ACCUMULATION OF POLYGLUTAMINE PROTEINS IN NEURONS OF THE HUMAN RED NUCLEUS

Abstract


One of typical features of neurodegeneration is intranuclear accumulation of proteins containing polyglutamine sequence in their polypeptide chain. The aim of the present study was to identify such proteins, and to determine their distribution in the neurons of the red nucleus in humans not suffered from neurodegenerative diseases. Fragments of the human midbrain were used in the study (n=7). Polyglutamine sequence (poly-Q) in proteins was revealed using immunocytochemistry to monoclonal mouse antibody (clone 1C2). Analysis of the preparations revealed the presence of a weak diffuse reaction in the cell nucleus structures in most cells (both nerve and glial) of the red nucleus. In large neurons in two of the seven cases studied, the reaction of the intranuclear structures was diffuse, and in the other five cases, slightly contoured 1C2-immunopositive accumulations, always located outside of the nucleolus, were determined in the nucleus of large neurons. The obtained data suggest that the polyglutamine proteins typical for pathological structures can be accumulated in nucleus of nerve and glial cells of the red nucleus in humans without neurodegenerative pathology.

Введение. Красное ядро у человека участвует в сложных сенсомоторных и когнитивных процессах, требующих сенсорного различения и контроля исполнения [1]. Характерной чертой этого нервного центра является способность его клеток накапливать негемовое железо [2], что понижает их устойчивость к окислительному стрессу. Одним из признаков развивающегося нейродегенеративного процесса является внутриядерная концентрация белков, имеющих в составе полипептидной цепи полиглутаминную последовательность [3]. Так, накопление белков с повторяющимися полиглутаминными последовательностями наблюдается в нейронах различных областей центральной нервной системы при таких нейродегенеративных заболеваниях, как болезнь Гентингтона и некоторые формы спиноцеребеллярных атаксий [3, 4]. При этом аккумуляция белков с полиглутаминными последовательностями в одних внутриядерных структурах происходит, а в других - нет; так, например, тельца Маринеско аккумулируют дефектные белки ядра, однако пептиды с полиглутаминными последовательностями в них не отмечены [5]. Отличить патологические внутриклеточные включения, содержащие белки с повторяющимися полиглутаминными последовательностями, от обычных внутриядерных структур можно лишь при наличии данных о распределении полиглутаминных белков в нейронах изучаемой области у лиц, не страдавших нейродегенеративными заболеваниями. Такие данные в отношении красного ядра в настоящее время отсутствуют. Цель исследования: выявление белков, содержащих полиглутаминную последовательность, в нейронах красного ядра человека и определение характера их распределения в клетке. Материалы и методы исследования. В работе были использованы фрагменты среднего мозга человека (7 мужчин в возрасте от 25 лет до 61 года, причина смерти которых не была связана с заболеваниями нервной системы). Материал был получен из архива Отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины. Программа исследований имеет положительное заключение Локального этического комитета ФБГНУ «ИЭМ». Материал был фиксирован в цинк-этанол-формальдегиде [6] и залит в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5 и 10 мкм и наклеивали на предметные стекла с адгезивным покрытием (Menzel, Германия). Часть срезов окрашивали толуидиновым синим по Нисслю. Для улучшения иммунореактивности выявляемых антигенов проводили их тепловое демаскирование в модифицированном цитратном буфере pH 6,1 (S1700, Dako, Дания). Контрольные иммуногистохимические реакции проводили с учетом рекомендаций производителей реагентов. При постановке иммуногистохимической реакции были использованы первичные моноклональные мышиные антитела (клон 1С2) к полиглутаминной последовательности (poly-Q), присутствующей в составе полипептидной цепи различных белков (Millipore, США), в разведении 1:1000-1:2000. Для выявления связанных первичных антител использовали набор MACH2-Universal HRP-Polymer (Biocare Medical, США). Пероксидазную метку выявляли с использованием диаминобензидинового хромогена (DAB+; Dako, Дания). Для сравнения полиглутаминных последовательностей белков был использован алгоритм базы данных NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Результаты и их обсуждение. На фронтальных срезах среднего мозга красное ядро располагается между черным веществом и белым веществом, соответствующим таламо-оливарному пути. Исследование окрашенных по методу Ниссля препаратов показало, что в изучаемых объектах отсутствуют признаки аутолиза и нейродегенеративного процесса. Также во всех исследованных случаях при окраске по Нисслю в ядрах нейронов красного ядра какие-либо включения не определялись. Включения нейромеланина в нейронах красного ядра не определяются в отличие от рядом расположенных нейронов черного вещества. После постановки иммуноцитохимической реакции на белки, имеющие полиглутаминный фрагмент, в большинстве клеток (как нервных, так и глиальных) отмечалась слабая диффузная реакция на белки структур клеточного ядра. В крупных нейронах красного ядра, в двух из семи исследованных случаев, реакция внутриядерных структур была диффузной, а в остальных пяти случаях в ядрах крупных нейронов определялись нечетко контурирующиеся скопления иммунопозитивного материала, которые всегда располагались вне ядрышка (рисунок, а). В одном из исследованных случаев (возраст 47 лет) определялись цитоплазматические сетчатые структуры (рисунок, б), реакция части из которых была более интенсивной, чем у внутриядерных скоплений иммунопозитивного материала. Эти структуры имели форму глыбок и линейных фрагментов, переходящих из цитоплазмы перикариона в цитоплазму начальных сегментов отростков нейрона. Рисунок. Внутриядерные (а) и цитоплазматические (б) структуры нейронов красного ядра человека, содержащие белки с полиглутаминной последовательностью. Иммунопозитивные структуры ядра (а) и цитоплазмы (б) отмечены стрелками, ядрышко клетки отмечено знаком (*). Иммуноцитохимическая реакция с антителами 1С2 против полиглутаминных последовательностей белков без подкраски. Масштабный отрезок равен 10 мкм. Селекция белков по аминокислотной последовательности в протеомной базе данных, в состав которых входят фрагменты poly-Q (более 30 аминокислотных остатков глутамина), показала, что в протеоме человека идентифицировано более 15 белков, содержащих такую последовательность. В этом списке присутствуют такие распространенные белки, как атаксин 2 (ataxin 2), ТАТАбокс-связывающий протеин (TATA box binding protein), хантингтин (huntingtin) и другие. Имеется большое число работ, в которых исследовались механизмы экспансии полиглутаминных последовательностей в полипептидной цепи и аккумуляции таких аномальных белков в нейронах при полиглутаминных нейродегенеративных заболеваниях, однако сведения о функциях полиглутаминных белков в норме ограничены. Показано, что полиглутаминные тракты могут стабилизировать белок-белковые взаимодействия [7] и участвуют в активации транскрипции (именно поэтому их экспансия может нарушать транскрипцию гена, что и наблюдается, например, в случае болезни Гентингтона) [8]. Имеются данные о функциях отдельных полиглутаминных белков, например, хантингтина, который, как было установлено, в нервных клетках участвует в транспорте белков из ядра в цитоплазму, регулирует транскрипцию генов, участвует в везикулярном транспорте, в том числе в синапсах и обладает выраженным антиапоптотическим действием [9], по-видимому, за счет ингибирования процессинга про-каспазы-9 [10]. В связи с ограниченностью данных о функциях полиглутаминных белков, выяснение их внутриклеточной локализации приобретает бóльшую ценность, поскольку может способствовать выявлению неизвестных пока функций полиглутаминных белков. Полученные данные свидетельствуют, что вне зависимости от возраста человека полиглутамин-содержащие белки присутствуют в невысокой концентрации в ядрах нервных и глиальных клеток красного ядра. Этот факт не является необычным, поскольку у человека, как свидетельствует анализ протеомных баз данных (NCBI Protein BLAST), полиглутаминные участки присутствуют в аминокислотной последовательности некоторых транскрипционных факторов и белков, связанных с ядерными рецепторами. Неожиданным явился факт присутствия в крупных нейронах большинства исследованных объектов локальных скоплений полиглутаминных белков, которые более характерны для патологических структур, выявляемых в ряде нейронов при врожденных атаксиях [3]. В одном из случаев (мужчина, 47 лет) наблюдались и крупные цитоплазматические скопления полиглутаминных белков. По форме и локализации данные скопления напоминают обнаруженные нами ранее цитоплазматические скопления нейроглобина в клетках Пуркинье мозжечка крысы в виде сгруппированных гранулярных линейных и кольцевых структур, которые присутствовали наряду с перикарионом и в начальных сегментах дендритных стволов [11]. Однако нейроглобин не входит в число ранее выявленных белков в составе которых присутствует последовательность poly-Q. Ранее нами было высказано предположение, что цитоплазматическая сеть, состоящая из нейроглобина, связана с митохондриями нейронов [12]. Не исключено, что аналогичная связь с митохондриями имеется и у полиглутаминных белков нейронов красного ядра. Таким образом, в нервных клетках красного ядра человека может происходить накопление полиглутамин-содержащих белков, не ассоциированное с нейродегенеративным процессом. Вопрос о том, какие это белки, требует дальнейших исследований с использованием методов протеомного анализа.

I P Grigorev

Institute of Experimental Medicine

M A Syrtsova

Institute of Experimental Medicine

E G Sukhorukova

Institute of Experimental Medicine

O V Kirik

Institute of Experimental Medicine

O S Alekseeva

Institute of Experimental Medicine

  1. Habas C., Guillevin R., Abanou A. In vivo structural and functional imaging of the human rubral and inferior olivary nuclei: a mini-review // Cerebellum. 2010. Vol. 9, No 2. P. 167-173.
  2. Dwork A.J., Schon E.A., Herbert. J. Nonidentical distribution of transferrin and ferric iron in human brain // Neurosci. 1988. Vol. 27, No 1. P. 333-345.
  3. Uchihara T., Fujigasaki H., Koyano S. Yagishita S., Iwabuchi K. Non-expanded polyglutamine proteins in intranuclear inclusions of hereditary ataxias-triple-labeling immunofluorescence study // Acta Neuropathol. 2001. Vol. 102, No 2. P. 149-152.
  4. Blum E.S., Schwendeman A.R., Shaham S. PolyQ disease: misfiring of a developmental cell death program? // Trends Cell Biol. 2013. Vol. 23. P. 168-174.
  5. Григорьев И.П., Коржевский Д.Э. Тельца Маринеско - внутриядерные включения дофаминергических нейронов // Мед. акад. журн. 2015. Т. 15, № 2. С. 28-34 [Grigorev I.P., Korzhevskii D.E. Marinesco bodies: intranuclear inclusion-bodies of dopaminergic neurons, Med. Acad. Journal. 2015. Vol. 15. No 2. pp. 28-34].
  6. Korzhevskii D.E., Sukhorukova E.G., Gilerovich E.G., Petrova E.S., Kirik O.V., Grigor`ev I.P. Advantages and disadvantages of zinc-ethanol-formaldehyde as a fixature for immunocytochemical studies and confocal laser microscopy // Neurosci. Behav. Physiol. 2014. Vol. 44, No 5. P. 542-545.
  7. Schaefer M.H., Wanker E.E., Andrade-Navarro M.A. Evolution and function of CAG/polyglutamine repeats in protein-protein interaction networks // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, No 10. P. 4273-4287.
  8. Freiman R.N., Tjian R. Neurodegeneration. A glutamine-rich trail leads to transcription factors // Science. 2002. Vol. 296, No 5576. P. 2149-2150.
  9. Cattaneo E., Zuccato C., Tartari M. Normal huntingtin function: an alternative approach to Huntington's disease // Nat. Rev. Neurosci. 2005. Vol. 6, No 12. Р. 919-930.
  10. Rigamonti D., Sipione S., Goffredo D., Zuccato C., Fossale E., Cattaneo E. Huntingtin's neuroprotective activity occurs via inhibition of procaspase-9 processing // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. No 18. Р. 14545-14548.
  11. Korzhevskii D.E., Grigor`ev I.P., Kirik O.V., Alekseeva O.S. Neuroglobin distribution in the rat cerebellar Purkinje cells // J. Evol. Biochem. Physiol. 2015. Vol. 51, No 6. P. 517-519.
  12. Kirik O.V., Grigorev I.P., Alekseeva O.S., Korzhevskii D.E. Three-Dimensional Organization of the Cytoplasmic Neuroglobin-Immunopositive Structures in the Rat Medulla Oblongata Neurons // Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2016. Vol. 10, No 4. P. 333-337.

Views

Abstract - 50

PDF (Russian) - 4

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2017 Grigorev I.P., Syrtsova M.A., Sukhorukova E.G., Kirik O.V., Alekseeva O.S.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies