EFFECT OF HEAT-INDUCED ANTIGEN RETRIEVAL PROCEDURE ON DNA FLUORESCENT STAINING QUALITY IN HISTOLOGIC SECTIONS

Abstract


The heat-induced epitope retrieval procedure is an important step in the procedure of immunofluorescent staining of tissues fixed in formalin-containing solutions. Generally, apart from the detection of the examined antigen, the staining of cell nuclei w ith appropriate fluorescent dyes is also carried out during the morphological studies. This procedure is used to identify the cells position and form, the phase of the mitotic cycle, the size of the nucleus and the nucleolus, the chromatin condition. The aim of our study is to investigate the effects of heat-induced epitope retrieval (HIER) procedure on the quality of DNA staining by fluorescent dyes DAPI and 7-Aminoactinomycin D. We have found that the potential effect of the HIER procedure on the stability and intensity of cell nuclei fluorescence staining should be taken into account in selecting a protocol for immunofluorescence antigen identification during a morphological study. Data obtained in the course of this study should be taken into account when carrying out a multicolor fluorescence and confocal laser microscopy.

Введение. В современных морфологических исследованиях широко применяется метод иммунофлуоресцентного выявления антигенов тканей с последующим анализом препаратов с применением флуоресцентной и лазерной конфокальной микроскопии. Однако вы вление продукта реакции нередко осложняется низкой интенсивностью его флуоресценции и/или присутствием диффузной автофлуоресценции окружающих тканей. Повысить чувствительность иммунофлуоресцентной реакции и увеличить интенсивность флуоресценции комплекса антиген-антитело возможно путем проведения демаскирования антигена. Процесс демаскировани эпитопов антигенов дл парафиновых срезов тканей, подвергшихс форма-линовои фиксации, является ключевым для успешного применения иммунофлуоресцентных методов окраски. Эта процедура направлена на восстановление нативноИ структуры белка, измененноИ в результате образования перекрестных сшивок между тканевыми белками в процессе фиксации. Существует несколько подходов к процессу раскрытия эпитопа антигена. Один из методов демаскирования - протеолитическое воздеИствие на ткань ферментами. Однако такое воздеИствие часто делает ткань более хрупкоИ и способствует увеличению окрашивания фона. Кроме того, возможно, нарушение структуры исследуемого антигена, а также разрушение более крупных белков до их предшественников, содержащих аналогичные антигенные саИты [1, 2]. Многочисленные исследовани показали, что восстановить антигенные эпитопы, измененные при взаимодеИствии с формальдегидом, возможно путем высокотемпературного демаскировани - нагревани депарафинированного материала в различных буферных растворах при разных значениях рН [3-5]. Для борьбы с фоновоИ флуоресценциеИ исследуемых тканеИ примен ютс различные подходы, включа извлечение автофлуоресцентных составл ющих, химическую модификацию флуорохрома, фотообесцвечивание и блокировку автофлуоресцентных структур. Однако наиболее простым способом в-л етс подбор оптимального времени и способа теплового демаскирования антигена [6$8]. В большинстве случаев при морфологических исследовани х необходимо проведение визуализации ядер клеток и их основных компартментов, мен ющихс в ответ на специфические клеточные сигналы и изменение активности дер в различных услови х. В ходе таких исследованиИ, кроме иммунофлуоресцентного вы влени определенного антигена, производят также окрашивание ядер клеток соответствующими флуоресцентными кра-сител ми. Многоцветна иммунофлуоресцентна окраска препаратов с одновременным вы влением молекул ДНК дает возможность изучения взаимоотношениИ структур цитоплазмы и дра, осо-бенностеИ и нарушениИ процессов митоза, ремоделирования хроматина [9-11]. Также подкраска препаратов флуоресцентными дерными красите-л ми позвол ет регистрировать р д морфологических параметров, св занных с функциональным состоянием клетки (размеры ядра и ядрышка, состояние хроматина). Флуорохромы могут быть использованы для решения самостоятельных задач при изучении изменениИ структуры клеточного ядра. Так, выявление молекул ДНК в комплексных морфологических исследовани х предоставл -ет широкие возможности для изучения трансфор мации ядерных структур, изменениИ клеточного цикла, исследовани структурно-функциональных взаимоотношениИ различных экстрахромосомных дерных доменов, динамики их молекул рного состава в различных активных и неактивных клеточных системах [12, 13]. Наиболее часто для вы-влени ДНК клеток тканеИ при флуоресцентноИ и конфокальноИ лазерноИ микроскопии примен -ются флуорохромы 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и 7-Аминоактиномицин D (7-AAD). Эти красители про вл ют флуоресценцию в разных областях спектра, что дает возможность использовать их при проведении многоцветного иммунофлуоресцентного вы влени антигенов тканеИ с применением антител, меченных флуорохрома-ми, обладающими различноИ эмиссиеИ. Так как реакции иммунофлуоресценции обладают малоИ чувствительностью, иммуногистохимические ис-следовани с проведением флуоресцентноИ визуализации антигена требуют применения демаскиро-вани эпитопов. Однако известно, что применение метода теплового демаскировани исследуемого антигена может приводить к экстракции нуклеиновых кислот [14] и вызывать их частичную денатурацию [15], снижая качество флуоресцентного окрашивани дер клеток. Цель работы: изучение влия ния теплового де-маскировани антигена на качество окрашивани ядер клеток флуоресцентными красителями DAPI и 7-А миноактиномицином D. Материалы и методы исследования. В работе использованы парафиновые срезы (5 мкм) различных отделов спинного мозга крыс, подвергшегося фиксации в цинк-этанол-формальдегиде (ЦЭФ). Материал был получен из архива Отдела общеИ и частноИ морфологии ФГБНУ «ИЭМ». В ходе исследовани парафиновые срезы спинного мозга (СМ) крыс после стандартноИ процедуры депара-финировани и регидратации подвергали тепловому демаскированию. Процесс проводили в пароварке в сосуде Хелендахеля с применением 0,01 моль/л цитратного буфера (pH 6,0) или модифицированного цитратного буфера S1700 (Dako, Дания, pH 6,1), предварительно нагретых до 60 °С. Время температурноИ обработки составляло 10-40 мин. Контрольные срезы не подвергали температурному воздеИствию. Далее остывшие предметные стекла со срезами промывали дистиллированноИ водоИ и в 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) в течение 10 мин при комнатноИ температуре. После этого на срезы наносили флуорохромы DAPI (0,2 мкг/мл - 600 нМ) или 7-А миноак-тиномицин D (40 мкг/мл - 32 мкМ) из набора SelectFX (S33025, Invitrogen, США) и инкубировали при температуре 27 оС в течение 30 мин. После этого промывали полученные срезы в ФСБ и заключали в водорастворимую среду Fluorescence mounting medium (Dako, Дания). Препараты исследовали под микроскопом Leica DM2500, оснащенным системой фильтров флуоресценции от 340 до 560 нм. В комплект блок-системы фильтров входили: возбуждающий фильтр ВР 340-380 нм (А), возбуждающий фильтр ВР 450-490 н м (I3); возбуждающий фильтр ВР 515- 560 нм (N2.1). Фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры Leica DFC420 (Германия). Результаты и их обсуждение. Для флуоресцентной подкраски клеточных ядер существует большой выбор красителей, различающихся по длине волны эмиссии от синего до дальнего красного излучения. При выборе оптимального дерного красител , подход щего дл конкретных задач исследовани , необходимо учитывать соответствие спектральных характеристик красител и фильтров, имеющихся для оборудования, на котором будет проводиться визуализация, а также селективность красителя к ДНК [16, 17]. В на-сто щей работе дл вы влени дер клеток СМ после теплового демаскировани примен ли широко используемые как при флуоресцентной, так и при лазерной конфокальной микроскопии флуо-рохромы 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и 7-Аминоактиномицин D (7-AAD). DAPI представляет собой непроникающий через цитоплазматическую мембрану синий флуоресцентный ДНК-краситель (максимумы воз-буждения/излучения: 358/461 нм), проявляющий 20 -кратное усиление флуоресценции при св зыва-нии с AT-областями двухцепочечной DNA. Для возбуждения флуоресценции красителя при конфокальной микроскопии используют ультрафиолетовый (360 н м) лазер, при флуоресцентной микроскопии применяют фильтр ВР 340-380 нм (А). В ходе насто щего исследовани при изучении препаратов СМ крыс, окрашенных DAPI , показано, что дра клеток тканей, не подвергшихс тепловому демаскированию, интенсивно окрашиваютс флуорохромом. Фонова флуоресценци при этом минимальна или отсутствует, интенсивность флуоресценции не снижается даже при максимальной интенсивности облучения препарата возбуждающим лазером (рис. 1, а). Аналогичное качество окраски ДНК клеток спинного мозга крыс было получено при температурном воздействии в течение 5 и 10 мин с применением буферного раствора S1700 (рис. 1, в). Тепловая обработка в S1700 более 10 мин значительно ухудшает визуализацию дерных элементов, четкость дифференцировки ядер клеток снижается, проявляется интенсивная фонова автофлуоресценци цитоплазматических структур, волокон нейропиля и межклеточного вещества. Кроме того, отмечено, что такой способ температурного демаскировани приводит к быстрому снижению интенсивности флуоресценции дер клеток (выгоранию флуоресцентного краси-тел ) при исследовании под флуоресцентным микроскопом и облучении соответствующим лазером (рис. 1, д). Рис. 1. Флуоресцентная окраска я дер клеток спинного мозга крысы без температурного воздействия (а, б) и после теплового демаскирования антигена в модифицированном цитратном буфере S1700 (pH 6,1); в - демаскирование 10 мин; г - демаскирование 20 мин; д, е - демаскирование 30 мин. Флуоресцентный ядерный краситель DAPI (а, в, д) и 7-аминоактиномицин D (б, г, е). Ув.: х630. При использовании цитратного буферного раствора (рН 6,0) дл демаскировани эпитопов наиболее интенсивна и стойка флуоресценци дер, окрашенных DAPI, проявляется при нагревании в течение 20-3 0 мин. Такие услови демаски-ровани позвол ют четко дифференцировать дра клеток даже при неполной интенсивности возбуждающего лазера. При более длительном демаскировании, значительна автофлуоресценци тканей затрудн ет дифференцировку клеток и их дер. Второй краситель, который был изучен в на-сто щей работе, широко примен етс в современных морфологических исследовани х, требующих флуоресцентной окраски ядер, - красный флуоресцентный краситель, обладающий избирательностью к молекулам ДНК (максимумы возбужде-ния/излучения: 546/647 нм) 7-Аминоактиноми-цин D (7-AAD). Этот краситель интеркалирует в двухцепочечную ДНК с высоким сродством к областя м, богатым GC-парами. 7-AAD не способен проникать через интактные клеточные мембраны. При оценке окраски препарата используют желтый или голубой (561 или 488 нм) лазер, при флуоресцентной микроскопии применяют фильтр ВР 515-560 нм (N2.1). Согл асно данным, полученным в наших предыдущих исследованиях, данный дерный краситель обладает высокой чувствительностью и про вл ет устойчивую флуоресценцию при применении различных протоколов вы влени антигенов тканей [18, 19]. В насто щей работе установлено, что при окраске дер с применением 7-AAD, оптимальное врем демаскировани в S1700 составл ет 20 мин (рис. 1, г). При таких условиях обработки ткани хорошо визуализируются зоны эу- и гетерохроматина (рис. 2). При меньшем времени демаскирования или отсутствии температурной обработки интенсивность флуоресценции дер недостаточна, что требует применени максимальной интенсивности облучения возбуждающим лазером (рис. 1, б). Однако при таком режиме исследования препаратов происходит быстрое снижение интенсивности флуоресценции ядер клеток. При демаскировании антигенов тканей в растворе S1700 более 20 мин происходит увеличение флуоресценции неспецифического фона, что затрудн ет идентификацию ядер (рис. 1, е). Также показано, что 7-AAD интенсивно окрашивает дра клеток при демаскировании в цитратном буфере (рН 6,0) в течение 10-2 0 мин. При большем времени воздействи повышенной температуры также наблюдается усиление автофлуоресценции тканей. Дл теплового демаскировани тканевых антигенов при иммунофлуоресцентном исследовании, разработано большое количество буферных растворов с различным уровнем рН: EDTA (pH 8,0), Tris-EDTA (pH 9,0), TRIS (pH 10,0) и др. Растворы с высоким значением pH имеют существенные недостатки. Их применение способствует окрашиванию фона и нарушению целостности ткани [2, 3]. Наиболее часто группы исследователей и отдельные производители антител рекомендуют дл демаскировани эпитопов при-мен ть 0,01 моль/л цитратный буфер (pH 6,0) или модифицированный цитратный буфер S1700 (Dako, Дания, pH 6,1). Считается, что данные растворы хорошо подходят для использования при иммунофлуоресцентном окрашивании парафиновых срезов тканей, фиксированных в формалине (в случае отсутствия указаний о непригодности этих растворов в аннотации к конкретным антителам) и значительно улучшают результаты окра-шивани . Однако в ходе насто щего исследова-ни , выполненного на материале, фиксированном в особом, разработанном в отделе общей и частной морфологии ФГБНУ «ИЭМ» растворе цинк-этанол-формальдегида [15], при использовании дл теплового демаскировани цитратного буфера было отмечено ухудшение качества тканей срезов СМ крыс, а также в отдельных случаях наблюдалось отклеивание гистологического материала с поверхности адгезивных предметных стекол. Стоит отметить, что демаскирование в цитрат-ном буферном растворе в течение 4 0 мин приводит к снижению интенсивности флуоресценции ядер клеток, как при использовании DAPI, так и 7-AAD, что, вероятно, объясняется частичной денатурацией и/или экстракцией ДНК [15]. Можно сделать вывод, что модифицированный цитратный буфер S1700 является более мягкой средой демаскирования , так как даже при длительном нагревании не наблюдается нарушения целостности срезов, в то врем как при использовании цитратного буфера при демаскировании более 30 мин, происходит отклеивание гистологических срезов с поверхности адгезивных предметных стекол. Рис. 2. Ядра клеток нервной ткани. Окраска флуоресцентным ядерным красителем 7-аминоактиномицином D. Толстая стрелка - ядро нейрона; тонкая стрелка - глыбка гетерохроматина; н - цитоплазма нейрона; г - я дра гл иальных клеток. Ув.: *1000. Заключение. Таким образом, при гистологических исследованиях необходимо учитывать, что в случае проведени иммунофлуоресцентного вы влени антигена, требующего длительного де-маскировани в растворе S1700 (б олее 10 мин), дл подкраски дер не следует использовать флу-орохром DAPI. В случае невозможности замены данного красителя требуется проведение корректировки pH и времени теплового демаскирования. Например, возможно применить обычный цитрат-ный буферный раствор (рН 6,0). В этом случае время температурного воздействия может быть увеличено до 30 минут без потери качества выявления ДНК с помощью DAPI. Также следует учитывать, что воздействие формалина при фиксации оказывает негативное влияние на молекулы нуклеиновых кислот, вызывая денатурацию ДНК в АТ-богатых регионах [20], что может негативно отразиться на эффективности окрашивания ядер клеток АТ-специфичным флуорохромом DAPI. В ходе насто щего исследовани установлено, что 7-AAD интенсивно окрашивает молекулы ДНК после процесса демаскировани в течение 20 мин как в цитратном буферном растворе, так и с применением раствора S1700. Выявленные в настоящей работе оптимальные условия демаскирова-ни (pH и врем нагревани ) при окраске дер с применением DAPI и 7-AAD вл ютс приемлемыми и дл иммунофлуоресцентного вы влени антигенов. Следует отметить, что неправильный выбор красителей и режима теплового демаскирования может привести к усилению фоновой флуоресценции тканей, быстрому снижению интенсивности флуоресценции красител , отделению среза от предметного стекла, деформации и разрыву ткани, а также нарушению морфологии ядер. Вы вленные в насто щей работе закономерности влияния теплового демаскирования антигена на качество окраски дер клеток флуорохромами следует учитывать при проведении многомаркерных иммуноцитохимических исследований с применением флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии.

E A Kolos

FSBSI “Institute of Experimental Medicine”

D E Korzhevskii

FSBSI “Institute of Experimental Medicine”

  1. Baker-Cairns B., Meyers K, Hamilton R., Smith C., Tornatore C. Immunohistochemical staining of fixed tissue using antigen retrieval and a thermal cycler // Biotechniques. 1996. Vol. 20, No 4. Р. 641-650.
  2. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Петрова Е.С., Карпенко М.Н., Григорьев И.П., Сухорукова Е.Г., Колос Е.А., Гиляров А.В. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии: руководство. 2-е изд., испр. и доп. / под ред. Д.Э. Коржевского. СПб.: СпецЛит, 2014. 118 с. [Korzhevskij D.Eh., Kirik O.V., Petrova E.S., Karpenko M.N., Grigor'ev I.P., Suhorukova E.G., Kolos E.A., Gilyarov A.V. Teoreticheskie osnovy i prakticheskoe primenenie metodov im-munogistohimii: rukovodstvo. 2-e izd., ispr. i dop. / pod red. D.Eh. Korzhevskogo. St. Petersburg: SpecLit, 2014. 118 р.].
  3. Shi S-R, Cote R.J., Taylor C.R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future // J. Histochem. Cytochem. 1997. Vol. 45. Р. 327-343.
  4. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Колос Е.А., Карпенко М.Н., Суфиева Д.А., Назаренкова А.В. Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. СПб.: СпецЛит, 2014. 112 с. [Korzhevskij D.Eh., Kirik O.V., Suhorukova E.G., Kolos E.A., Karpenko M.N., Sufieva D.A., Nazarenkova A.V. Molekulyarnaya morfologiya. Metody fluorescentnoj i konfokal'noj lazernoj mikroskopii. St. Petersburg: SpecLit, 2014. 112 р.].
  5. Paulsen I.M.S., Dimke H, Frische S. A single simple procedure for dewaxing, hydration and heat-induced epitope retrieval (hier) for immunohistochemistry in formalin-fixed paraffin-embedded tissue // Eur. J. Histochem. 2015. Vol. 59, No 4. Р. 2532. doi: 10.4081/ejh.2015.2532.
  6. Baschong W, Suetterlin R, Laeng R.H. Control of autofluorescence of archival formaldehyde-fixed, paraffin-embedded tissue in confocal laser scanning microscopy (CLSM) // J. Histochem. Cytochem. 2001. Vol. 49. Р. 1565-1571.
  7. Long D.J. II, Buggs C. Microwave oven-based technique for immunofluorescent staining of paraffin-embedded tissues // J. Mol. Histol. 2008. Vol. 39, No 1. Р. 1$4.
  8. Robertson D., Savage K, Reis-Filho J.S., Isacke C.M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue // BMC Cell Biol. 2008. Vol. 9, No 13. doi: 10.1186/1471- 2121-9-13.
  9. Zheng L, Schwartz C, Magidson V, Khodjakov A., Oliferenko S. The spindle pole bodies facilitate nuclear envelope division during closed mitosis in fission yeast // PLoS Biol. 2007. Vol. 5, No 7. Р. e170. doi.org/10.1371/journal.pbio.0050170.
  10. Kolthur-Seetharam U, Pradeepa M.M., Gupta N, Narayanaswamy R, Rao M.R. Spatiotemporal organization of AT- and GC-rich DNA and their association with transition proteins TP1 and TP2 in rat condensing spermatids // J. Histochem. Cytochem. 2009. Vol. 57, No 10. Р. 951-962.
  11. Maninova M, Vomastek T. Dorsal stress fibers, transverse actin arcs, and perinuclear actin fibers form an interconnected network that induces nuclear movement in polarizing fibroblasts // FEBS J. 2016. Vol. 283, No 20. Р. 3676-3693.
  12. Eidet J.R., Pasovic L, Maria R., Jackson C.J., Utheim T.P. Objective assessment of changes in nuclear morphology and cell distribution following induction of apoptosis // Diagn. Pathol. 2014. Vol. 9, No 92. doi: 10.1186/1746-1596-9-92.
  13. Тютина K.B., Скопичев В.Г., Боголюбов Д.С., Боголюбова И.О. Структурно-функциональная организация ядер секреторных клеток молочной железы у лактирующих и нелактирующих крыс // Ц и-тология. 2016. Т. 58, No 2. С. 143-149. [Tyutina K.V., Skopichev V.G., Bogolyubov D.S., Bogolyubova I.O. Strukturno-funkcional'naya organizaciya yader sekretornyh kletok molochnoj zhelezy u laktiruyushchih i nelaktiruyushchih krys. Citologiya, 2016, Vol. 58, No 2, рр. 143-149].
  14. Shi S-R, Cote R.J., Wu L, Liu C, Datar R, Shi Y., Liu D, Lim H, Taylor C.R. DNA extraction from archival formalinfixed, paraffin-embedded tissue sections based on the antigen retrieval principle: heating under the influence of pH // J. Histochem. Cytochem. 2002. Vol. 50. Р. 1005-1011.
  15. Коржевский Д.Э., Сухорукова Е.Г., Гилерович Е.Г., Петрова Е.С., Кирик О.В., Григорьев И.П. Преимущества и недостатки цинк-этанол-формальдегида как фиксатора для иммуногистохимических исследований и конфокальной лазерной микроскопии // Морфология. 2013. Т. 143, No 2. С. 81-85. [Korzhevskij D.Eh., Suhorukova E.G., Gilerovich E.G., Petrova E.S., Kirik O.V., Grigor'ev I.P. Preimushchestva i nedostatki cink-ehtanol-formal'degida kak fiksatora dlya immunogistohimicheskih issledovanij i konfokal'noj lazernoj mikroskopii, Morfologiya. 2013. Vol. 143, No 2, рр. 81-85].
  16. Dolman N.J, Kilgore J.A., Davidson MW. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, part I: BacMam labeling and reagents for vesicular structures // Curr. Protoc. Cytom. 2013. Vol. 66: Unit 12.30. doi: 10.1002/0471142956.cy1230s65.
  17. Kilgore J.A., Dolman N.J., Davidson MW. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles // Curr. Protoc. Cytom. 2013. Vol. 66. Unit 12.31. doi: 10.1002/0471142956.cy1231s66.
  18. Сырцова M.A., Колос Е.А., Снегова B.A., Гусельникова В.В. Применение различных флуорес центных красителей для окраски ядер клеток в фиксированном биологическом материале // Медицинский академический журнал. 2014. Т. 14, № 2. С. 34-39. [Syrcova M.A., Kolos E.A., Snegova V.A., Gusel'nikova VV. Primenenie razlichnyh fluorescentnyh krasitelej dlya okraski yader kletok v fiksirovannom biologicheskom materiale. Medicinskij akademicheskij zhurnal, 2014, Vol. 14, No 2, рр. 34-39].
  19. Петрова Е.С., Исаева Е.Н., Коржевский Д.Э. МСК костного мозга крысы могут дифференцироваться в жировые к летки после аллотрансплантации в поврежденный седалищный нерв // Нейронаука для медицины и психологии: сб. / под ред. Е.В. Лосевой, А.В. Крючковой, Н.А. Логиновой. М.: МАКС Пресс, 2016. C. 328-329. [Petrova E.S., Isaeva E.N., Korzhevskij D.Eh. MSK kostnogo mozga krysy mogut differencirovat'sya v zhirovye kletki posle allotransplantacii v povrezhdennyj sedalishchnyj nerv, Nejronauka dlya mediciny i psihologii: sb. / pod red. E.V. Losevoj, A.V. Kryuchkovoj, N.A. Loginovoj. Moscow: MAKS Press, 2016, рр. 328-329].
  20. Nam S.K., Im J., Kwak Y, Han N, Nam K.H., Seo A.N., Lee H.S. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic Acid preservation // Korean J. Pathol. 2014. Vol. 48, No 1. P. 36-42.

Views

Abstract - 157

PDF (Russian) - 10

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Kolos E.A., Korzhevskii D.E.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies