METHOD OF STUDYING OF MELATONIN RECEPTORS IN THE MUCOSA OF STOMACH AND DUODENUM

Abstract


According to current concepts, peptic ulcer disease is a polyetiological malady. No doubt that the leading role in the pathogenesis belongs to infectious factors and the stress load experienced by an organism as a whole. Besides, the severity of the disease also depends on neurogenic and genetic factors and functional peculiarities of regulating systems in organs/tissues, in which melatonin plays a role of major importance. This article is dedicated to melatonin which affects the mucous membrane of the duodenum in the way of paracrine activity, by means of activation of its receptors located in membranes and cells of enterocytes. The presence of receptors of melatonin (МТ1 and МТ2) in the mucosa of stomach and duodenum of patients suffering with ulcer disease and in the control group was evaluated by means of flow fluorocytometry method. The statistical analysis of results of the study exposed significant differences of the ratio of melatonin receptors (MT1/MT2) at patients suffering with complicated forms of the disease compared to patients of the control group.

Введение. Несмотря на снижение заболеваемости звенной болезнью за последние 12 лет вдвое, уровень смертности остается неизменным. Причинами летальных исходов остаются по-прежнему осложненные формы течения язвенной болезни, включающие перфорацию язвы и кровотечение [1]. Язвенная болезнь является полиэтиологичным заболеванием. Предложено много теорий развития язвенной болезни. Согласно современным представлени м звенна болезнь вл етс заболеванием организма в целом с нарушением регуляции обусловленной включением в процесс ЦНС [2] и местных систем [2$6], с особенной ролью инфекционного агента [7]. Развитие осложнений звенной болезни зависит от вовлеченности в патологический процесс нейроэндокринной системы, в частности мелатонина и его рецепторов [7, 8]. Мелатонин является гормоном corpus pineale. Долгое время считалось, что он вырабатывается только в эпифизе и влияет преимущественно на циркадные ритмы организма. Однако многочисленные исследования доказывают, что мелатонин вырабатывается также энтерохромаффинными клетками желудочно-кишечного тракта (ЕС-клетки). Гормон шишковидной железы влияет на работу нервной, дыхательной, иммунной, пищеварительной систем, а также оказывает антимутагенное, антиапоптотиче-ское, противоишемическое действие [3, 5, 6, 9, 10]. Эффект данного гормона реализуется через активацию рецепторов, которые у человека делятся на два типа - МТ1 и МТ2. На поверхности энтероцитов двенадцатиперстной кишки и желудка также описано наличие двух типов рецепторов [10]. В экспериментах на животных было доказано, что тяжесть проявлений искусственно вызванных язв желудка значительно повышается при введении специфического антагониста рецепторов МТ2 [11]. Данный факт указывает на то, что протек-тивное действие эндогенного мелатонина при воспалительных заболеваниях органов желудочнокишечного тракта реализуетс через активацию МТ2 рецепторов. В то же время связывание мелатонина с рецепторами МТ1 вызывает вазо-констрикцию и усиливает тя жесть воспаления [11]. В предыдущих исследованиях нами была доказана диагностическая значимость определения уровня рецепторов мелатонина на лимфоцитах крови человека при о стром панкреатите и возможность применени данной методики дл прогноза течения острого панкреатита [12-19]. Целью нашего исследования явилась разработка методики определени соотношени рецепторов мелатонина с дальнейшей оценкой прогностического значения результатов для пациентов с различным течением язвенной болезни (ЯБ). Материалы и методы исследования. О бследова-ны 40 пациентов. В зависимости от тяжести течения ЯБ сформированы 4 группы. В первую, контрольную, вошли 8 пациентов, не имеющие признаков пилородуоденальной звы. Во вторую - 16 пациентов с неосложненным течением ЯБ. Третья группа формировалась из больных ЯБ с кровотечением в анамнезе, и составила 9 человек. У 7 пациентов пилородуоденальная язва осложнилась перфорацией, что позволило объединить их в четвертую группу. Всем была выполнена гастродуоденоскопи с биопсией слизистой оболочки. Биопсийный материал транспортировалс в иммунологическую лабораторию при температуре $7 0°С. Дл получени антител к рецепторам мелатонина в ГНЦ НИИ «Особо Чистых Биопрепаратов» (Санкт-Петербург) твердофазным методом были синтезированы пептиды, соответствующие уникальным фрагментам аминокислотных последовательностей (не гомологичные другим белкам человека) рецепторов МТ1 и МТ2. Затем в ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» путцм иммунизации лабораторных кроликов конъюгатом гемоцианина и синтетических пептидов получены первичные специфические антитела против рецепторов МТ1 и МТ2, которые использовались дл иммунофлюоресценции [14]. Биоптаты измельчались, после добавления буферного раствора проводилась фильтация, центрифугирование. Осадок клеток был распределен на две пробирки. В первую были добавлены антитела к МТ1, а во вторую - к МТ2. Инкубация образцов проводилась в темноте при температуре +4°С. в течение 12 часов. После центрифугирования с последующей отмывкой производили окрашивание клеток коммерческими моноклональными антителами с флюоресцентными метками (goat antirabbit FITC Ig G+M производства Becton Dickinson). Готовые пробы анализировали на проточном цитометре EPICS XL/MCL/Beckman Coulter/ с использованием программы System II. При прохождении меченной флюоресцентной меткой клетки через детектор регистрировали клеточное событие. Результатом вл лось количество клеточных событий, зарегистрированных цитометром при анализе образца. При статистической обработке использовался критерий Манна-Уитни, поскольку все выборки, за исключением одной, не соответствовали закону нормального распределени . Описательна статистика дл нормальной выборки приводилась в виде среднее (стандартное отклонение), для негауссовских выборок - медиана (25-й процентиль - 75-й процентиль). Различи признавались статистически значимыми, если значение р было меньше 0,05. Результаты исследования. О пределенный нами уровень рецепторов МТ1 и МТ2 отличалс у всех пациентов. Уровень МТ1 у пациентов всех групп, включа контрольную, был статистически значимо выше уровн МТ2. В трех исследуемых группах отмечено статистически значимое снижение уровня и МТ1, и МТ2 по сравнению с контрольной группой. Группа р-Значение критерия Манна-Уитни контрольная группа язва,осложненная перфора цией язва , осложненная кровотечением Группа с неосложненной язвой 0,444 0,00831 0,000148 Контрольная группа 0,00146 0,000636 Язва, осложненная перфорацией 0,005921 В нашей работе мы использовали антитела * рецепторам мелатонина, полученные по оригинальной технологии, а также коммерческие моноклональные антитела, поэтому для стандартизации и унификации оценку результатов производили по среднему соотношению полученных показателей. Данный коэффициент отражает соотношение активных МТ1 и МТ2 рецепторов на поверхности энтероцитов и не зависит от метода определени их количества. При статистической обработке полученных данных мы обнаружили, что распределение соотношения МТ1/МТ2 в группе с язвой осложненной перфорацией является нормальным, а в остальных трех группах нормальным не является. Это позволило нам применить различные статистические методы. Дл определени чувствительности и специфичности нашего метода объединили группу с неосложненной язвой и контрольную группу противопоставив их группе с осложнениями. ROC-анализ (AUC=0,947) (рисунок) показал, что точкой отсечения является значение МТ1/МТ2=3,5. При этом на нашем наборе пациентов чувствительность к выявлению осложненной язвы 100%, специфичность 87,5%. Таким образом, показатель соотношения МТ1/МТ2 >3,5 говорит о возможности развития у данного пациента осложнений в виде перфорации или кровотечения. Рисунок. ROC -крива с точкой максимальной диагностической эффективности. Значение МТ1/МТ2 в группе с язвой, осложненной кровотечением, 5,39 (4,67; 6,24), статистически значимо больше соответствующего значения в группе с неосложеннной язвой 1,40 (1,17; 2,33), p=0,0001. Значение МТ1/МТ2 в группе с язвой, осложненной перфорацией, 4,00 (0,44), статистически значимо больше соответствующего значени в группе с неосложненной язвой 1,40 (1,17; 2,33), p=0,001. Все межгрупповые сравнения, за исключением контроля с неосложненной язвой, статистически значимы, в том числе с учетом поправки Бонфер-рони (таблица). Таблица Значения р U-критерия Манна-Уитни при попарном межгрупповом сравнении МТ1/МТ2 Заключение. Применение в данном исследовании проточной флюороцитометрии с использованием антител позвол ет определить количество активных рецепторов МТ1 и МТ2 в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки. Отличия уровня рецепторов к мелатонину у пациентов разных групп позволяют сделать предположение об участии мелатонина и его рецепторов МТ1 и МТ2 в патогенезе язвенной болезни и тяжести ее проя влений. Уровень МТ1/МТ2 >3,5 говорит о высоком риске осложнений.

Z Kh Osmanov

Pavlov First St. Petersburg State Medical University

D Yu Semenov

Pavlov First St. Petersburg State Medical University

A P Bogdanov

Pavlov First St. Petersburg State Medical University

L E Koloscova

OOO «MedLabSpb»

M Ig Zaytseva

Pavlov First St. Petersburg State Medical University

A V Sokolov

Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State University

V B Vasilyev

Institute of Experimental Medicine; St. Petersburg State University

  1. Ширинская Н.В. Язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки в Российской Федерации. Заболеваемость и смертность // Дальневосточный медицинский журнал. 2016. № 3. С. 105-109. [Shirinskaya N.V. Stomach and duodenum peptic ulcer of Russian Federation. Mortality and incidence, Dalnevostochny medical journal. 2016. N 3. P. 105-109.]
  2. Колотилова М.Л., Иванов Л.И. Нейрогенно-генетическая теория этиологии и патогенеза язвенной болезни // Вестник Российской академии медицинских наук. 2014. № 7-8. C. 10-16. [Kolotilova M.L., Ivanov L.N., Neurosis and Genetic Theory of Etiology and Pathogenesis of Ulcer Disease, Annals of the Russian academy of medical sciences. 2014. N 7-8. P. 10-16.]
  3. Мендель В.Э., Мендель О.И. Мелатонин: роль в организме и терапевтические возможности. Опыт применения препарата Мелаксен в российской медицинской практике // Российский медицинский журнал. 2010. Т. 18, № 6. С. 336-341. [Mendel V.A., Mendel O.I. Melatonin: role in the body and therapeutic. The experience of the drug Melaxen in the Russian medical practice, Russian medical journal. 2010. Vol. 18, N 6. P. 336-341.]
  4. Комаров Ф.И. Рапопорт С.И., Малиновская Н.К., Вознесенская Л.А., Веттерберг Л. Мелатонин: язвенная болезнь и сезоны // Клин. мед. 2003. Т. 81, № 9. C. 17-21. [Komarov F.I., Rapoport S.I., Malinovskaya N.K. Voznesenskaya L.A., Vetterberg L. Melatonin: ulcer disease and seasons of year, Klin. med. 2003. Vol. 81, N 9. P. 17-21.]
  5. Малиновская Н.К., Комаров Ф.И., Рапопорт С.И., Рахлин Н.Т., Кветной И.М., Лакшин А.А., Вознесенская Л.А., Расулов М.И. Мелатонин в лечении язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // Клин. мед. 2006. Т. 84, № 1. С. 5-11 [Malinovskaya N.K., Komarov F.I., Rapoport S.I., Raykhin N.T., Kvetnoy I.M., Lakshin A.A., Voznesenskaya L.A., Rasulov M.I. Melatonin in treatment of duodenal ulcer, Klin. med. 2006. Vol. 84, N 1. P. 5-11.]
  6. Малиновская Н.К., Рапопорт С.И. Роль мелатонина в регуляции функций желудочно-кишечного тракта // Клин. мед. 1999. Т. 77, № 8. С. 4-7. [Malinovskaya N.K., Rapoport S.I. The role of melatonin in the regulation of the gastrointestinal tract, Klin. med. 1999. Vol. 77, N 8. P. 4-7.]
  7. Осадчук А.М., Осадчук М.А., Исламова Е.А., Кветной И.М. Роль диффузной эндокринной системы и клеточного гомеостаза эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в возникновении и течении язвенной болезни двенадцатиперстной кишки // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2009. Т. 19, № 4. С. 19-34. [Osadchuk A.M., Osadchuk M.A., Islamova Ye.A., Kvetnoy I.M. Role of diffuse endocrine system and cellular homeostasis of epithelial cells of the stomach mucosa in development and progression of peptic ulcer of the duodenum, Russian journal оf Gastroenterology, Hepatology, Coloproctology. 2009. Vol. 19, N 4. P. 19-34.]
  8. Циммерман Я.С. Язвенная болезнь: Актуальные проблемы этиологии, патогенеза, дифференцированного лечения // Клиническая медицина. 2012. № 8. C. 11-18. [Tsimmerman Ya.S. Ulcer disease: challenging problems of etiology, pathogenesis, differential treatment, Klin. med. 2012. N 8. P. 11-18.]
  9. Jaworek J., Brzozowski T., Konturek S.J. Melatonin as an organoprotector in the stomach and the pancreas // J. Pineal Res. 2005. Vol. 38, N 2. P. 73-83.
  10. Нестерова М.В. Мелатонин - адаптоген с мультимодальными возможностями // Медицинский совет. 2015. № 18. C. 50-53. [Melatonin is an adaptogen with multimodal action, Medicinskii sovet. 2015. N 18. P. 50-53.]
  11. Малиновская Н.К., Рапопорт С.И., Жернакова Н.И., Рыбникова С.Н. Антихеликобактерные эффекты мелатонина // Клин. мед. 2007. Т. 85, № 3. С. 40-43. [Malinovskaya N.K., Rapoport S.I. Anti Helicobacter pylori effects of melatonin, Klin. med. 2007. Vol. 85, N 3. P. 40-43.]
  12. Cevik H., Erkanli G., Ercan F. et al. Exposure to continuous darkness ameliorates gastric and colonic inflammation in the rat: both receptor and non-receptor-mediated processes // J. Gastroenterol. Hepatol. 2005. Vol. 20. Р. 294-303.
  13. Семенов Д.Ю., Тоноян А.Г., Степнов И.А., Шапкина Л.Г., Васильев В.Б., Соколов А.В, Зуева Е.Е., Горчакова М.В., Резван Т.А. Клинико-экспериментальное обоснование возможности определения рецепторов мелатонина в мононуклеарных клетках крови человека // Клиническая и лабораторная диагностика. 2009. № 1. C. 18-20. [Semenov D.Yu., Tonoyan A.G., Stepnov I.A., Shapkina L.G., Sokolov A.V., Zuyeva Ye.Ye., Gorchakova M.V., Rezvan T.A. Determination of melatonin receptors in human blood mononuclear cells: Clinical and experimental rationale, Klinicheskaya I laboratornaya diagnostika. 2009. N 1. P. 18-20.]
  14. Шапкина Л.Г., Семенов Д.Ю., Османов З.Х. Связь экспрессии рецепторов мелатонина с тяжестью острого панкреатита // Анналы хирургической гепатологии. 2014. Т. 19, № 2. С. 79-82 [Shapkina L.G., Semenov D.Yu., Osmanov Z.Kh. Correlation between Melatonin Receptor Expression and Severity of Acute Pancreatitis, Annals of Surgical Hepatology. 2014. Vol. 19, N 2. P. 79-82.]
  15. Семёнов Д.Ю., Османов З.Х., Тоноян А.Г., Шапкина Л.Г., Соколов А.В., Горчакова М.В. Результаты динамической оценки экспрессии рецепторов мелатонина в лимфоцитах крови у пациентов с острым панкреатитом нетяжелого и тяжелого течения // Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2014. Т. 173, № 1 С. 044-046. [Semenov D.Yu., Osmanov Z.Kh., Tonoyan A.G., Shapkina L.G., Sokolov A.V., Gorchakova M.V. Results of dynamic assessment of melatonin receptor expression in limphocytes in acute mild and severe pancreatitis, Vestnik khirurgii imeni I.I. Grekova. 2014. Vol. 173, N 1. Р. 044-046.]
  16. Семёнов Д.Ю., Васильев В.Б., Зуева Е.Е., Тоноян А.Г., Шапкина Л.Г., Горчакова М.В., Соколов А.В. Исследование экспрессии рецепторов мелатонина в лимфоцитах и клетках поджелудочной железы в условиях экспериментального острого панкреатита // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. 2012. Т. XIX, № 4. С. 50-52. [Semenov D.Yu., Vasiliev V.B., Zueva E.E., Tonoyan A.G., Shapkina L.G., Gorchakova M.V., Sokolov A.V. Expression of melatonin receptors on lymphocytes and pancreas cells during experimental (model) acute pancreatitis, The Scientific Notes of the I.P. Pavlov St. Petersburg State Medical University. 2012. Vol. XIX, N 4. P. 50-52.]
  17. Семёнов Д.Ю., Тоноян А.Г., Стенов И.А., Горчакова М.В., Шапкина Л.Г. Значение мелатонина и его рецепторов в патогенезе острого панкреатита // Вестник хирургии имени И.И. Грекова. 2009. Т. 168, № 3. С. 107-110. [Semenov D.Yu., Tonoyan A.G., Stepnov I.A., Gorchakova M.V., Shapkina L.G. The role of melatonin and its receptors in the pathogenesis of acute pancreatitis, Vestnik khirurgii imeni I.I. Grekova. 2009. Vol. 168, N 3. P. 107-110.]
  18. Тоноян А.Г., Степнов И.А., Шапкина Л.Г. Новый фактор прогноза тяжести острого панкреатита. // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. 2009. Т. XVI, № 3. С. 43-44. [Tonoyan A.G., Stepnov I.A., Shapkina L.G. A new factor of acute pancreatitis severity prognosis, The Scientific Notes of the I.P. Pavlov St. Petersburg State Medical University. 2009. Vol. XVI, N 3. P. 43-44.]
  19. Тоноян А.Г., Степнов И.А., Шапкина Л.Г., Волчков Г.В., Гриценко Д.Н. Разработка нового критерии прогноза тяжести острого панкреатита // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. 2009. Т. XVI, № 4. С. 87 [Tonoyan A.G., Stepnov I.A., Shapkina L.G., Volchkov G.V., Gricenko D.N. Development of new criteria for prediction of severity of acute pancreatitis, The Scientific Notes of the I.P. Pavlov St. Petersburg State Medical University. 2009. Vol. XVI, N 4. P. 87.]

Views

Abstract - 40

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2017 Osmanov Z.K., Semenov D.Y., Bogdanov A.P., Koloscova L.E., Zaytseva M.I., Sokolov A.V., Vasilyev V.B.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies