Роль коинфекции вирусами гриппа при тяжелом течении COVID-19

Полный текст

Обоснование

В настоящее время продолжается глобальное распространение новой коронавирусной инфекции (COVID-19), вызванной вирусом SARS-CoV-2 [1]. При этом мало изучен вклад других сезонных вирусных инфекций, таких как грипп или респираторно-синцитиальная вирусная инфекция, в патогенез тяжелой COVID-19 при коинфицировании [2, 3]. Клинические и лабораторные признаки гипервоспалительного синдрома, развивающегося при COVID-19, или COVID-19-индуцированного «цитокинового шторма», продолжают широко изучать [4]. В качестве обязательных критериев развития «цитокинового шторма» при COVID-19 предложно учитывать повышение сывороточной концентрации С-реактивного белка (СРБ) и нейтрофильно-лимфоцитарное отношение (НЛО), которые служат показателями системных воспалительных реакций и широко исследуются в качестве предикторов для прогноза пациентов с вирусной пневмонией, в том числе при COVID-19 [5].

Цель настоящей работы — оценить возможность коинфекции вирусами гриппа у пациентов с различной тяжестью течения COVID-19 и оценить сывороточную концентрацию СРБ и НЛО.

Материалы и методы

Сыворотки крови. Использовали парные сыворотки крови пациентов с разной степенью тяжести COVID-19. Пациенты были госпитализированы в феврале – апреле 2020 г. в ГБУЗ ЛО «Всеволожская КМБ». Степень тяжести COVID-19 оценивали в соответствии с «Временными рекомендациями по профилактике, диагностике и лечению новой коронавирусной инфекции (COVID-19)», версия 8. Изучено 28 парных проб, полученных при поступлении пациентов в стационар и через 5–7 дней пребывания в стационаре. В качестве контрольных образцов использовали сыворотку крови пациентов, полученную до распространения COVID-19 в начале 2019 г., включая 18 парных сывороток пациентов с подтвержденной гриппозной инфекцией.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Сыворотку исследовали с помощью ИФА на наличие антител иммуноглобулинов (Ig) G, специфичных к S-белку SARS-CoV-2 в дупликатах. Для этого 96-луночные панели сенсибилизировали коммерческим рекомбинантным S-белком SARS-CoV-2 (AtaGenix, Ухань, КНР), в качестве конъюгата применяли кроличьи пероксидазно меченные антитела к IgG человека (CloudClone Corp., Ухань, КНР).

Выявление антител к вирусам гриппа. Парные сыворотки пациентов с COVID-19 протестированы на повышение уровня антител к вирусам гриппа A/Нью Йорк/61/15 (H1N1)pdm09, A/17/Гонконг/2014/8296 (H3N2) и B/Колорадо/06/2017 (антигенная линия В/Виктория) с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и ИФА. Вирусы гриппа из коллекции вирусов ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» культивировали в аллантоисной полости 10-дневных куриных эмбрионов. РТГА проводили в 96-луночных панелях для серологических реакций с использованием 0,75 % взвеси эритроцитов человека по описанным методикам [6]. Для выявления вирусспецифических IgG и IgM 96-луночные панели (Sarstedt, Нумбрехт, Германия) сенсибилизировали концентрированными и очищенными на ступенчатом градиенте сахарозы вирусами гриппа с применением 20 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ) в течение ночи при 4 °С. ИФА проводили, как описано ранее [6].

Результаты считали положительными при выявлении по крайней мере четырехкратного повышения уровня антител не менее чем в двух тестах.

Лабораторные данные. Сывороточную концентрацию CРБ определяли турбодиметрическим методом с использованием реактивов BioSystems. НЛО рассчитывали на основании данных клинического анализа крови (абсолютное число нейтрофилов/абсолютное число лимфоцитов).

Статистический анализ. Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета программ Statistica 12.0 (StatSoft, Inc. Tulsa, США). Для сравнения двух независимых групп использовали U-критерий Манна – Уитни. В случае номинальных данных применяли критерий хи-квадрат. Различия считали значимыми при p < 0,05.

Результаты

Сыворотка крови была получена в 1-й и 6–7-й день пребывания в стационаре, показатели СРБ и НЛО — на 1-й день поступления в стационар. Основные результаты представлены в таблице.

 

Таблица / Table

Результаты изучения парных образцов сывороток крови пациентов с разной степенью тяжести COVID-19

Results of a study of paired blood serum samples from patients with varying severity of COVID-19

Критерий	Степень тяжести
	легкая	средняя	тяжелая
Число в группе	10	8	10
Положительный ПЦР-тест на SARS-Cov-2	8 (80 %)*	5 (62,5 %)	2 (20 %)*
Четырехкратное увеличение уровня IgG к S-белку	4 (40 %)	6 (75 %)	4 (40 %)
Четырехкратное увеличение уровня антител к гриппу	0**, †	4 (50 %)**	4 (40 %)†
С-реактивный белок, мг/л (Me [Q25; Q75]) (референс-значения 0,00–5,00 мг/л)	45,6††, # [20, 95; 65, 9]	179,8†† [86, 6; 200, 4]	290,6# [207, 1; 371, 2]
Нейтрофильно-лимфоцитарное отношение (Me [Q25; Q75]) (референс-значения 1,13–3,79)	5,25## [12, 8; 5, 7]	6,1 [3, 6; 7, 1]	13,52## [8, 4; 24, 5]

* Доля лиц с легким течением инфекции по сравнению с тяжелым течением (критерий хи-квадрат, р = 0,01). ** Доля лиц с в группе с течением инфекции средней тяжести по сравнению с легким течением (критерий хи-квадрат, р = 0,023). ^† Доля лиц в группе с тяжелым течением инфекции по сравнению с легким течением (критерий хи-квадрат, р = 0,043). ^†† Средний уровень С-реактивного белка выше в группе с течением инфекции средней тяжести по сравнению с легким течением (тест Манна – Уитни, Z = 2,38, p = 0,017). ^# Cредний уровень С-реактивного белка выше в группе с тяжелым течением инфекции по сравнению с легким течением (тест Манна – Уитни, Z = 3,67, p = 0,0002). ^## Cреднее значение нейтрофильно-лимфоцитарного отношения больше в группе с тяжелым течением инфекции по сравнению с легким течением (тест Манна – Уитни, Z = 3,1, p = 0,0019).

 

Положительный ПЦР-тест на SARS-Cov-2 регистрировали чаще при легком течении заболевания (см. таблицу). По крайней мере четырехкратное увеличение титров сывороточных антител IgG к S-белку SARS-Cov-2 обнаружено у 16 из 28 обследованных пациентов (57,1 %) через 6–7 дней пребывания в стационаре. При этом повышение уровня IgG к S-белку выявляли как у пациентов с подтвержденной ПЦР COVID-19, так и без подтверждения. При изучении сывороток пациентов с подтвержденной гриппозной инфекцией, полученных в 2019 г., то есть до распространения SARS-CoV-2, антитела к SARS-Cov-2 не обнаружены (данные не показаны). Среди 18 пациентов со среднетяжелым и тяжелым течением инфекции у 8 (44,4 %) выявлено как минимум четырехкратное повышение уровня антител к вирусам гриппа. В шести случаях зафиксировано повышение уровня антител к гриппу A/H1N1, в одном — к гриппу A/H3N2 и в двух случаях к вирусу гриппа В, при этом у одного пациента отмечено повышение уровня антител к вирусам A/H1N1 и В.

Усредненные показатели сывороточной концентрации СРБ значительно превышали таковые при тяжелой и средней формах COVID-19 по сравнению с легкой формой, значения НЛО при тяжелой форме инфекции были более чем в 2 раза выше по сравнению с таковыми при легкой и средней степенях тяжести заболевания (см. таблицу).

Обсуждение

Выявление генетического материала SARS-CoV-2 методом ПЦР — это один из основных критериев диагностики COVID-19. При обращении за медицинской помощью на позднем сроке заболевания РНК вируса может не детектироваться. Так, в нашем исследовании показано более редкое выявление генетического материала SARS-Cov-2 среди пациентов с тяжелым течением по сравнению с легкой формой. Обнаружение вирусспецифических антител может дополнительно указывать на случаи COVID-19. Однократный анализ крови на антитела мало информативен, интерес представляют исследования серийных клинических образцов, полученных от одних и тех же пациентов. В нашем исследовании нарастание титров IgG к S-белку SARS-CoV-2 наблюдалось более чем у половины обследованных к концу первой недели пребывания в стационаре, как в случаях положительного ПЦР-анализа, так и без ПЦР-подтверждения.

Обнаруженное повышение уровня антител к вирусам гриппа при среднетяжелом и тяжелом течении COVID-19 согласуется с данными, полученными в ранний период вспышки COVID-19 в г. Ухане (12 января – 21 февраля 2020 г.), когда коинфекция SARS-CoV-2 и вирусов гриппа была широко распространена (грипп A — 49,8 % и грипп B — 7,5 %) [6]. Путем экспериментальной коинфекции вирусом гриппа A и псевдотипированным или живым вирусом SARS-CoV-2 выявлено, что предварительная гриппозная инфекция значительно повышает инфекционность SARS-CoV-2 в различных клеточных культурах. В экспериментах на мышах при коинфекции вирусами гриппа и SARS-CoV-2 зарегистрированы повышенная вирусная нагрузка SARS-CoV-2 и более тяжелое повреждение легких. При этом усиление инфекционности SARS-CoV-2 не отмечено при коинфицировании с некоторыми другими респираторными вирусами, возможно, из-за уникальной особенности вирусов гриппа к повышению экспрессии ACE2. Это исследование показывает, что вирусы гриппа, вероятно, обладают уникальной способностью усугублять инфекцию SARS-CoV-2, и, таким образом, предот-вращение гриппозной инфекции имеет большое значение во время пандемии COVID-19 [8]. Предстоящий сезон гриппа в северном полушарии, накладывающийся на продолжающееся распространение SARS-CoV-2, создает потенциально серьезную угрозу для здоровья населения, существенно уменьшить которую может вакцинация населения против гриппа.

Вирусные и бактериальные инфекции, вызывают повышение сывороточной концентрации СРБ. Например, при гриппе этот показатель составляет в среднем 25,65 мг/л, в случае же присоединения бактериальной пневмонии средний уровень СРБ возрастает до 135,96 мг/л [9]. НЛО также рассматривают как важный показатель воспаления при COVID-19. Ранее было показано, что среднее значение НЛО при легком течении болезни составляло 5,6, а при среднем — 9,2. Это различие было статистически значимым. Было замечено также, что значение НЛО положительно коррелировало с оценкой тяжести пневмонии, продолжительностью пребывания в стационаре, уровнями СРБ и D-димера [10].

Заключение

С помощью серологической диагностики можно дополнительно выявлять случаи коронавирусной инфекции, когда вирус не обнаружен методом ПЦР. При среднетяжелых и тяжелых случаях COVID-19 выявлены случаи коинфицирования с вирусами гриппа А и В. При этом показатели СРБ и НЛО значительно превышали таковые при легком течении заболевания. Скрининг на вирусы гриппа может значительно улучшить клиническое ведение пациентов, поскольку существуют рекомендованные противовирусные препараты от гриппа (ингибиторы нейраминидазы).

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке бюджетных средств ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» в рамках проекта № 2018-557-003 по теме государственного задания «Молекулярно-генетические и клеточные основы патогенеза, диагностики и лечения социально значимых заболеваний инфекционной и неинфекционной природы». Исследование частично поддержано Правительством Санкт-Петербурга в сфере научной и научно-технической деятельности за 2020 г. (грант № 335-20).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическая экспертиза. Выполнение исследования одобрено протоколом этического комитета (протокол № 3/20 от 06.05.2020).

Об авторах

Тамара Николаевна Шведова

Всеволожская клиническая многопрофильная больница

Автор, ответственный за переписку.
Email: toma_nn@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6649-8150

заведующая клинико-диагностической лабораторией, врач

Россия, Ленинградская область, Всеволожск

Ольга Сергеевна Коптева

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: olga.s.kopteva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2645-3433
SPIN-код: 7630-3067

аспирант

Россия, Санкт-Петербург

Полина Андреевна Кударь

Институт экспериментальной медицины

Email: polina6226@mail.ru

студентка, отдел вирусологии

Россия, Санкт-Петербург

Анна Александровна Лернер

Всеволожская клиническая многопрофильная больница; Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова

Email: sever67@bk.ru
ORCID iD: 0000-0001-5848-6486

канд. мед. наук, главный штатный специалист по клинической лабораторной диагностике; ассистент кафедры клинической лабораторной диагностики

Россия, Ленинградская область, Всеволожск; Санкт-Петербург

Юлия Андреевна Дешева

Санкт-Петербургский государственный университет; Институт экспериментальной медицины

Email: desheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9794-3520

д-р мед. наук, доцент, профессор кафедры фундаментальных проблем медицины и медицинских технологий, факультет стоматологии и медицинских технологий; ведущий научный сотрудник отдела вирусологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы