Abstract

Abstract

Full Text

Введение. Доставка генетического материала методом электропорации, основанным на электро-опосредованном переносе нуклеиновых кислот, является хорошей альтернативой длительному и трудоёмкому созданию трансгенных животных или изготовлению вирусных векторов. Хотя механизм проникновения нуклеиновых кислот в клетку при электропорации до конца не изучен, данный подход нашёл широкое применение в исследованиях ЦНС [1]. Метод существу- 54 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 4 ет в двух основных модификациях. Электропорация in utero, выполняемая на 14-16 день внутриутробного периода, предназначена для доставки генетического материала в клетки нейрональных предшественников, способных к делению и миграции, и не эффективна в отношении астроглии [2]. Второй подход, применяемый на различных стадиях постна-тального развития, осуществляется с помощью стереотакси-ческого манипулятора и имеет ряд преимуществ, обеспечивая возможность доставки генетического материала в пространственно разделённые участки, соответствующие стереотакси-ческим координатам, и позволяя преодолеть онтогенетические компенсаторные механизмы, включающиеся при переносе экзогенных генов. Недостатком метода является преимущественная трансдукция клеток субвентрикулярной зоны [3]. Цель исследования. Обеспечить постнатальную доставку генетического материала in vivo в клетки, располагающиеся вне субвентрикулярной зоны, в частности, в кортикальные астроциты, и достичь его эффективной и специфичной экспрессии. Материалы и методы. В эксперименте были использованы 0-4-дневные крысята Wistar. Используя EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein - усиленный зелёный флюоресцирующий белок) в качестве репортерного гена [4], мы модифицировали технику постнатальной электропорации. Было установлено, что быстрая инъекция (в течение 10 с) небольшого объёма (50 нл) высоко концентрированной плазмиды (3 мкг/мкл) через заточенный боросиликатный капилляр с диаметром острия 20-30 мкм с последующим немедленным нанесением 5 прямоугольных электрических импульсов (50 мс, 1 Гц, 120 В/см) посредством пинцетообразных электродов, размещённых непосредственно на поверхности черепа и снабжённых электропроводящим гелем, приводит к формированию отчётливого паттерна экспрессии EGFP в клетках коры и стриатума. Показано также, что 1-2 день постнатального развития является оптимальным возрастным интервалом для проведения in vivo электропорации вследствие относительно низкого содержания миелина и неоконченного формирования черепных костей, а также хорошей переносимости изофлюрановой анестезии. Результаты и их обсуждение. Экспрессия генетического материала в конкретных субпопуляциях клеток как в экспериментах in vitro, так и при создании трансгенных животных эффективно достигается использованием специфического промотора, однако при доставке плазмидной ДНК без посредства трансфецирующих агентов данный подход может встретить серьёзные ограничения. Мы показали, что при использовании неспецифического промотора CAG (гибридный конструкт, представляющий собой промотор куриного ß-актина с цитомегаловирусным энхансером) экспрессия репортерного гена с высокой эффективностью отмечалась в клетках, имеющих морфологию астроцитов. Высокая и стабильная экспрессия EGFP в кортикальных и гиппокампальных астроцитах, а также в клетках радиальной глии регистрировалась в течение нескольких недель с момента проведения постнатальной электропорации. Вместе с тем, специфичный для астроцитов мышиный GFAP промотор длиной 1,7 тысяч пар нуклеотидов (Glial Fibrillary Acidic Protein - глиальный фибриллярный кислый белок), доставленный методом in vivo электропорации в неонатальный кортекс, вызывал экспрессию репортерного гена в клетках с морфологией нейронов и радиальной глии. Изменение экспрессионных характеристик mGFAP промотора могут быть обусловлены бактериальным паттерном метилирования плазмидной ДНК, отличающимся от эукариотического паттерна. Универсальный CMV промотор - ранний промотор цитомегаловируса человека, не был эффективен при доставке плазмиды, содержащей репортерный ген, методом in vivo электропорации. Выводы. Приведённые результаты показывают, что выбор адекватного промотора является критической ступенью для успешного проведения in vivo электропорации, а также указывают на возможность использования данного метода с целью изучения регуляторных элементов влияющих на генную экспрессию, а также эффектов их эпигенетической модификации.