Impact of amino acid substitution T203I in hemagglutinin on growth characteristics in vitro and hemagglutinin thermostability of A/H3N2 influenza viruses

Ekaterina A. Bazhenova; Баженова Екатерина Андреевна; Ekaterina A. Stepanova; Степанова Екатерина Алексеевна; Tatiana S. Kotomina; Котомина Татьяна Сергеевна; Nataliya V. Larionova; Ларионова Наталья Валентиновна; Irina V. Kiseleva; Киселева Ирина Васильевна; Larisa G. Rudenko; Руденко Лариса Георгиевна

doi:10.17816/MAJ77767

Impact of amino acid substitution T203I in hemagglutinin on growth characteristics in vitro and hemagglutinin thermostability of A/H3N2 influenza viruses

Authors: Bazhenova E.A.¹, Stepanova E.A.¹, Kotomina T.S.¹, Larionova N.V.¹, Kiseleva I.V.¹, Rudenko L.G.¹
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
Issue: Vol 21, No 3 (2021)
Pages: 85-90
Section: Conference proceedings
URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/77767
DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ77767
ID: 77767

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Background: Russian live attenuated influenza vaccines are a three-component preparations that contain vaccine strains based on current epidemic influenza A/H1N1, A/H3N2 and B strains. Recent influenza viruses A/H3N2 are most susceptible to drift antigenic changes, and therefore, this component of the live attenuated influenza vaccines must be constantly updated. Current vaccine strains of live attenuated influenza vaccines are obtained by the method of classical reassortment using selective factors in developing chicken embryos. During the process of preparation of live attenuated influenza vaccines strains, single reassortants can acquire various egg-adaptive amino acid substitutions in hemagglutinin and neuraminidase – the genes responsible for the antigenic correspondence of the vaccine strain to the epidemic parent. These amino acid substitutions can affect the biological properties of the vaccine strain, thereby reducing the effectiveness of this component of live attenuated influenza vaccines.

AIM: The aim of the study was to explore the effect of amino acid substitution T203I in hemagglutinin of A/H3N2 influenza viruses on growth characteristics and hemagglutinin thermostability.

MATERIALS AND METHODS: For the study, three pairs of A/H3N2 vaccine reassortants were prepared. Reassortants differed from each other by amino acid Thr or Ile at position 203 in the hemagglutinin. The growth properties of vaccine strains were assessed by titration in eggs at 26–40°C and in a MDCK cell culture at 33°C. The thermostability of the hemagglutinin of studied influenza viruses was assessed by determining their ability to agglutinate 1% erythrocytes after exposure to elevated temperatures in the range of 37–70°C.

RESULTS: The amino acid substitution T203I in hemagglutinin in reassortants obtained on the basis of current influenza A/H3N2 viruses acquired during the preparation of vaccine strains does not affect the temperature sensitivity of viruses. It was shown that viruses with an egg-adaptive substitution T203I in hemagglutinin have more pronounced cold-adapted phenotype and a higher reproductive activity in MDCK cell culture, compared to strains without this mutation. It was found that hemagglutinin of reassortants with 203 Ile is more thermostable than with 203 Thr.

CONCLUSIONS: Our data indicate that the amino acid substitution of T203I in hemagglutinin in current influenza A/H3N2 viruses does not have a negative effect on biological properties, but improves growth characteristics in eggs and MDCK cells, as well as the thermostability of viruses.

Keywords

influenza virus, live attenuated influenza vaccine, reassortment, reverse genetics, growth properties, amino acid substitutions T203I

Full Text

Обоснование

Грипп — острое вирусное респираторное заболевание, характеризуемое высокой заболеваемостью и смертностью среди населения, что определяет его высокую социально-экономическую значимость для здравоохранения. Ежегодно вирусы гриппа вызывают эпидемии, а раз в 10–40 лет — пандемии, что связано с высокой антигенной изменчивостью вируса. Наиболее эффективным средством защиты против гриппа является вакцинопрофилактика инактивированными и живыми вакцинами. Ежегодно Всемирная организация здравоохранения дает рекомендации по составу гриппозных вакцин на Южное и Северное полушарие. Наиболее часто модифицируемый компонент гриппозных вакцин — компонент А/H3N2, это связано с его очень высокой антигенной изменчивостью. В последние годы замечено, что достаточно часто у вакцинных штаммов, принадлежащих серотипу А/H3N2, в процессе подготовки реассортантов появляется аминокислотная замена в позиции 203.

Цель нашей работы — изучение влияния данной аминокислотной замены на такие важные для вакцинных штаммов характеристики, как их ростовые свойства и степень термостабильности гемагглютинина.

Материалы и методы

Штаммы вируса гриппа

В работе были использованы три штамма сезонных вирусов гриппа А/Н3N2 (A/Brisbane/190/2017, A/Switzerland/8060/2017, A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016) и шесть реассортантов на основе донора аттенуации живой гриппозной вакцины (ЖГВ) А/Ленинград/17/134/57 и данных вирусов (табл. 1). Реассортанты отличались между собой аминокислотной позицией 203 в гемагглютинине (Thr/Ile). Два из них вошли в состав ЖГВ на 2015/2016, 2016/2017, 2017/2018 эпидемические по гриппу сезоны.

Таблица 1 / Table 1

Реассортанты вирусов гриппа А/Н3N2 и А/Ленинград/17/134/57, использованные в исследовании

Reassortants obtained on the basis of influenza viruses A/H3N2 and A/Leningrad/17/134/57 used in the study

Вирус-родитель	Реассортант	203	Метод получения
A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016	Sing/3571	Ile	КР
A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016	Sing/12	Thr	ОГ
A/Brisbane/190/2017	Br/7178	Ile	КР
A/Brisbane/190/2017	Br/825	Thr	ОГ
A/Switzerland/8060/2017	Swit/51203	Ile	КР
A/Switzerland/8060/2017	Swit/51	Thr	КР

Примечание. КР — классическая реассортация; ОГ — обратная генетика.

Вирусы культивировали в 10–11-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Реассортанты получали методом классической реассортации в РКЭ по стандартной методике [1]. Реассортанты с вакцинной формулой генома отбирали методами ПЦР и последующего секвенирования генов. Реассортанты методом обратной генетики получали по протоколу, описанному в работе И.Н. Исаковой-Сивак и соавт. [2]. Гены гемагглютинина и нейраминидазы из материала эпидемических вирусов клонировали в вектор для обратной генетики вируса гриппа (pCIPolISapIT) по сайтам рестрикции SapI, затем проводили сборку вирусов гриппа по методике [2] методом электропорации клеток Vero набором из 8 плазмид, кодирующих гены вирусов гриппа. Генетическую последовательность подтверждали с помощью секвенирования по методу Сэнгера [3] с использованием автоматического капиллярного ДНК-секвенатора 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя.

Активность репродукции вирусов гриппа в РКЭ при разных температурах оценивали по результатам их титрования в РКЭ при пермиссивной (33 °С), повышенной (40 °С, ts-фенотип) и пониженной (26 °С, сa-фенотип) температуре инкубации. Ростовые характеристики вакцинных вирусов гриппа оценивали в культуре клеток MDCK при температуре 33 °С в атмосфере 5 % CO₂ в течение 3 сут. Инфекционную активность рассчитывали по методу Рида и Менча [4] и выражали в lg ЭИД₅₀/мл (ЭИД₅₀ — средняя эмбриональная инфекционная доза) либо в lg ТЦИД₅₀/мл (ТЦИД₅₀ — доза, ингибирующая репродукцию вируса на 50 %).

Степень термостабильности гемагглютинина определяли по потере гемагглютинирующей активности после воздействия неоптимальных температур. Методика аналогична описанной С. Scholtissek [5]. Вируссодержащий материал для проведения реакции предварительно был разведен фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,4) в соотношении 1 : 5 и прогрет в течение 20 мин при температуре 37–70 °С. Далее определяли титр вируса в реакции гемагглютинации с 1 % куриными эритроцитами.

Статистический анализ данных производили с использованием GraphPad Prism v.7.

Результаты исследования

Оценка ростовых и фенотипических свойств реассортантов

Инфекционный титр всех исследованных вирусов в РКЭ при оптимальной температуре (33 °С) был выше 7,5 lg ЭИД₅₀/мл. Все исследованные реассортанты обладали ts- и ca-фенотипами в РКЭ. Таким образом, независимо от аминокислоты в 203-й позиции, ростовые и фенотипические свойства всех реассортантов соответствовали требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам. Статистически достоверных отличий между титрами вирусов, содержащих и не содержащих замену T203I в гемагглютинине, обнаружено не было (непараметрический критерий Вилкоксона для парных сравнений, р = 0,50 для титров при 33 °С, p = 0,25 для титров при 26 °С, p = 0,25 для титров в культуре клеток MDCK). Тем не менее можно отметить тенденцию к большей выраженности холодоадаптированных свойств у реассортантов с аминокислотной заменой T203I в гемагглютинине, а также несколько более высокую репродуктивную активность в культуре клеток MDCK (табл. 2).

Таблица 2 / Table 2

Оценка фенотипических свойств изученных реассортантов в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK

Assessment of the phenotypic properties of the studied reassortants in egg and MDCK cell culture

Название вируса	Титр в РКЭ, lg ЭИД₅₀/мл			RCT в РКЭ, lg ЭИД₅₀/мл		Фенотип	Титр в MDCK, lg ТЦИД₅₀/ мл
Название вируса	33 °С	40 °С	26 °С	40 °С	26 °С	Фенотип	Титр в MDCK, lg ТЦИД₅₀/ мл
Br/7178 (203I)	8,4	≤1,2	5,7	≥7,2	2,7	ts, ca	6,0
Br/825 (203T)	7,7	≤1,2	4,2	≥6,5	3,5	ts, ca	3,1
Swit/51203 (203I)	8,2	≤1,2	5,7	≥7,0	2,5	ts, ca	6,8
Swit/51 (203T)	8,5	≤1,2	5,0	≥7,3	3,5	ts, ca	5,6
Sing/3571 (203I)	8,5	≤1,2	6,0	≥7,3	2,5	ts, ca	6,4
Sing/12 (203T)	7,9	≤1,2	4,7	≥6,7	3,2	ts, ca	4,9

Примечание. RCT — разность репродуктивной активности при оптимальной температуре и при пониженной до 26 °С либо повышенной до 40 °C температуре инкубации; РКЭ — развивающиеся куриные эмбрионы; ЭИД₅₀ — средняя эмбриональная инфекционная доза; ТЦИД₅₀ — доза, ингибирующая репродукцию вируса на 50 %.

Оценка термостабильности гемагглютинина

Реассортанты, у которых аминокислотная последовательность гемагглютинина полностью совпадала с таковой эпидемического родителя (203T), наследовали ту же степень термостабильности, что и вирус, на основе которого они были получены. Как видно из табл. 3, вирусы гриппа A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 и А/Switzerland/8060/2017, а также реассортанты Sing/12 и Swit/51, полученные на их основе, в гемагглютинине которых не было яично-адаптационной замены T203I, характеризовались низкой степенью термостабильности и теряли агглютинирующую активность уже при 54 и 50 °С соответственно. Реассортанты же Sing/3571 и Swit/51203, в гемагглютинине которых была аминокислотная замена T203I, обладали значительно более высоким уровнем термостабильности; они теряли агглютинирующую активность только при 60 и 58 °С соответственно. Вирус гриппа А/Brisbane/190/2017, популяция которого исходно уже содержала яично-адаптационную замену T203I, и реассортант Br/7178, полученный на его основе, характеризовались высокой степенью термостабильности и теряли агглютинирующую активность при 58 °С. Реассортант Br/825 (203T) обладал достаточно низким уровнем термостабильности и терял агглютинирующую активность уже при 50 °С.

Таблица 3 / Table 3

Анализ термостабильности эпидемических вирусов гриппа А/H3N2 и реассортантов, полученных на их основе, отличающихся между собой аминокислотной заменой T203I в гемагглютинине

Analysis of the thermostability of epidemic influenza A/H3N2 viruses and reassortants obtained on their basis, differing in amino acid substitution T203I in hemagglutinin

Название вируса	Титр в реакции гемагглютинации
Название вируса	37 °С	50 °С	54 °С	56 °С	58 °С	60 °С	65 °С	70 °С
A/Br/190/2017* (203I)	640	640	640	640	320	<5	<5	<5
Br/7178 (203I)	640	640	1280	1280	160	<5	<5	<5
Br/825^#(203T)	160	160	<5	<5	<5	<5	<5	<5
A/Swit/8060/2017 (203T)	320	320	<5	<5	<5	<5	<5	<5
Swit/51 (203T)	320	320	<5	<5	<5	<5	<5	<5
Swit/51203 (203I)	640	640	640	640	80	<5	<5	<5
A/Sing/INFIMH-16-009/2016 (203T)	1280	640	160	<5	<5	<5	<5	<5
Sing/3571 (203I)	640	640	640	640	640	40	<5	<5
Sing/12 (203T)	320	320	160	<5	<5	<5	<5	<5

* Данный пассаж дикого вируса содержал аминокислотную замену T203I в гемагглютинине. ^# Данный реассортант получен на основе дикого вируса A/Br/190/2017, пассаж которого не содержал аминокислотную замену T203I в гемагглютинине.

Обсуждение

Вирусы гриппа H3N2 — наиболее часто заменяемый компонент противогриппозных вакцин, при этом за счет высокой специфичности к рецепторам Siaá2-6Gal вирусы данного подтипа часто приобретают яично-адаптационные замены. Мы установили, что несколько сезонов подряд в процессе подготовки вакцинных штаммов на основе современных вирусов гриппа A/H3N2 реассортанты приобретали в процессе пассирования в РКЭ аминокислотную замену T203I в гемагглютинине. Данных о влиянии этой замены на отдельные биологические свойства современных вирусов гриппа A/H3N2 в литературе представлено мало. Поскольку любая аминокислотная замена в гемагглютинине может негативно отразиться на эффективности вакцины, необходимо детальное изучение свойств штаммов в экспериментальных условиях.

Мы исследовали ростовые характеристики штаммов, отличающихся одной позицией в гемагглютинине, в РКЭ (основной субстрат для подготовки ЖГВ) и культуре клеток млекопитающих. Кроме того, мы тестировали термостабильность гемагглютинина этих штаммов, поскольку данная характеристика является специфическим маркером, коррелирующим с трансмиссивностью, вирулентностью и рецепторной специфичностью штаммов, их иммуногенностью и стабильностью вакцинного препарата [5–7].

Полученные нами данные о репродукции штаммов вируса гриппа в РКЭ свидетельствуют, что все исследуемые реассортанты обладали фенотипическими свойствами, необходимыми вакцинному штамму, то есть имели ts- и ca-фенотип. Однако у реассортантов с аминокислотной заменой T203I были более выражены холодоадаптированные свойства, что очень важно для репродукции вируса во входных воротах инфекции. Таким образом, при выборе вакцинного кандидата они выглядят предпочтительнее. Кроме того, замена T203I не приводила к снижению способности к репликации в культуре клеток млекопитающих, что также является важным свойством для ЖГВ.

Термостабильность штаммов гемагглютинина с Ile в позиции 203 также была выше. В работе F. Wen и соавт. [8] замена, увеличивающая термостабильность, приводила и к более высокой иммуногенности. Исходя из полученных нами результатов исследования термостабильности штаммов гемагглютинина можно ожидать, что реассортанты 203I будут более иммуногенны по сравнению со штаммами 203T, поскольку проявляют более выраженные термостабильные эффекты.

Выводы

Полученные нами данные свидетельствуют, что аминокислотная замена T203I в гемагглютинине у современных вирусов гриппа A/H3N2 не оказывает негативного влияния на ростовые характеристики в РКЭ и культуре клеток MDCK, а наоборот, увеличивает способность штаммов к росту при пониженной температуре и термостабильность гемагглютинина вирусов. В связи с этим при отборе вакцинных кандидатов предпочтительнее реассортанты с яично-адаптационной заменой T203I в гемагглютинине.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках плановой темы НИР отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

About the authors