенциальную возможность оказывать положительное влияние в борьбе организма с возбудителями инфекций не только за счет антимикробного действия самих АМП, но и за счет модуляции этими соединениями биологической активности собственных эндогенных антимикробных белков и пептидов: усиления — в случае необходимости элиминации инфекции и ингибирования — для защиты от повреждения собственных тканей организма.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке БРФФИ в рамках проекта № Б20Р-215, РФФИ в рамках проекта № 20-515-00006, а также гранта Президента РФ МД-1901.2020.4.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Д.В. Григорьева — проведение экспериментов, их описание, обработка результатов; Е.Н. Графская, И.А. Лацис, В.Н. Лазарев — синтез АМП медицинской пиявки; А.В. Соколов — выделение белков из экстракта нейтрофилов; И.В. Горудко, О.М. Панасенко — подбор литературы, обсуждение результатов.

Об авторах

Дарья Владимировна Григорьева

Белорусский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: dargr@tut.by
ORCID iD: 0000-0003-0210-5474
SPIN-код: 2479-7785

канд. биол. наук, доцент кафедры биофизики физического факультета

Белоруссия, Минск

Ирина Владимировна Горудко

Белорусский государственный университет

Email: irinagorudko@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-4737-470X
SPIN-код: 8968-3125

канд. биол. наук, доцент, доцент кафедры биофизики физического факультета

Белоруссия, Минск

Екатерина Николаевна Графская

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства

Email: grafskayacath@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8957-6142
SPIN-код: 1821-2746

лаборант лаборатории генной инженерии

Россия, Москва

Иван Алексеевич Лацис

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства

Email: lacis.ivan@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8292-0737
SPIN-код: 6775-1702

младший научный сотрудник лаборатории генной инженерии

Россия, Москва

Алексей Викторович Соколов

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства; Институт экспериментальной медицины; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: biochemsokolov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-9033-0537
SPIN-код: 7427-7395

д-р биол. наук, заведующий лабораторией биохимической генетики отдела молекулярной генетики, старший научный сотрудник отдела биофизики, профессор кафедры фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий

Россия, Москва; Санкт-Петербург

Олег Михайлович Панасенко

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства; Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Email: o-panas@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5245-2285
SPIN-код: 3035-6808

д-р биол. наук, профессор, заведующий отделом биофизики; старший научный сотрудник отдела медицинской физики

Россия, Москва

Василий Николаевич Лазарев

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства

Email: lazar0@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0042-966X
SPIN-код: 1578-8932

д-р биол. наук, доцент, заведующий отделом клеточной биологии

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы