THE ANTITUMOR EFFECT OF EXPRESSION PLASMID BEARING DUSP9 GENE IN SHR MICE HAVING SOLID EHRLICH CARCINOMA

Abstract


SHR mice with Ehrlich carcinoma were used to assess the effects of administration of a newly developed plasmid DNA construct bearing DUSP9 gene. The construct has been found to inhibit Ehrlich tumor growth by promoting necrosis. The administration of the construct has been shown to decrease the prophase index suggesting the attenuation of Ehrlich tumor malignancy.

Введение. В последние годы достигнуты значительные успехи в лечении онкологических больных благодаря высокотехнологичным способам хирургического и лучевого воздействия на бластомы, а также использованию новых противоопухолевых химиотерапевтических средств, в том числе и таргетных препаратов [1-3]. К сожалению, традиционные фармакологические и радиационные методы не всегда эффективны и имеют опасные побочные эффекты, что диктует необходимость поиска новых подходов к лечению опухолей. В качестве одной из перспективных стратегий в современной онкологии рассматривается генная терапия с использованием генов опухолевых супрессоров [4, 5]. DUSP9/MKP4 относится к подсемейству цитоплазматических протеинфосфа-таз МАР-киназ (MAP Kinase Phosphatase, МКР). МКР негативным образом регулируют активность МАР-киназ - ключевых молекул MAP-киназных сигнальных каскадов, под контролем которых находятся основные клеточные процессы, включая пролиферацию, дифференцировку, апоптоз [6]. Хотя молекулярные механизмы участия DUSP9 в регуляции клеточных процессов мало изучены, имеющиеся экспериментальные данные позволяют предположить, что DUSP9 может быть опухолевым супрессором, способным подавлять пролиферацию трансформированных клеток, индуцировать митотическую катастрофу в опухолевых клетках и тормозить прогрессию опухоли [7, 8]. В согласии с предположением об опухолевосупрессорной функции DUSP9 находятся также результаты наших собственных работ и других исследований, в которых было выявлено значительное снижение транскрипционной активности DUSP9 в опухолевой ткани пациентов со светлоклеточной карциномой почки уже на ранних стадиях заболевания [2, 9-11]. Таким образом, DUSP9 можно рассматривать в качестве нового потенциального гена, экспрессия которого может иметь противоопухолевый эффект. Для проверки этой гипотезы нами была клонирована кодирующая последовательность кДНК гена DUSP9 в эукариотический экспрессионный вектор pIRES2-EGFP (Clontech). Цель работы: изучение влияния внутриопухоле-вого введения экспрессионной плазмиды с геном DUSP9 на параметры роста и клеточную кинетику 76 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 3 солидной опухоли Эрлиха у мышей SHR, а также на морфологию опухоли и основных жизненно важных органов животных. Материалы и методы исследования. Конструирование плазмиды hDUSP9-pIRES-EGFP и трансфекция клеточной культуры кДНК гена DUSP9 человека (GeneBank NM_001395), включающая последовательность Козака и трансляционный стоп-кодон [8], была амплифицирована методом ПЦР с использованием ген-специфических праймеров с добавленными к 5’-концу последовательностями для рестриктаз EcoR1 и BamH1 (подчеркнуты): прямой 5-GGA-ATTCTCCAGCGTGTAGGGAGCCGATC-3; обратный 5’- CGGGATCCTCCTGCCCTCCCCTCC. Синтез кДНК на матрице РНК, выделенной из ткани почки, проводился в условиях, описанных ранее в работе А. М. Гранова и соавт. (2006) [2]. Амплификация DUS9-кДНК проводилась в объеме 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл кДНК, 1X Pfx Buffer, 1 мM MgSO4, 0,2 мМ каждого дНТФ, 0,4 мМ каждого праймера, 1X Enhancer solution (Invitrogen) и 1,25 ед. ДНК-полимеразы Platinum® Pfx (Invitrogen), по программе: 95 С - 3 мин; (94° С - 1 мин; 60°С - 50 с; 72°С - 2 мин)X35 циклов; заключительный цикл 72° С - 8 мин. Амплифицированный фрагмент (1264 п. о.) был клонирован в бицистронный экспрессионный вектор pIRES-EGFP (BD Biosciences Clontech) по сайтам EcoR1 и BamH1 (рис. 1). Правильность клонированной DUSP9-последовательности была подтверждена секвенированием. Вектор pIRES2-EGFP без вставки был использован в качестве контроля. Выделение плазмидной ДНК для экспериментов in vitro и in vivo проводили с использованием набора Plasmid Maxi Kit (QIAGEN). Функциональность рекомбинантной плазмиды hDUSP9-pIRES-EGFP была оценена in vitro по экспрессии флуоресцентного белка EGFP в клетках линии HEK293, трансфециро-ванных плазмидой, методом флуоресцентной микроскопии и путем детекции DUSP9-мРНК в трансфе-цированных клетках методом ОТ-ПЦР. Трансфекцию клеток проводили с использованием реагента Fugene-6 (Roche), согласно протоколу компании. За сутки перед трансфекцией 3х105 клеток в 2 мл среды DMEM, шдержащей 7,5% FCS, высевали в 6-луночный планшет и инкубировали при 37 С до достижения 60-70% конфлуентности. В день транфекции 3 мкл реагента Fugene-6 разводили в 100 мкл бессывороточной среды, добавляли плаз-мидную ДНК в количестве 1 мкг в объеме 2 мкл, перемешивали и инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего вносили комплекс ДНК-Fugene в лунки с клетками. Через 48 ч после трансфекции визуализировали трансфеци-рованные клетки с помощью флуоресцентного микроскопа по свечению белка EGFP. Для ОТ-ПЦР из трансфецированных клеток была выделена РНК, которую использовали для синтеза кДНК. Последовательность кДНК гена DUSP9 амплифици-ровали методом ПЦР в условиях, указанных выше. Продукты амплификации анализировали в агарозном геле. Нормирование уровня экспрессии мРНК DUSP9 проводили относительно beta-actin. Рис. 1. Схематическая карта экспрессионной плазмиды hDUSP9-pIRES-EGFP. Для изучения антибластомного эффекта созданной экспрессионной плазмиды с геном DUSP9 в эксперименты были взяты 55 белых мышей SHR - самок с массой тела 24-26 г. Животные содержались в стандартных условиях клиники лабораторных животных ФГБУ «РНЦРХТ» Минздрава РФ при свободном доступе к воде и пище. Для перевивок использован штамм опухоли Эрлиха. Характеристика и морфологическое изучение опухоли были описаны нами ранее [12]. Подсчет общего числа опухолевых клеток, содержащихся в 200 мкл (5 х106 опухолевых клеток) производился в камере Горяева. Поставлено две серии опытов. В первой серии опухоль Эрлиха перевивалась 10 мышам по 200 мкл взвеси опухолевых клеток в правую заднюю конечность. Через 3 суток, когда опухоли у мышей достигали объема 1,8-2,1 см3, животные были разделены на 5 групп: 1-я группа - контрольные животные; 2-я группа - мыши, которым в центр новообразования правой задней конечности вводили вектор pIRES2-EGFP в дозе 10 мкг через 3 суток после перевивки опухоли; 3-я группа - мыши, которым в центр новообразования правой задней конечности вводили вектор pIRES2-EGFP в дозе 10 мкг дважды - через 3 и через 6 суток после перевивки опухоли; 4-я группа - мыши, которым в центр новообразования правой задней конечности вводили МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 3 77 экспрессионную плазмиду с геном DUSP9 через 3 суток после перевивки опухоли; 5-я группа - мыши, которым в центр новообразования правой задней конечности вводили экспрессионную плазмиду с геном DUSP9 через 3 и через 6 суток после перевивки опухоли. Измерения объема опухолей у животных производились в динамике на 6, 9, 13 и 15-е сутки после перевивки. На 15-е сутки все животные были умерщвлены эфиром. Каждое животное подвергали патологоанатомическому исследованию и брали материал для последующей морфологической оценки. Для гистологического исследования у каждой мыши брали опухолевые узлы, все видимые лимфатические узлы (паховые, подмышечные, параоартальные), печень, селезенку, обе почки с надпочечниками, поджелудочную железу, легкие, сердце, головной мозг. Все органы фиксировали в 10% нейтральном формалине. Затем готовили гистологические срезы по стандартной методике. В опухолях подсчитывались митотический и про-фазный индексы и оценивалась некротическая гибель опухолевых клеток. Во второй серии опытов опухоль Эрлиха перевивалась внутримышечно 45 мышам по 200 мкл взвеси опухолевых клеток в правую заднюю конечность. Через 3 суток, когда опухоли у мышей достигали объема 1,8-2,1 см3, животные были разделены на три группы по 15 особей. 1-я группа - контрольные животные, которым внутриопухолево вводили изотонический раствор натрия хлорида в объеме 0,3 мл (производилось 3 инъекции по 0,1 мл с разных сторон опухоли); 2-я группа - мыши, которым внутриопухолево вводили вектор pIRES2-EGFP в дозе 50 мкг в объеме 0,3 мл (производилось 3 инъекции по 0,1 мл с разных сторон опухоли); 3-я группа - мыши, которым внутриопухолево вводили экспрессионную плазмиду с геном DUSP9 в дозе 50 мкг в объеме 0,3 мл (производилось 3 инъекции по 0,1 мл с разных сторон опухоли). Измерялся объем опухолей на 7, 10, 12, 14, 17 и 19-е сутки после перевивки опухоли, который оценивался в результате их измерений в трех взаимопер-пендикулярных размерах по формуле Шрека (Vоп=ax■bx■cx■n/6, где Vоп - объем опухоли, a, b, c - ее высота, длина и ширина). Противоопухо -левая активность оценивалась по проценту торможения роста опухоли. Процент торможения роста опухоли (Т%) определяли по формуле: T%=((Vk-Vэ)/Vк)x100, где Vk - средний объем опухоли у мышей контрольной группы, Vэ - средний объем опухоли у мышей, получавших экспрессионную плазмиду с геном DUSP9. Полученные результаты обрабатывались статистически по методу Фишера- Стьюдента. Исследования проводились с разрешения Этического комитета ФГБУ «РНЦРХТ» Минздрава РФ. Результаты и их обсуждение. Полноразмерная кДНК, кодирующая ген DUSP9 человека, включая консенсную последовательность Козака и сайт тер-минации трансляции, была клонирована в экспрес-сионном векторе pIRES2-EGFP. В полученном ДНК-конструкте гены DUSP9 и EGFP, кодирующий флуоресцентный белок. транскрибируются в составе одной молекулы РНК, но транслируются отдельно. После подтверждения секвенированием правильности ДНК-структуры конструкта, отобранные варианты рекомбинантных молекул амплифици-ровали в бактериальных клетках Top10F' и выделяли очищенную плазмидную ДНК, которую использовали в экспериментах in vitro (трансфекция клеток HEK293) и in vivo (исследование противоопухолевого эффекта ДНК-конструкта на модели экспериментальных животных). Функциональность вектора pIRES2-EGFP проверяли по экспрессии флуоресцентного белка в трансфецированных клетках и методом ОТ-ПЦР. На рис. 2 показано, что в трансфециб beta-actin Рис. 2. а - Флуоресцентная микроскопия клеток HEK293, трансфецированных экспрессионной плазмидой hDUSP9-pIRES-EGFP. Ув. х10; б - детекция DUSP9-мРНК методом ОТ-ПЦР. 1 - нетрансфецированные клетки HEK293; 2 - клетки HEK293, трансфецированные вектором pIRES2-EGFP; 3 - клетки HEK293, трансфецированные экспрессионной плазмидой hDUSP9-pIRES-EGFP. рованных клетках и HEK293 детектируется флуоресцентный белок EGFP. ОТ-ПЦР-анализ показал, что в трансфецированных клетках синтезируется РНК, кодирующая DUSP9. В результате проведенного in vivo исследования было обнаружено, что вектор pIRES2-EGFP, вве 78 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 3 денный в дозе 10 мкг через 3 суток после перевивки (однократное введение) мышам с опухолью Эрлиха, достоверно тормозит рост бластомы на 9-е сутки после перевивки. При двукратном введении вектора pIRES2-EGFPв дозе 10 мкг через 3 и 6 суток после перевивки достоверное торможение роста опухоли наблюдается на 9, 13 и 15-е сутки после перевивки (рис. 3). Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 ‘ ‘ Группа 5 Дни после перевивки Рис. 3. Влияние экспрессионной плазмиды hDUSP9-pIRES-EGFP на динамику роста солидной опухоли Эрлиха у мышей самок SHR. 1-я группа - контроль (изотонический раствор натрия хлорида); 2-я группа - вектор pIRES2-EGFP, однократное введение; 3-я группа - вектор pIRES2-EGFP, двукратное введение; 4-я группа - экспрессионная плазмида hDUSP9-pIRES-EGFP, однократное введение; 5-я группа - экспрессионная плазмида hDUSP9-pIRES-EGFP, двукратное введение. Стрелкой обозначен день введения плазмиды. Из рис. 3 явствует, что экспрессионная плазмида с геном DUSP9, и при однократном (через 3 суток после перевивки) и при двукратном введении (через 3 и 6 суток после перевивки опухоли) достоверно тормозит рост опухоли на 3, 6, 10 и 12-е сутки после его введения. Поскольку при двукратном введении как вектора pIRES2-EGFP, так и экспрессионной плазмиды с геном DUSP9, противоопухолевый эффект был больше, чем при однократном их введении, во второй серии опытов была увеличена доза вектора pIRES2-EGFP до 50 мкг. Оценен противоопухолевый эффект как вектора pIRES2-EGFP, так и экспрессионной плазмиды с геном DUSP9 в динамике до 19 суток после перевивки опухоли Эрлиха. Полученные данные представлены на рис. 4. Как явствует из рис. 4, во все исследованные -•- I группа II группа ~л~ III группа 3 6 9 12 15 18 ~~21 Дни после перевивки Рис. 4. Противоопухолевый эффект экспрессионной плазмиды hDUSP9-pIRES-EGFP на динамику роста солидной опухоли Эрлиха у мышей самок SHR. 1-я группа - контроль (изотонический раствор натрия хлорида); 2-я группа - вектор pIRES2-EGFP, 3-я группа - экспрессионная плазмида hDUSP9-pIRES-EGFP. Стрелкой обозначен день введения плазмиды. сроки наблюдалось торможение роста опухоли Эрлиха после введения экспрессионной плазмиды с геном DUSP9. Представляло интерес выяснить, за счет чего происходит торможение роста опухоли. Для выяснения этого обстоятельства у животных первого опыта (таблица) были исследованы новообразования Таблица Влияние экспрессионной плазмиды с геном DUSP9 на клеточную кинетику на 15-е сутки после перевивки опухоли Эрлиха мышам-самкам SHR Название экспериментальной группы Митотический индекс, %0 Профазный индекс Профаза, % Метафаза, % Телофаза, % Патологический митоз, % Контроль (изотонический раствор натрия хлорида) 8,7 9,1 0,066 0,6 0,066 0,13 Вектор pIRES2-EGFP, введенный однократно 1,3 3 0,2 0,6 Нет 0,33 Вектор pIRES2-EGFP, введенный двукратно 5,4 0,75 0,24 0,18 0,06 0,06 Экспрессионная плазмида с геном DUSP9, введенная однократно 7,8 4 0,11 0,44 Нет 0,22 Экспрессионная плазмида с геном DUSP9, введенная двукратно 7,0 2 0,19 0,38 Нет 0,13 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 3 79 на 15-е сутки после перевивки опухоли Эрлиха и 12-е сутки после однократного введения экспрес-сионной плазмиды с геном DUSP9, при этом в клетках опухолей подсчитывались митотический и про-фазный индексы. Оценивалась также некротическая гибель опухолевых клеток. Эти данные представлены в таблице и на рис. 5. 1600 1400 S 1200- 1000 я 800 600- ÜÜ 400 à 200 70 -60 50 40 I -30 g* 20 С -10 данные по некротической гибели опухолевых клеток и подсчитано количество жизнеспособных клеток в некротической ткани. 1600 1400 1200 I 1000 ? 800 І х 600 400 200 0 45 40 35 * 30 I §■ 25 g 20 § 15 I 10 1 2 Группа 1 2 3 4 5 Группа I Площадь некроза, % СИ Кол-во жизнеспособных клеток в зоне некроза Рис. 5. Влияние экспрессионной плазмиды hDUSP9-pIRES-EGFP на некротическую гибель опухолевых клеток на 15-е сутки после перевивки опухоли Эрлиха мышам-самкам SHR. 1-я группа - контроль (изотонический раствор натрия хлорида); 2-я группа - вектор pIRES2-EGFP, однократное введение; 3-я группа - вектор pIRES2-EGFP, двукратное введение; 4-я группа - экспрессионная плазмида hDUSP9-pIRES-EGFP, однократное введение; 5-я группа - экспрессионная плазмида hDUSP9-pIRES-EGFP, двукратное введение. Из таблицы видно, что экспрессионная плазмида содержащая ген DUSP9 уменьшает митотический индекс и соответственно увеличивает первый после его введения клеточный цикл. Соотношение между метафазой и профазой, выраженное «профазным индексом» по Тимонену и Терману, равно 1, оно прогрессивно возрастает в очагах воспаления при предраковых состояниях и раке, достигая величин 2,56 и выше, которые можно считать характерными для злокачественных опухолей [13]. В нашем эксперименте для опухоли Эрлиха профазный индекс равен 9,1. Под влиянием как вектора pIRES2-EGFP, так и экспрессионной плазмиды, содержащей ген DUSP9, у мышей-самок SHR с солидной опухолью Эрлиха профазный индекс существенно уменьшается (таблица), что свидетельствует о снижении потенциала злокачественности опухоли Эрлиха. Важно было определить, за счет чего происходит гибель опухолевых клеток. На рис. 6 представлены I Площадь некроза, % А Общее кол-во опухолевых клеток в препарате I I Кол-во жизнеспособных клеток в зоне некроза Рис. 6. Влияние экспрессионной плазмиды hDUSP9-pIRES-EGFP на некротическую гибель опухолевых клеток на 10-е сутки после перевивки и 7-е сутки после его введения мышам-самкам SHR с солидной опухолью. 1-я группа - контроль (изотонический раствор натрия хлорида); 2-я группа - вектор pIRES2-EGFP, 3-я группа - экспрессионная плазмида hDUSP9-pIRES-EGFP. Как видно на рис. 6, наибольшая площадь некрозов наблюдалась в опухолевой ткани при двукратном введении экспрессионной плазмиды с геном DUSP9, при этом в зоне некроза отмечено наименьшее количество жизнеспособных опухолевых клеток. При морфологическом исследовании печени, селезенки почек, поджелудочной железы, легких, сердца, головного мозга, лимфатических узлов не наблюдалось патологических изменений ни в одной из пяти экспериментальных групп мышей. Во второй серии опытов мы увеличили дозу однократного введения вектора pIRES2-EGFP. Изучили торможение роста опухоли Эрлиха после введения как вектора pIRES2-EGFP, так и экспрессион-ной плазмиды с геном DUSP9. Были подсчитаны общее количество опухолевых клеток в препарате, площадь некрозов и количество опухолевых клеток в зоне некроза в ранние сроки (на 7-е сутки) после введения вектора pIRES2-EGFP и экспрессионной плазмиды с геном DUSP9. В результате гистологической верификации обнаружено, что экспрессионная плазмида с геном DUSP9 увеличивает в опухоли площадь некрозов (рис. 7), у части опухолевых клеток наблюдалась апоптотическая гибель (рис. 8). Выводы. 1. Внутриопухолевое введение созданного в лаборатории ДНК конструкта (экспрессионной плазми- 80 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 3 Рис. 7. Опухоль Эрлиха на 10-е сутки после перевивки и 7-е сутки после введения с трех сторон в опухоль экспрессионной плазмиды hDUSP9-pIRES-EGFP. Некроз опухоли Эрлиха слева, демаркационная линия посредине, справа «живые» опухолевые клетки. х100. Окраска гематоксилином и эозином. ды с геном DUSP9) тормозит рост солидной опухоли Эрлиха у мышей SHR. Это происходит за счет увеличения некрозов. 2. Введение экспрессионной плазмиды с геном DUSP9 уменьшает профазный индекс, что свиде- Рис. 8. Опухоль Эрлиха на 10-е сутки после перевивки и 7 сутки после введения с трех сторон в опухоль экспрессионной плазмиды hDUSP9-pIRES-EGFP. Стрелками указаны опухолевые клетки с апоптозом. х400. Окраска гематоксилином и эозином. тельствует о снижении потенциала злокачественности опухоли Эрлиха.

A M Granov

Russian Scientific Center of Radiology and Surgical Technologies of the Russian Federation Ministry of Health

St. Petersburg, Russia Full member of the RAS A

S F Vershinina

Russian Scientific Center of Radiology and Surgical Technologies of the Russian Federation Ministry of Health

Email: sofia.vershinina2010@mail.ru
St. Petersburg, Russia

Ye I Yakubovich

Russian Scientific Center of Radiology and Surgical Technologies of the Russian Federation Ministry of Health

St. Petersburg, Russia

A B Markochev

Russian Scientific Center of Radiology and Surgical Technologies of the Russian Federation Ministry of Health

St. Petersburg, Russia

V I Yevtushenko

Russian Scientific Center of Radiology and Surgical Technologies of the Russian Federation Ministry of Health

St. Petersburg, Russia

  1. Гранов А. М., Полысалов В. Н., Таразов П. Т. и др. Интервенционная радиология в онкологической клинике: обзор научных исследований в ЦНИРРИ // Вопр. онкол.- 2003.- Т. 49, № 5.- С. 537-543.
  2. Гранов А. М., Якубович Е. И., Евтушенко В. И. Множественный параллельный анализ экспрессии генов как инструмент молекулярной диагностики рака почки и предстательной железы // Медицинский академический журнал.- 2006.- Т. 6, № 1.- С. 131-138.
  3. Стуков А. Н., Гершанович М. Л., Филов В. А., Имянитов Е. Н. Проблемы современной таргетной терапии злокачественных опухолей // Вопр. онкол.- 2005.- № 5.- С. 607-611.
  4. Roth J. A. Tumor-suppressing gene therapy // Cancer Biology &Therapy.- 2003.- Vol. 2.- P. 115-121.
  5. Shanker M., Jin J., Branch C. D. et al. Tumor suppressor gene-base nanotherapy: from test tube to the clinic. // Journal of drug delivery.- 2011.- ArticleID 465845.
  6. Patterson K. I., Brummer T., O’Brien P. M., Daly R. J. Dual-specificity phosphatases: critical regulators with diverse cellular targets // Biochem. J.- 2009.- Vol. 418 (3).- P. 475-489.
  7. Liu Y., Lagowski J., Sundholm A. et al. Microtubule disruption and tumor suppression by mitogen-activated protein kinase phosphatase 4 // Cancer Res.- 2007.- Vol. 67.- P. 10711-10719.
  8. Muda M., Boschert U., Smith A. et al. Molecular cloning and functional characterization of a novel mitogen activated protein kinase phosphatase, MKP-4 // J. Biol. Chem.- 1997.- Vol. 272.- P. 5141-5151.
  9. Чебуркин Ю. В., Князева Т. Г., Петер Ш. и др. Молекулярный портрет карцином почки человека, полученный на основе экспрессии протеин-тирозин-киназ и тирозин-фосфатаз, контролирующих передачу регуляторных сигналов в клетках / / Молекулярная биология.- 2002.- Т. 36, № 3.- С. 480-490.
  10. Якубович Е. И., Евтушенко В. И. DUSP9 - новый driver-ген светлоклеточной карциномы почки? // Врач-аспирант - 2012.- № 4.3 (53).- С. 404-410.
  11. Wu S., Wang Y., Sun L. et al. Decreased expression of dual-specificity phosphatase 9 is associated with poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma // BMC Cancer.- 2011.- Vol. 11.- P. 413-421.
  12. Вершинина С. Ф., Стуков А. Н. Справочник по экспериментальной терапии опухолей.- СПб.: Репринт, 2008.- 36 с.
  13. Функциональная морфология клетки.- М.: Иностранная литература, 1963.

Views

Abstract - 31

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2016 Granov A.M., Vershinina S.F., Yakubovich Y.I., Markochev A.B., Yevtushenko V.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies