KhARAKTERISTIKA ANTIGENNOY I GENETIChESKOY IZMENChIVOSTI IZOLYaTOV RSV, VYDELENNYKh V g. SANKT-PETERBURGE

Abstract



Введение. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) является одной из оновных причин госпитализации детей, особенно первых двух лет жизни. В настоящее время в мировой вирусологии большое внимание уделяется исследованиям изменчивости РСВ, что обусловлено пониманием практической важности изучения механизмов эволюции данного патогена. Исследования в области молекулярной эпидемиологии свидетельствуют о генетической и антигенной вариабельности вируса. Циркулирующие вирусы в зависимости от особенностей взаимодействия с вирусспе-цифичными моноклональными антителами (МКА) отне сены к двум антигенным группам (А и В), которые подразделяются на множество генетических вариантов. В литературе имеются данные о связи клинических проявлений РСВ-инфекции (РСВИ) с группой и/или генотипом вызывающего ее вируса [1, 2]. Целью настоящего исследования являлась характеристика антигенной и генетической изменчивости изолятов РСВ, выделенных в г. Санкт-Петербурге. Материалы и методы исследования. Для выделения РСВ в культуре клеток МА-104 использовали ПЦР-положительные клинические материалы (назаль 164 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 4 ные мазки). Для определения групповой (А/В) принадлежности изолятов РСВ с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени были выбраны следующие праймры и зонды: а) для выявления РСВ-А: AGATCAACTTCTGT-CATCCAGCAA (прямой), TTCTGCACATCATAAT-TAGGAGTATCAAT (обратный), CACCATCCA-ACGGAGCACAGGAGAT (зонд); б) для выявления РСВ-В: GGCTGAATCATTTC-CTCACATCATG (прямой), CTTCTACCATTCAAG-CAATGACCTCTAAT (обратный), TTACATAAAA-ACCTCAAGTATCACAATCAAACACTAAATCGA-CA (зонд). При секвенировании гена F-белка РСВ-А использовались следующие праймеры: TGTAAAACGACG- GCCAGTGGGGCAAATAACAATGGAGTT(прямой), CAGGAAACAGCTATGCATTGTAAGAACATGAT-TAGGTGCT (обратный). Антигенный анализ изолятов РСВ проводили методом микрокультурального ИФА (мк-ИФА) с использованием панели из 6 МКА (9С5, RS-25, 4F2, 5F3, 5H8, 1H3), разработанных в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа. Для этого моно-слойные культуры клеток МА-104, выращенные на 96 -луночных культуральных планшетах, инфицировали РСВ в дозе 100ТИД50. Через 5-10 дней культивирования после развития признаков цитопатогенного действия вируса клетки фиксировали 80% ацетоном. В лунки вносили МКА в концентрации 5-10 мкг/мл. Детекцию связавшихся с вирусом МКА проводили добавлением перок-сидазного конъюгата козьих антител к IgG мыши. После остановки реакции 2Н Н2SO4 и добавления субстратной смеси (0,02% Н2О2 и 0,1 мг/мл 3,3’, 5,5’-тетраметил-бензидин) результат учитывали на спектрофотометре при длине волны 450 нм. Результаты и их обсуждение. По результатам ОТ-ПЦР было показано, что из 73-х изолятов РСВ, выделенных в культуре клеток в 2013-2014 гг., основная масса вирусов (93,2%) относилась к группе А, и только 5 (6,8%) относились к группе В. В 2015-2016 гг. было выделено 30 штаммов: 21 (70%) из группы А, 9 (30%) - из группы В. Для характеристики антигенных свойств изолятов РСВ использовали панель МКА, специфически взаимодействующих (по данным иммуноблоттинга) с вирусным поверхностным гликопротеином F, определенные детерминанты которого индуцируют синтез вирус-нейтрали-зующих антител при РСВИ. Сайты взаимодействия разных МКА с F-белком не перекрываются, что было показано методом конкурентного ИФА с МКА, меченными и немеченными пероксидазой. МКА 5F3 и 5H8 облада ли вирус-нейтрализующей активностью. Все МКА взаимодействовали с референсным РСВ-А (штамм Long) с равной эффективностью. C помощью МКА в мк-ИФА был проведен антигенный анализ 64 штаммов РСВ-А, выделенных в 2013-2014 гг. Показатель эффективности взаимодействия каждого изоля-та с МКА RS-25 был принят за 100%. Снижение связывающей активности других МКА по сравнению с данным показателем свидетельствовало об изменении антигенных свойств F-белка вирусных изолятов. Оценка эффективности взаимодействия с различными МКА позволила разделить штаммы на ряд антигенных подгрупп, отличных от эталонного штамма Long. У 12 штаммов, принадлежащих к трем антигенным подгруппам, было проведено секвенирование гена F-белка. Сравнение результатов секвенирования и мк-ИФА показало, что снижение эффективности взаимодействия конкретного штамма с различными МКА коррелировало с наличием характерных единичных штамм-специфичных аминокислотных замен в F-белке (в сравнении с референс-штаммом Long). Так, замены C367G/W (в сайте, примыкающем к антигенному сайту I, и возможно входящем в него) коррелировали со значительным снижением эффективности взаимодействия с МКА 5H8. Замены N276S/H (позиция, входящая в состав антигенного сайта II), могут приводить к снижению взаимодействия вирусов данной подгруппы с тремя МКА: 5F3, 1H3 и 5H8. Значительное снижение взаимодействия изолятов с МКА 9С5, 1Н3 и 5Н8 может быть связано с наличием замен N276S/H (позиция в антигенном сайте II) и T118A/T122A, что ведет к утрате сайтов потенциального N-гликозилирования. Заключение. Таким образом, анализ F-белка, одного из основных поверхностных гликопротеинов РСВ, выявил значительные различия в генетической структуре и антигенных свойствах данного белка у вирусов, циркулировавших в Санкт-Петербурге в сезон 2013-2014 гг.

E R Petrova

Email: ekaterina.petrova@influenza.spb.ru

A V Fadeev

I V Polyakov

A A Egorova

  1. Characteristics and Their Clinical Relevance of Respiratory Syncytial Virus Types and Genotypes Circulating in Northern Italy in Five Consecutive Winter Seasons / Esposito S., Piralla A., Zampiero A., Bianchini S., Di Pietro G., Scala A., Pinzani R., Fossali E., Baldanti F., Principi N.// PLoS ONE.- 2015.- Vol. 10 (6) - P. 1-14.
  2. Martinello R., Chen M., Weibel C., Kahn J. Correlation between Respiratory Syncytial Virus Genotype and Severity of Illness // The Journal of Infectious Diseases - 2002.- Vol. 186.- P. 839-842.

Views

Abstract - 22

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2016 Petrova E.R., Fadeev A.V., Polyakov I.V., Egorova A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies