CO-FORMATIONS OF BIOFILMS M. TUBERCULOSIS AND BACILLUS SPP. AS A MODEL OF MICROBIOTA AT ADVANCED STAGES OF TUBERCULOSIS

  • Authors: Ogarkov OB1,2,3, Badleeva MV4, Belkova NL1,5, Adelshin RV6, Tsyrenova TA7, Sinkov VV1,8, Khromova PA1, Kostyunin KY.8, Koshcheyev ME7, Zhdanova SN1
  • Affiliations:
    1. Scientific Center of Problems of Family Health and Human Reproduction
    2. Irkutsk State University
    3. Irkutsk State Medical Graduate Academy
    4. State University of the Republic of Buryatia
    5. Federal Publicly Funded Institution of Science “Limnologic institute” of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
    6. Irkutsk Research Anti-Plague Institute
    7. Irkutsk Regional Clinical Tuberculosis Hospital
    8. Irkutsk Regional Clinical Consultation and Diagnostic Center
  • Issue: Vol 17, No 4 (2017)
  • Pages: 67-69
  • Section: Articles
  • URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/9469
  • DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ17467-69
  • Cite item
Введение. Процесс образования биофильмов in сти, субстанция биофильмов M.tuberculosis (МБТ) vivo на поздних стадиях туберкулеза является важным во многом повторяет состав полимеров клеточной фактором патогенеза инфекции [1]. По всей видимо- стенки и капсулы. К таким полимерам можно отнести PDIM (phthiocerol/phthiodiolone dimycocerosate), PG (phenolic glycolipids) [2] и альфа-полиглутаматы [3]. Интересно, что альфа- и гамма-полиглутаматы являются биополимерами, широко встречающимися в капсулах и биофильмх других видов бактерий [3]. Цели и задачи: исследование механизмов образования биофильмов клиническими штаммами M.tuberculosis. Материалы и методы. Штаммы МБТ были получены с твердой питательной среды Левенштейна-Йенсена. Среда Школьниковой готовилась согласно действующим рекомендациям (Приказ № 109), дл получени биофильмов штаммы МБТ вы ращивали в 5 мл среды в стеклянных пробирках с добавлением до 10% инактивированной при 56° С сыворотки крови человека, согласно ранее описанной методике (Приказ № 558). Выделение геномной ДНК из биофильмов: экстракцию ДНК штаммов МБТ проводили из образцов, убитых прогреванием при 100° С в течение мин. Дл удалени ингибиторов ПЦР проводили предварительную обработку биофильмов протеиназой К и хлороформом. Фермент добавляли в количестве 2 ед. на образец в равном образцу объеме 0,5-кратного лизирующего буфера от набора ДНК-сорб-B («Интерлабсервис», Россия), интенсивно встр хивали и прогревали при 55° С в течение 30 мин. В дальнейшем к образцу добавл ли равный объем хлороформа, перемешивали и центрифугировали. Полученный супернатант отбирали в чистый виал и выделяли ДНК набором ДНК-сорб-B («Интерлабсервис»), согласно протоколу производител . ПЦР проводили в варианте с детекцией электрофорезом на термоциклерах фирмы БИС-М (Росси ) или с детекцией в реальном времени на амплификаторе LightCycler Nano (Roche). Олигонуклеотидные праймеры и зонды синтезированы НПФ «Синтол», также использовали реагенты для ПЦР компании «Интерлабсервис». Молекулярное клонирование ПЦР продуктов проводили с помощью набора Clon 1ЕТТМ PCR Cloning Kit (Thermo Scientific, США). Секвенирование по Сэнгеру выполняли на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 3500xL. Определение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) двух основных противотуберкулезных препаратов (ПТП) и 10 препаратов резерва проводили на планшетах Sensititre (Thermo Scientific, США). Результаты. При исследовании процесса образования биофильмов на среде Школьниковой обнаружено отсутствие образования биофильмов у всех 100 клинических штаммов при наличии планктонного роста. Рост в виде биофильмов наблюдался только у 20 лабораторных штаммов МБТ, прошедших многочисленные пассажи на искусственных питательных средах. В то же врем посев 150 образцов мокроты, стандартно обработанной NALC-NaOH, на «голодную» среду Школьниковой (без добавлени сыворотки крови) в 63 случаях сопровождался ростом микрофлоры с образованием биофильмов. В 30,2% (19/63) случаев биофильмы содержали возбудитель туберкулеза. Методом ПЦР-РВ выделено 6 образцов, имеющих наибольшую концентрацию микобактериальной ДНК. Проведено молекул рное клонирование участка гена 16S РНК одной из шести биофильмов с последующим секвенированием клонов. Вы вленна последовательность имела 99% гомологию с видом Bacillus thermoamylovorans. Из имеющихс образцов биофильмов с МБТ микробиологическими методами изолировано три штамма бацилл. Секвенирование гена 16S позволило идентифицировать выделенные штаммы, как Bacillus licheniformis (один штамм, более 99% гомологии) и Brevibacillus spp. (два штамма). Все три выделенных штамма были устойчивы к максимальным концентраци м изониазида, стрептомицина, этионамида и этамбутола. Штаммы Brevibacil-lus spp. были дополнительно устойчивы к ПАСК и ка-намицину. В модельном эксперименте при длительной совместной инкубации МБТ и B. licheniformis на «голодной» среде Школьниковой показано, что некоторые клинические штаммы M. tuberculosis способны успешно размножаться вместе со штаммом бациллы. Несмотр на то, что концентрация ДНК МБТ в биофильме, образованном бациллой B. Licheniformis, была значимо ниже, чем в жидкой среде, наблюдалось нарастание концентрации МБТ в биофильме и в жидкой фазе при выходе штамма B. licheniformis в log-фазу роста. Заключение. Обнаружение бацилл, считающихся сапрофитическими, продуцирующих биофильмы, при посеве мокроты от больных туберкулезом легких может изменить наше представление о безопасности бацилл, используемых в биотехнологии (B. licheniformis являет-с биотехнологическим штаммом, источником протеаз и липаз). В то же время авторами постулируется гипотеза, предполагающая возможность кратковременной перси-стенции некоторых «сапрофитических» видов бацилл в казеозном содержимом очагов некроза на поздних стадиях туберкулеза легких при возникновении аэробных условий в очаге казеоза. Нельз исключать, что МБТ, имеющие в составе клеточной стенки до 8% альфа-полиглутаматов, могут иметь определенное сродство и возможность размножаться в биофильмах бацилл, состоящих из гамма-полиглутамата. С учетом того, что выделенные бациллы имеют устойчивость к половине ПТП (по-видимому, конститутивную), обнаружение такого факта может значительно изменить наше представление о патогенезе поздних стадий туберкулеза легких в случае присоединени истинной бацилл рной микрофлоры к образованию биофильмов in vivo, т.е. в кавернах или других крупных очагах туберкулезного поражения легких. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 16-04-00160 А.

O B Ogarkov

Scientific Center of Problems of Family Health and Human Reproduction; Irkutsk State University; Irkutsk State Medical Graduate Academy

M V Badleeva

State University of the Republic of Buryatia

N L Belkova

Scientific Center of Problems of Family Health and Human Reproduction; Federal Publicly Funded Institution of Science “Limnologic institute” of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

R V Adelshin

Irkutsk Research Anti-Plague Institute

T A Tsyrenova

Irkutsk Regional Clinical Tuberculosis Hospital

V V Sinkov

Scientific Center of Problems of Family Health and Human Reproduction; Irkutsk Regional Clinical Consultation and Diagnostic Center

P A Khromova

Scientific Center of Problems of Family Health and Human Reproduction

K Yu Kostyunin

Irkutsk Regional Clinical Consultation and Diagnostic Center

M E Koshcheyev

Irkutsk Regional Clinical Tuberculosis Hospital

S N Zhdanova

Scientific Center of Problems of Family Health and Human Reproduction

  1. Orme I.M. A new unifying theory of the pathogenesis of tuberculosis // Tuberculosis (Edinb.). 2014. Vol. 94 (1). Р. 8-14.
  2. Flentie K.N., Stallings C.L., Turk J., Minnaard A.J., Hsu F.-F. Characterization of phthiocerol and phthiodiolone dimycocerosate esters of M. tuberculosis by multiple-stage linear ion-trap MS // J. Lipid Res. 2016. Vol. 57. Р. 142-155.
  3. Barton L. Structural and Functional Relationships in Prokaryotes. New York: Springer, 2005. Р. 202-210.
  4. Приказ № 109 от 21 марта 2003 г. Министерства здравоохранения Российской Федерации «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». М., 2003. [Prikaz № 109 ot 21 marta 2003 g. Ministerstva zdravoohraneniya Rossijskoj Federacii «O sovershenstvovanii protivotuberkuleznyh meropriyatij v Rossijskoj Federacii». Moscow, 2003].
  5. Приказ Минздрава СССР от 8 июня 1978 г. № 558 «Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе». М., 1978. [Prikaz Minzdrava SSSR ot 8 iyunya 1978 g. № 558 «Ob unifikacii mikrobiologicheskih metodov issledovaniya pri tuberkuleze». Moscow, 1978.].

Views

Abstract - 30

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2017 Ogarkov O.B., Badleeva M.V., Belkova N.L., Adelshin R.V., Tsyrenova T.A., Sinkov V.V., Khromova P.A., Kostyunin K.Y., Koshcheyev M.E., Zhdanova S.N.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies