FUNKTsIONAL'NAYa KhARAKTERISTIKA MUTATsIY, VYZYVAYuShchIKh NARUShENIYa STEROIDOGENEZA I POLOVOGO RAZVITIYa, V GENAKh YaDERNYKh RETsEPTOROV NR0B1 I NR5A1

Abstract



Введение. Представители суперсемейства ядерных рецепторов NR0B1 (DAX1, DSS -AHC, dosage sensitive sex reversal-adrenal hypoplasia congenital critical region on chromosome X, gene 1) и NR5A1 (SF-1, стероидогенный фактор-1) играют важную роль в развитии надпочечников и гонад и регуляции стероидогенеза. Мутации в гене DAX1 вызывают Х-сцепленную врожденную гипоплазию надпочечников [1], а мутации в гене SF-1 приводят к дисгенезии гонад, в некоторых случаях в сочетании с надпочечниковой недостаточностью [2, 3]. Белок SF-1 является активатором транскрипции многих генов стерои-догенеза, а DAX1 действует как репрессор SF-1-зависи-мой транскрипции [4-6]. Цель настоящей работы - функциональная характеристика мутаций в генах DAX1 и SF-1, выявленных у пациентов с соответствующими эндокринными нарушениями. Материалы и методы исследования. Для оценки функциональной активности мутантных вариантов SF-1 и DAX1 использовали систему экспрессии в клетках млекопитающих репортерного гена люциферазы под контролем промотора гена StAR (Steroidogenic Acute Regulatory protein), который активируется под действием SF-1. Для конструирования мутантных вариантов DAX1 и SF-1 использовали метод двухраундовой ПЦР с мутагенными праймерами. Фрагменты, кодирующие мутантные белки встраивали в вектор pcDNA-3.1(+) и полученными конструкциями трансфицировали клетки эмбриональной почки человека HEK293. В лизатах трансфицированных клетках определяли ферментатив ную активность люциферазы. Для определения влияния мутаций в гене SF-1 на сплайсинг сконструировали минигены SF1, состоящие из части экзона 2, интрона 2 и части экзона 3, гена дикого типа и мутантных генов. Минигены экспрессировали в клетках HEK293 и анализировали продукты сплайсинга. 40- 35 Э CQ І зо §■ 25е- § Я 1 20 н с п 15g О □ star □ STAR + DAX □ STAR + SFlwt □ STAR + SF1 R35D □ STAR + SF1 R35E □ STAR + SFlwt + DAX □ STAR + SF1 R35D + DAX □ STAR + SF1 R35E + DAX r4 о Результаты и их обсуждение. Сконструированы векторы для экспрессии в клетках млекопитающих DAX1 130 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 4 Таблица Анализ влияния мутантных вариантов DAX1 и SF-1 на активность промотора гена StAR в системе экспрессии репортерного гена люцифсразы в клетках НЕК293 Плазмиды, использованные для трансфекции клеток НЕК293 в комбинации с репортерной плазмидой pGL3-StAR-prom, содержащей ген люциферазы светлячка под контролем промотора гена StAR Относительная активность люциферазы (среднее значение ± стандартное отклонение) pcDNA3.1 1 pcDNA3.1 + pcDNA3.1/SF-l 11,82±2,05 PcDNA3.1 + PcDNA3.1 /SF-1 +PcDNA3.1 /DAXwt 4,79±0,77 PcDNA3.1 + PcDNA3.1 /SF-1 +PcDNA3.1 /DAX-L262R 11,76±2,32 PcDNA3.1 + pcDNA3.1/SF-l+pcDNA3.1/ DAX- L295R 14,30±3,93 PcDNA3.1 + PcDNA3.1 /SF-1 +PcDNA3.1 /DAX-Y380X 7,18±1,23 PcDNA3.1 + PcDNA3.1 / SF-1 +PcDNA3.1 /DAX-L386H 10,70±3,40 PcDNA3.1 + pcDNA3.1/SF-l+pcDNA3.1/ DAX-X471К 7,47±1,49 PcDNA3.1 1 PcDNA3.1 + PcDNA3.1/SF-l 19,17±0,04 PcDNA3.1 + PcDNA3.1/SF-1-R35D 7,95±0,29 PcDNA3.1 + PcDNA3.1/SF-1-R35E 8,89±0,43 дикого типа и пяти мутантных вариантов (L262R, L295R, Y380X, L386H и X471K), обнаруженных у больных с врожденной гипоплазией надпочечников. Установлено, что все пять мутантных вариантов подавляют SF-1-зависимую активность промотора StAR в меньшей степени, чем DAX1 дикого типа (таблица), что коррелирует с результатами клинических исследований. Идентифицирована новая мутация GGC->GAC (R35D) в гене SF-1, приводящая к дисгенезии гонад и надпочечниковой недостаточности. Она затрагивает тот же кодон, что и классическая мутация GGC->GAA (R35E), описанная в работе [2]. Аминокислотный остаток R35 расположен в 1-м цинковом пальце белка SF-1 и его замена на другие аминокислоты влияет на ДНК-связывающую активность SF-1. Обе мутации сильно снижают транскрипциюнную активность SF-1 (таблица). Замены нуклеотидов GGC>GAA и GGC>GAC расположены в начале экзона 3 гена SF-1 и соседствуют с интрон-экзонной границей, поэтому мы проверили также влияние этих замен на сплайсинг. Анализ продуктов сплайсинга после трансфекции клеток HEK293 не выявил различий в характере сплайсинга минигена дикого типа и мутантных минигенов. Выводы. Результаты функционального анализа мутаций в генах DAX1 и SF-1, полученные с использованием системы экспрессии репортерного гена люциферазы в культивируемых клетках HEK293, хорошо соответствуют клиническим данным.

A S Orekhova

Email: anna.s.orekhova@gmail.com

N Yu Kalinchenko

A N Tyul'pakov

P M Rubtsov

  1. Zanaria E., Muscatelli F., Bardoni B. et al. An unusual member of the nuclear hormone receptor superfamily responsible for X-linked adrenal hypoplasia congenital // Nature.- 1994.- Vol. 372.- P. 635-641.
  2. Achermann J. C., Ito M., Hindmarsh P. C., Jameson J. L. A mutation in the gene encoding steroidogenic factor-1 causes XY sex reversal and adrenal failure in humans // Nature Genetics.- 1999.- Vol. 22.- P. 125-126.
  3. Köhler B., Lin L., Ferraz-de-Souza B., Wieacker P.et al. Five novel mutations in steroidogenic factor 1 (SF1, NR5A1) in 46,XY patients with severe underandrogenization but without adrenal insufficiency // Hum. Mutat. - 2008.- Vol. 29, № 1.- P. 59-64.
  4. Lin L., Gu W. X., Ozisik G. et al. Analysis of DAX1(NR0B1) and steroidogenic factor-1 (SF1/Ad4BP, NR5A1) in children and adults with primary adrenal failure: Ten years’ experience // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 2006.- Vol. 91.- P. 3048-3054.
  5. Орехова А. С., Рубцов П. М. DAX1 - необычный представитель суперсемейства ядерных рецепторов с разнообразными функциями / / Молекулярная биология.- 2015.- Т. 49, № 1.- С. 75-88.
  6. Тюльпаков А. Н., Калинченко Н. Ю. Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика 10 случаев врожденной гипоплазии надпочечников, обусловленной дефектами фактора DAX1 / / Проблемы эндокринологии.- 2010.- № 2.- C. 3-7.

Views

Abstract - 14

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2016 Orekhova A.S., Kalinchenko N.Y., Tyul'pakov A.N., Rubtsov P.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies