THE NEW GENERATION OF PROBIOTICS

Abstract



На рынке имеется огромное количество продуктов функционального питания, фармпрепаратов, предназначенных для восстановления нарушенного биоценоза кишечника и содержащих живые полезные микроорганизмы - пробиотики. Пробиотики получают с помощью культивирования на питательных средах, методом, разработанным микробиологами еще в XIX веке. Однако в последние годы установлено, что бактерии, выросшие естественным образом в природе, в значительной мере отличаютс по свойствам от культур, полученных в «классических» лабораторных условиях. В природе бактерии растут, образуя биопленку. Биопленка - это резистентное к химическим и биологическим факторам сообщество микроорганизмов, формирующеес на поверхности объектов внешней среды и тканей живых организмов, состоящее из микробных клеток и межклеточного слизистого матрикса. Предполагают, что биопленка вл етс единым многоклеточным организмом со свойственным ему циклом развития. Научные исследования в мире в основном посв щены биопленкам патогенных бактерий, поскольку они участвуют в развитии инфекционной патологии человека и животных. Учитывая, что полезные для здоровья человека микроорганизмы в природе также растут в виде биопленки, нами была предпринята попытка получить in vitro биопленку пробиотического штамма Lactobacillus plantarum 8-РА-3 и оценить возможность ее использования для восстановления нарушенной антибиотиками нормальной лактофлоры кишечника у мышей [1]. В литературе описано немало способов получения биопленок, однако все они малопроизводительны и технологически неэффективны. Нами впервые была использована с этой целью технология твердофазного культивирования. При культивировании L. plantarum 8-РА-3 на твердой фазе - пшеничных отруб х, пропитанных средой МРС, через 48 часов наблюдалось образование биопленки. Высушивание биопленки на воздухе приводило к уменьшению вы-севаемости бактерий с 109 КОЕ/г до менее чем 104 КОЕ/г. Однако флюоресцентная микроскопия препаратов из высушенной биопленки, окрашенных с помощью Live/Dead Kit, показала, что более 40% некультивируемых бактерий были метаболически активными, то есть, жизнеспособными. В результате содержания мышей на рационе с введением в комбикорм сухой массы отрубей с биопленкой L. plantarum в количестве 0,05%, отмечалось быстрое восстановление в толстой кишке животных нормального уровн лактобацилл, ингибированного интрага-стральным введением антибиотика амикацина. Спу-ст 5 дней после окончани скармливани биопленки пробиотика, из фекалий мышей был выделен штамм, генетически идентичный штамму L. plantarum 8-РА-3. Полученные данные свидетельствуют о том, что этот штамм, при выращивании его в виде биопленки на отруб х и последующем высушивании биомассы, переходит в некультивируемое состояние, но не теряет при этом жизнеспособности и биологической активности. Некультивируемые (покоящиеся) формы в биопленке L. plantarum могут эффективно преодолевать желудочно-кишечный барьер, а затем восстанавливать культивируе-мость и другие биологические функции, способству нормализации резидентной микрофлоры, нарушенной под вли нием антибиотиков. Механизмы этого феномена не сны, и их предстоит в дальнейшем изучать. Тем не менее результаты наших исследований свидетельствуют о перспективности исполь-зовани биопленок дл создани пробиотических препаратов и продуктов функционального питани нового поколени . Немалый интерес представляет вопрос о безопасности применени бактерий в виде биопленки. В пользу отсутствия негативного влияния биопленки пробиотика на здоровье свидетельствуют несколько фактов. Во-первых, вся резидентная микробиота человека и животных представляет собой биопленку. Во-вторых, выращивание биопленки лактобацилл на поверхности клеток HeLa не приводит к нарушению жизнедеятельности этих клеток [2]. В-третьих, традиционное японское блюдо Natto (в Мьянме оно носит название Pepoke, в Корее - Chungkukjang и Doenjang, в Китае - Sufu или Furu, в Таиланде - Thua nao), то есть соевые бобы, ферментированные бациллами, которое жители Ю го-Восточной Азии употребляют в пищу на протяжении сотен лет, содержит, согласно нашим собственным данным, культуру ферментирующих бактерий в виде биопленки. В-четвертых, наши исследования на животных (мыши, собаки, птицы, рыбы) и люд х-добровольцах показывают, что бактерии, выращенные в виде биопленки, не только не оказывают вредного воздействи на здоровье, но и в значительной степени укрепл ют его. Исследования ми последних лет установлено [3], что биопленка лактобацилл обладает значительно более выраженными пробиотическими (антимикробными, иммуномодулирующими, противовоспалительными) свойствами, чем их планктонна форма. Olsen и соавт. (2016) наглядно продемонстрировали преимущества биопленки пробиотика при лечении некротизирующего энтероколита. Это заболевание является основной причиной смертности у недоношенных новорожденных. Главной причиной его раз-вити считают нарушение микробиоты кишечника вследствие длительного пребывани недоношенных младенцев в стационаре, антибиотикотерапии и т.д. Авторы показали [4], что биопленка лактобацилл, сформированна на поверхности частиц сефадек-са G-25, значительно превосходила планктонную форму по способности выживать в кислой среде желудка, колонизовать слизистую оболочку кишечника и снижать проницаемость кишечной стенки. При этом даже однократного применения биопленки пробиотика было достаточно, чтобы защитить новорожденных крыс от развития экспериментального некротизирующего энтероколита или его осложнений. Планктонная форма пробиотика была значительно менее эффективной. Особое внимание привлекают работы по изучению механизмов действия пробиотиков, поскольку они могут способствовать повышению эффективности использования полезных бактерий в клинике. Недавно исследователи из Калифорнийского университета [5] опубликовали статью о том, что бактерии, которые часто рассматриваютс как примитивные одноклеточные существа, в состоянии биопленки представляют собой достаточно сложную многоклеточную систему, способную к саморегул ции с помощью электрохимических импульсов, наподобие тех, которые возникают в мозге человека. Dr. Suel, возглавл вший этот исследовательский проект, сказал: «В основе всех наших чувств, поведения и интеллекта лежат электрические сигналы в мозге, опосредованные ионными каналами. Мы обнаружили, что бактерии используют аналогичный способ связи и передачи информации на значительные, по сравнению с размером микробной клетки, расстояния. Большая часть нашего понимани механизмов передачи сигнала в мозге основана на структурных исследовани х бактериальных ионных каналов, но то, как сами бактерии используют эти ионные каналы, оставалось загадкой, пока мы не предприн ли попыток изучить передачу сигнала в микробных сообществах - биопленках, состоящих из миллионов плотно упакованных бактериальных клеток». Интерес ученых к изучению этих сигналов вырос из предыдущего исследования [6], которое показало, что биопленки способны разрешать социальные конфликты в бактериальном сообществе. Когда биопленка Bacillus subtilis разрасталась, голодающие клетки, расположенные в ее сердцевине и н е имевшие прямого доступа к питательному субстрату, посылали сигналы периферическим клеткам. Последние прекращали свой рост дл того, чтобы обеспечить поступление питательных веществ в центральную часть биопленки. Показано, что данный сигнал был ничем иным, как электрохимическим импульсом, опосредованным ионами кали , выдел вшимис из клетки через ионные каналы и приводившими к депол ризации мембраны соседней клетки. То есть передача сигнала в микробной биопленке происходила при помощи механизма, свойственного нервной ткани и определяющего распространение импульса вдоль аксона. Авторы также обнаружили [7], что упомянутые выше электрические сигналы не только координировали поведение составляющих биопленку B. subtilis клеток, но и были способны распростран тьс за ее пределы, измен мембранный потенциал бактерий другого вида - Pseudomonas aeruginosa, находившихся за пределами биопленки, и влиять на направление их движе-ни . Псевдомонады подчин лись импульсам, которые генерировались биопленкой B. subtilis, и двигались в ее направлении, встраива сь в биопленку. Нами проведено исследование, которое указывает на возможность существования в многоклеточных микробных сообществах иного способа передачи сигнала, - такого же, как между аксонами нервных клеток [8]. Штамм Corynebacterium diphtheriae культивировали на мембране Millipore 0,45 мкм в проточной системе. При этом все метаболиты бактерий, в том числе регуляторные молекулы, запускающие процесс размножения микробной популяции, удалялись с током жидкости, и бактерии постоянно находились в свежей питательной среде. Вопреки ожиданиям, в таких условиях культура продолжала размножаться. Дел щиес клетки значительно увеличивались в размерах и между ними образовывались многочисленные контакты-перемычки. В результате формировалась сетевидная структура, напоминающая синцитий (рисунок). По-видимому, в отсутствие внеклеточных регуляторных молекул включается альтернативный механизм коммуникации, при котором жизнедеятельность развивающейся культуры регулируется, в основном, через межклеточные контакты. В основе этого явления может лежать неизвестный прежде у бактерий способ передачи импульса, аналогичный синаптическому - c помощью молекул-нейромедиаторов. a б Рисунок. Культура C. diphtheriae: a - выращенная на мембране; б - выращенная в обычных условиях Таким образом, биопленки имеют неоспоримые преимущества перед широко распространенными «планктонными» препаратами пробиотиков. Биопленки пробиотиков безвредны, устойчивы к факторам внешней среды, эффективно колонизуют слизистые оболочки, успешно конкурируют с патогенами, взаимодействуют с иммунокомпетентными клетками и, возможно, с периферической нервной системой макроорганизма. Междисциплинарные исследования на стыке молекул рной микробиологии и нейробиологии позволят раскрыть важные механизмы влияния биопленок пробиотиков на макроорганизм и vice versa.

V G Melnikov

Moscow Research Institute of Epidemiology and Microbiology in the name of G.N. Gabrichevsky

  1. Ushakova N., Abramov V., Khlebnikov V., Semenov A., Kuznetsov B., Kozlova A., Nifatov A., Sakulin V., Kosarev I., Vasilenko R., Sukhacheva M., Melnikov V. Properties of the Probiotic Strain Lactobacillus plantarum 8-RA-3 Grown in a Biofilm by Solid Substrate Cultivation Method // Probiotics Antimicrob Proteins. 2012. Vol. 4, N 3. P. 180-186.
  2. Abramov V., Khlebnikov V., Kosarev I., Bairamova G., Vasilenko R., Suzina N., Machulin A., Sakulin V., Kulikova N., Vasilenko N., Karlyshev A., Uversky V., Chikindas M., Melnikov V. Probiotic Properties of Lactobacillus crispatus 2029: Homeostatic Interaction with Cervicovaginal Epithelial Cells and Antagonistic Activity to Genitourinary Pathogens // Probiotics Antimicrob Proteins. 2014. Vol. 6, N 3-4. P. 165-176.
  3. Aoudia N., Rieu A., Briandet R., Deschamps J., Chluba J., Jego G., Garrido C., Guzzo J. Biofilms of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum: Effect on stress responses, antagonistic effects on pathogen growth and immunomodulatory properties // Food Microbiol. 2016. Vol. 53. Pt A. P. 51-59.
  4. Olson J., Rager T., Navarro J., Mashburn-Warren L., Goodman S., Besner G. Harvesting the benefits of biofilms: A novel probiotic delivery system for the prevention of necrotizing enterocolitis // J. Pediatr. Surg. 2016. Vol. 51, N 6. P. 936-941.
  5. Prindle A., Liu J., Asally M., Ly S., Garcia-Ojalvo J., Suel G.M. Ion channels enable electrical communication in bacterial communities // Nature. 2015. Vol. 527. P. 59-63.
  6. Liu J., Prindle A., Humphries J., Gabalda-Sagarra M., Asally M., Lee D.Y., Ly S., Garcia-Ojalvo J., Suel G.M. Metabolic co-dependence gives rise to collective oscillations within biofilms // Nature. 2015. Vol. 523, N 7562. P. 550-554.
  7. Humphries J., Xiong L., Liu J., Prindle A., Yuan F., Arjes H.A., Tsimring L., Suel G.M. Species-Independent Attraction to Biofilms through Electrical Signaling // Cell. 2017. Vol. 168, N 1. P. 200-209.
  8. Melnikov V.G. Microbial immatures // Abstract book of The XIII International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology, Sapporo, Japan, 2011, P-BA29-7. P. 248.

Views

Abstract - 30

PDF (Russian) - 1

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2017 Melnikov V.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies