BIOLOGICAL FUNCTIONS OF BACTERIAL METABOLOME AND TISSUE CULTURES

Abstract



Введение. В процессе жизнедеятельности бактерии, населяющие макроорганизм, а также те, которые попадают в него извне, выделя ют в окружающую среду различные низкомолекулярные метаболиты. До недавнего времени предполагалось, что выделение низкомолекулярных метаболитов является следствием их перепроизводства клетками. Однако в последние годы возрастает количество публикаций о многообразии биологических функций, которые вы-полн ют метаболиты в бактериальных сообществах, например подавление/активация экспрессии генов патогенности, повышение антагонистической активности, образование биопленок; а также во взаимодействии микробиота-макроорганизм; метаболиты являются источником питания клеток кишечного эпители , участвуют в развитии сердечно-сосудистых заболеваний и метаболического синдрома [1-4]. Цель исследования. С помощью методов высокоэффективной жидкостной хроматогра фии (ВЭЖХ), газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС) - проанализировать состав низкомолекулярных метаболитов, выделяемых в среду пробиотическими культурами и условно-патогенными штаммами, а также эукариотической культурой клеток яичников китайского хомячка, и исследовать действие найденных метаболитов на пролиферативную активность клеток в органотипических культурах тканей крыс. Материалы и методы. В работе использовали пробиотические штаммы бактерий: Escherichia coli M-17, Bifidobacterium bifidum 1, Lactobacillus plantarum 8P-A3; условно-патогенные: E. coli О75, E. coli №14, Salmonella enteritidis var. Issatchenko, и штамм E. coli VL613, примен ющийс в сельском хозяйстве для повышения привеса у поросят. Культуры энтеробактерий выращивали на среде М-9 в колбах на качалке. Культивирование L. plantarum осуществляли на среде Блаурокка и на среде МРС-1, B. bifidum 1 - на среде МРС-1. В экспериментах использовали три модельные культуры клеток яичников к итайского хомячка (СНО). Линии клеток были получены на основе родительской линии СНО-К1, линия 1 - продуцент моноклональных антител, линии 2 и 3 - продуценты гликопротеионов. Суспензионные культуры клеток СНО выращивали в бессывороточной среде в колбах Эрленмейера и биореакторе Celligen BLU New Brunswick («Eppendorf», Германия) в течение 7 сут. Анализ состава карбоновых кислот проводили методом ВЭЖХ на колонке Supelcogel H (Sigma-Aldrich). Для анализа аминокислот использовали метод ВЭЖХ их дабсильных производных на колонке Luna 5u C18(2) (Phenomenex). осуществляли на приборе GCMS-QP2010 Plus на колонке Ultra-2. Биологическую активность метаболитов определяли по способности влиять на пролиферацию органотипических культур тканей (селезенки, печени, поджелудочной железы, почек) крыс линии В истар в концентрации 0,05 нг/мл. Для инкубации эксплантатов использовали культуральную среду следующего состава: 35% - раствор Хенкса, 35% - среда «Игла», 25% - сыворотка крови плодов коровы с добавлением глюкозы (60 мг%), инсулина (0,5 ед/мл), гентамицина (100 ед/мл) (pH 7,2). Эксплантаты в чашках Петри культивировали в CO2 -инкубаторе при 36,8 °С. Рост эксплантатов ткани в органотипической культуре исследовали прижизненно с помощью фазово-контрастного микроскопа через 3 сут после начала культивировани . Дл визуализации эксплантатов использовали микротеленасадку дл микроскопа (серия 10, МТН-13, Россия). Количественную оценку роста эксплантатов осуществл ли с помощью пакета программ PhotoM 1.2. Результаты и их обсуждение. Все штаммы E. coli выделяли уксусную и муравьиную кислоты, E. coli M-17, E. coli № 14 и E. coli О75 выдел ли молочную кислоту и E. coli VL 613 - нтарную. С помощью ВЭЖХ во внеклеточной среде энтеробактерий было идентифицировано 17 аминокислот. Отличительной чертой пробиотического штамма E. coli М-17 вл лось выделение в среду метионина, а также повышенное выделение глицина, аланина, валина, цистеина и тирозина. Условнопатогенный штамм E.coli О75 выделял наибольшее количество гистидина, лизина и треонина, а кон-центраци серина дл него была минимальной. Дл штамма №14 было характерно повышенное выделение глутаминовой кислоты, остальных аминокислот он выделял меньше других бактерий. ГХ-МС анализ среды позволил идентифицировать более 20 соединений, например, глутаровую, валериановую, окси-3-метилвалериановую и гликолевую кислоты, в-аланин, 4-оксибензойную, 2-изопропиляблочную и цитрамалевую кислоты. В результате ВЭЖХ анализа пула карбоновых кислот (КК) B. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3 были идентифицированы уксусная, молочная и лимонная кислоты. Концен-траци КК во внеклеточной среде была выше, чем у энтеробактерий, в 10-80 раз. Все три линии клеток СНО выделяли в среду молочную, нтарную и муравьиную кислоты, их количество различалось для каждой линии. Линии СНО выдел ли как заменимые, так и незаменимые аминокислоты: аланин, гл ицин, аргинин, треонин, аспарагиновую кислоту, глуминовую кислоту, метионин, про-лин, триптофан, гидроксипролин, серин, изолейцин, валин, фенилаланин и лейцин. 1- лини выдел ла молочную, янтарную кислоты; 2-я линия - только молочную кислоту; 3-я линия - молочную и янтарную. С помощью ГХ-МС в наибольших количествах в среде были обнаружены пироглутаминовая кислота (1,28 мМ), яблочная кислота (0,78 мМ), 5-оксииндол-3-пропионовая кислота (0,49 мМ), аминомалоновая кислота (0,45 мМ), треоновая кислота (0,38 мМ), 2-оксиизовалериановая кислота (0,37 мМ). Обнаруженные метаболиты по-разному действовали на пролиферативную активность органотипи- О ч о ческих культур тканей. Стимулирующим действием на все ткани обладала глутаровая кислота; изова-лерианова , пропионова и нтарна стимулировали пролиферацию только тканей селезенки и печени, не влияя при этом на культуры почки и поджелудочной железы. Капроновая кислота, одна из карбоновых кислот, производимых симбиотической микробиотой человека (например, Megasphaera sp. [5]), достоверно стимулировала развитие эксплантатов селезенки, но ингибировала пролиферацию клеток печени. Гаммааминомасляная и валериановая кислоты стимулировали пролиферацию селезенки и печени, не вли ли на клетки ткани почки, но значительно ингибировали пролиферацию поджелудочной железы. Достоверное положительное действие на эту ткань оказывали только масляная кислота. 2-Оксиизовалерианова кислота, обнаруженная в большом количестве в среде культивирования клеток СНО, ингибировала культуры селезенки, оказывала отрицательное, хот и статистически недостоверное, действие на культуру поджелудочной железы. Ее изомер, 2-окси-2-метилмасляная (2-окси-2-метилбутановая) кислота, при этом не про вила какой-либо статистически значимой активности. Последняя оказалась единственным веществом среди алифатических соединений, у которого не было обнаружено какой-либо биологической активности. 2-Кетомасляная кислота, так же как и 2-оксиизовалерианова , ингибировала пролиферацию клеток селезенки и поджелудочной железы. Заключение. Исследуемые в данной работе микроорганизмы выделяли в среду культивирования различные низкомолекулярные карбоновые кислоты, аминокислоты, спирты. Их состав был штаммоспецифическим. Аналогично прокариотическим микроорганизмам, эукариотические культуры в процессе роста выделяли схожий спектр метаболитов. Анализ биологической активности идентифицированных метаболитов показал, что практически все метаболиты микроорганизмов и модельных эукариотических культур способны вли ть на пролиферативную активность клеток той или иной ткани.

Ye V Demyanova

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations of the Federal Medico-Biological Agency of Russia

A S Morugina

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations of the Federal Medico-Biological Agency of Russia

A F Vinogradova

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations of the Federal Medico-Biological Agency of Russia

N I Chalisova

Institute of Physiology in the name of I.P. Pavlov of the Russian Academy of Sciences

H Ya Vakhitov

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations of the Federal Medico-Biological Agency of Russia

  1. Ситкин С.И., Ткаченко Е.И., Вахитов Т.Я. Филометаболическое ядро микробиоты кишечника // Альманах клинической медицины. 2015. № 40. С. 12-34. [Sitkin S.I., Tkachenko E.I., Vakhitov T.Ya. Filometabolic core of intestinal microbiota // Almanac of Clinical Medicine. 2015. N 40. Р. 12-34].
  2. De Vadder F., Kovatcheva-Datchary P., Goncalves D., Vinera J., Zitoun C., Duchampt A., Backhed F., Mithieux G. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits // Cell. 2014. Vol. 156, N 1-2. Р. 84-96.
  3. Wieland A., Frank D.N., Harnke B., Bambha K. Systematic review: microbial dysbiosis and nonalcoholic fatty liver disease // Aliment. Pharmacol. Ther. 2015. Vol. 24. Р. 1051-1063.
  4. Kasubuchi M., Hasegawa S., Hiramatsu T., Ichimura A., Kimura I. Dietary gut microbial metabolites, short-chain fatty acids, and host metabolic regulation // Nutrients. 2015. Vol. 7, N 4. Р. 2839-2849.
  5. Jeon B.S., Choi O., Um Y., Sang B.I. Production of medium-chain carboxylic acids by Megasphaera sp. MH with supplemental electron acceptors // Biotechnol. Biofuels. 2016. Vol. 9. doi: 10.1186/s13068-016-0549-3.

Views

Abstract - 54

PDF (Russian) - 2

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2017 Demyanova Y.V., Morugina A.S., Vinogradova A.F., Chalisova N.I., Vakhitov H.Y.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies