PREPARATION OF ANTIMICROBIAL PEPTIDES FROM THE CULTURE OF LACTOBACILLUS PLANTARUM 8Р-А3 BY USING THE CHROMATOGRAPHIC METHOD ON POLYMERIC HETERO-CELLULAR SORBENT

Abstract



Введение. Развитие устойчивости патогенных бактерий к противомикробным препаратам, по данным Всемирной организации здравоохранения, одна из важнейших проблем современной медицины. В связи с этим актуальной задачей является поиск альтернативных антибиотиков для лечения бактериальных инфекций. Один из подходов к решению этой проблемы - получение антимикробных пептидов, продуцируемых пробиотическими молочнокислыми бактериями. Дл изучени свойств антимикробных пепти дов необходимо разработать такой способ их выделения, при котором сохранялась бы нативная структура пептидов. В силу своей технологической гибкости наиболее широко применяемым методом выделения и очистки целевых бактериальных метаболитов в настоящее время становится жидкостная хроматография. Данный метод основан, с одной стороны, на применении сорбентов, селективно сорбирующих целевое биологически активное вещество, а с другой - на использовании термодинамически и кинетически выгодных режимов динамической сорбции. Существующие стандартные схемы получени большинства целевых биологически активных веществ белковой природы из продуктов микробиологического синтеза предполагают многофазные процессы извле-чени с применением токсичных растворителей и продолжительный цикл работы. В результате в процессе такого многостадийного выделения могут произойти не только потери целевого вещества, но и деградация нативной структуры бактериоцинов. Таким образом, необходимо разрабатывать новые способы выделени целевых веществ из многокомпонентных смесей. Основным требованием дл таких процессов выделени вл етс высока селективность динамической сорбции целевых компонентов с помощью соответствующих хроматографических носителей. Цель работы: разработка методики одностадийного хроматографического выделения низкомолекулярных бактериальных экзометаболитов на полимерных сорбентах. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: выбрать хроматографический носитель для сорбционного процесса в соответствии с физико-химическими свойствами целевых биологически активных веществ; экспериментально определить параметры для проведения одностадийного процесса высокоселективной сорбции, при котором сохранялась бы нативная структура бактерициноподобных субстанций. Материалы и методы. Для изучения антимикробного действия низкомолекулярных пептидных соединений, синтезируемых пробиотическими молочнокислыми бактериями, нами был выбран промышленный штамм Lactobacillus plantarum 8P-A3, входящий в состав препарата Лактобактерин (НПО «Биомед», Россия). Известно, что этот бактериоциногенный штамм проявляет антагонистическую активность в отношении широкого круга микроорганизмов [1]. Анализ генома штамма L. plantarum 8P-A3, проведенный в ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», показал наличие полного плантарицинового локуса размером примерно 20000 п.о., содержащего кодирующие последовательности двух бактериоцинов - плантарицинов EF и NC8 [2]. В экспериментальных микробиологических исследованиях использовались штаммы L. plantarum 8Р-А3 и Escherichia coli АТСС 10798 из коллекции Отдела молекулярной микробиологии ФГБНУ «ИЭМ». Лактобациллы выращивали на среде МРС-1 («НИЦФ», Россия), энтеробактерии культивировали на среде LB (AMRESCO LLC, USA). Все бактериальные штаммы инкубировали в аэробных условиях при 37° С в течение 24 часов. Хроматографическое выделение пептидных фракций супернатанта штамма L. plantarum 8Р-А3 осуществляли при использовании полимерного гетеросетчатого сорбента БДМ-12 на основе метакриловой кислоты и диметакрилата этиленгликол , синтезированного в Институте Высокомолекул рных соединений РАН [3]. Перед процессом хроматографии через колонку пропускали раствор 0,5 н. соляной кислоты, чтобы перевести сорбент в H-форму. Все целевые биологически активные вещества св зывались водородной формой сорбента при сорбции из кислых значений рН. Десорбцию осуществл ли в ходе ступенчатого элюиро-вани , последовательно промыва колонку растворами 0,2 н. ацетата аммония с pH 4,5; 6; 7; 8 и 10. Элюирование каждым раствором проводили до получения на выходе из колонки раствора с рН, равным рН исходного элюента. Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин. После десорбции pH всех фракций доводили до 7,0, чтобы исключить ингибирующее воздействие кислоты и щелочи на индикаторную культуру. Антимикробную активность полученных пептидных фракций по отношению к индикаторной культуре E. coli АТСС 10798 определяли турбидиметрическим методом путем измерения оптической плотности при \=600 нм. Обладающую наибольшей способностью ингибировать рост индикаторной культуры фракцию пептидов (P) выбрали для последующего анализа. Для изучения влияния на рост индикаторной культуры в системе in vitro сконцентрированную в 100 раз выбранную активную фракцию пептидов (P*) добавляли в жидкую питательную среду LB в количестве 0,1% и 0,2% от объема и наблюдали за скоростью роста энтеробактерий. Дл сравнительного анализа степени ингибирующего действи экзометаболитов лактобацилл в питательную среду добавл ли антибактериальное лекарственное средство ампициллин в концентрации 10 мг/л. Для доказательства пептидной природы антимикробной активности исследуемой фракции ее о бра-батывали протеолитическим ферментом - трипсином. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием t-критерия Стью-дента с помощью программы Mathcad 14. Результаты считали статистически значимыми при p<0,05. Результаты и их обсуждение. На основании сравнительного анализа полученных нами данных установлено, что максимальной способностью ингибировать рост грамотрицательной энтеробактерии E. coli ATCC 10798 обладала пептидна фракци супернатанта пробиотического штамма L. plantarum 8Р-А3, полученная при элюировании раствором а цетата аммония с pH 8,0. Антибактериальное действие данной активной фракции, сконцентрированной в 100 раз и добавленной в количестве 0,2% от объема питательной среды LB, оказалось сопоставимо с действием ампициллина в концентрации 10 мг/л. Рисунок. Антимикробное действие пептидной фракции, полученной из культуры L. plantarum 8Р-А3, на рост E. coli ATCC 10798. К - контроль роста энтеробактерий на среде LB; P*+tripsin - фракция, обработанная трипсином; P* 0,1% - фракция в количестве 0,1% об.; P* 0,2% - фракция в количестве 0,2 % об.; Amp - ампициллин 10 мг/л. Фракция, обработанная трипсином, не оказывала ингибирующего действия (рисунок). Этот факт подтверждает, что антимикробные вещества разложились за счет гидролиза пептидных связей. Полученные результаты позволяют предположить, что антибактериальная активность пептидной фракции, полученной из супернатанта при элюировании раствором ацетата аммония с pH 8,0, обусловлена содержанием в данной фракции бактериоцинов лактобацилл, гены которых присутствуют в геноме исследуемого пробиотического штамма L. plantarum 8Р-А3 [2]. В дальнейшем для подтверждения нали-чи плантарицинов EF и NC8 необходимо провести масс-спектрометрический анализ фракции. Выводы. Разработанные нами физико-химические условия для проведения одностадийного хроматографического процесса позвол ют выдел ть из многокомпонентной смеси целевые вещества белковой природы с сохранением их нативной структуры и, следовательно, антибактериальных свойств. Описанный хроматографический метод выделения на полимерных гетеросетчатых сорбентах может использоваться также для получения антимикробных пептидов и других пробиотических штаммов молочнокислых бактерий.

G V Ryabinin

Saint Petersburg National Research Institute of Informational Technologies, Mechanics, and Optics

  1. Ermolenko E.I., Isakov V.A., Zhdan-Pushkina, S.K., Tets V.V. Quantitative characterization of antagonistic activity of lactobacilli // Zhurnal Mikrobiologii, Epidemiologii, i Immunobiologii. 2004. N 5. P. 94-98.
  2. Tsapieva A., Duplik N., Suvorov A. Structure of plantaricin locus of Lactobacillus plantarum 8P-A3 // Beneficial Microbes. 2011. N 2 (4). P. 255-261.
  3. Pisarev O.A., Polyakova I.V. Regulation of sorption selectivity in preparative chromatography of biologically active substances on polymeric sorbents (Review) // Trends in chromatography. 2013. N 1. P. 2-45.

Views

Abstract - 40

PDF (Russian) - 4

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2017 Ryabinin G.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies