MEKhANIZMY AKTIVATsII TIMUSNOGO EPITELIYa POD DEYSTVIEM ROSTOVYKh FAKTOROV

Abstract



Введение. В настоящее время химио-, гормоно- и рентгенотерапия широко применяются для лечения онкологических больных. Данные воздействия вызывают инволюцию тимуса, сопровождающуюся снижением тимопоэза и развитием Т-клеточного иммунодефицита [1, 2]. Ведется поиск фармакологической коррекции подобных нарушений, к которым также относится повреждение тимусного эпителия. Для стимуляции эпителиального компартмента применяют фактор роста гепатоцитов (HGF) и фактор роста кератиноцитов (KGF). Предполагают, что оба эти фактора способны стимулировать пролиферацию эпителия тимуса [1, 2], однако механизм их действия до конца не ясен. Целью нашей работы было изучение влияния HGF и KG F на пролиферацию эпителиальных клеток и экспрессию в них ангиогенного фактора, необходимого для восстановления сосудистой сети тимуса. Материалы и методы исследования. Клеточные линии кортикального (TEC1-2 и медуллярного mTEC3-10 эпителия тимуса мыши были любезно предоставленны нам профессором M. Kasai из Токийского университета [3]. Метод обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) использовали для изучения экспрессии мРНК фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) и рецептора HGF - c-Met, как описано ранее [4]. Для изучения c-Met использовали прямой 5'tgccagagacatgtacgataaag3' и обратный 5'atggcaacagaga-aggatatgg3' праймеры (размер продукта 437 нп). В качестве гена сравнения использовали ß -актин. Проточную цитофлуориметрию использовали для определения поверхностной экспрессии c-Met на клетках эпителия с помощью моноклональных антител анти-c-Met-PE (eBioscience) и соответствующего изотипиче-ского контроля. Клетки снимали со дна флакона аккута-зой. Обработку данных проводили при помощи программы Kaluza™ v.1.3 (Beckman Coulter). Для оценки влияния HGF и KGF на пролиферацию эпителиальные клетки культивировали в течение 72 ч в присутствии исследуемых факторов и использовали три метода: c добавлением тетразолиевого реагента WST-1 (Roche), выявляющего количество метаболически активных клеток [1]; с окрашиванием монослоя клеток 0,05% метиленовым синим и путем подсчета числа клеток в камере Горяева. Полученные результаты были статистически обработаны с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты и их обсуждение. В начале мы изучили, способны ли исследуемые нами клеточные линии экспрессировать рецептор HGF. С помощью ОТ-ПЦР мы обнаружили экспрессию мРНК c-Met в клетках обеих линий cTEC1-2 и mTEC3-10. Используя проточную цитофлуориметрию выявили 2,5% c-Met+ клеток среди cTEC1-2 и 12% среди mTEC3-10. Эти данные подтверждают результаты иммуногистохимического анализа [5]. Согласно данным литературы на эпителии тимуса мыши присутствует рецептор KG F - FGFR2IIIb [6]. Далее мы исследовали влияние KGF и HGF на пролиферативную активность эпителиальных клеток тимуса. При использовании WST-теста было показано, что HGF дозозависимо увеличивает метаболическую активность как кортикальных cTEC1-2, так и медуллярных mTEC3-10 эпителиальных клеток тимуса с максимальным эффектом при концентрации HGF 10 нг/мл (для cTEC1-2: 1,48±0,29 в контроле и 1,63±0,022 в опыте, p<0,05; для mTEC3-10: 2,03±0,04 в контроле и 2,49±0,10 в опыте, p<0,05; n=12). KGF, в отличие от HGF, стимулировал метаболическую активность только в клетках mTEC3-10 (0,74±0,01 в контроле и 0,87±0,02 в присутствии 100 нг/мл KGF, p<0,01; n=12). Результаты WST-теста были полностью подтверждены другими методами - путем окрашивания метиленовым синим и визуальным подсчетом клеток. При изучении экспрессии мРНК VEGF было показано, что HGF (10 нг/мл) не оказывал влияния как на (TEC1-2, так и на mTEC3-10 клетки, а KGF (100 нг/мл) стимулировал ее только в клетках mTEC3-10 (0,36±0,05 у.е. в контроле и 0,61 ±0,01 у.е. в опыте, p<0,01; n=4), не оказывая влияния на клетки (TEC1-2. Данные о стимулирующем влиянии HGF на пролиферативную активность клеток линии cTEC1-2 и mTEC3-10 получены нами впервые и согласуются с результатами, полученными на другой линии кортикальных ретикулярных клеток эпителия тимуса CRECs [1]. Нами было впервые показано, что KGF стимулирует пролиферацию и экспрессию мРНК VEGF только в медуллярных клетках. Однако по данным литературы введение KG F взрослым мышам стимулирует как кортикальные, так и медуллярные клетки [6]. Данные различия, возможно, связаны с неонатальным происхождением исследуемых нами клеточных линий. Таким образом, механизм стимулирующего действия KGF и HGF различается, как по их влиянию на кортикальные и медуллярные клетки эпителия тимуса, так и по их воздействию на пролиферативную активность и синтез VEGF.

K V Rutto

Email: krispins-90@mail.ru

I V Kudryavtsev

E P Kiseleva

  1. Jung W.-S., Han S.-M., Kim S.-M. et al. Stimulatory effect of HGF-overexpressing adipose tissue-derived mesenchymal stem cells on thymus regeneration in a rat thymus involution model // Cell. Biol. Int.- 2014.- Vol. 38.- P. 1106-1117.
  2. Erickson M., Morkowski S., Lehar S. et al. Regulation of thymic epithelium by keratinocyte growth factor // Blood.- 2002.- Vol. 100.- P. 3269-3278.
  3. Kasai M., Mizuochi T. Culture and characterization of thymic epithelial cell lines // Meth. Mol. Biol.- 2007.- Vol. 380.- P. 107-123.
  4. Степанова О. И., Крылов А. В., Людыно В. И., Киселева Е. П. Экспрессия генов VEGF-A и VEGF-C и их рецепторов в лимфоцитах и макрофагах мышей / / Биохимия.- 2007.- Т. 72, № 11.- С. 1468-1473.
  5. Imado T., Iwasaki T., Kataoka Y. et al. Hepatocyte growth factor preserves graft-versus-leukemia effect and T-cell reconstitution after marrow transplantation // Blood.- 2004.- Vol. 104.- P. 1542-1549.
  6. Rossi S., Jeker L., Ueno T. et al. Keratinocyte growth factor (KGF) enhances postnatal T-cell development via enhancements in proliferation and function of thymic epithelial cells // Blood.- 2007.- Vol. 100.- P. 3803-3811.

Views

Abstract - 22

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2016 Rutto K.V., Kudryavtsev I.V., Kiseleva E.P.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies