POLUChENIE KLETOK OBONYaTEL'NOY VYSTILKI ChELOVEKA, PREDPOLAGAEMYKh DLYa ISPOL'ZOVANIYa V KLETOChNOY TERAPII POSTTRAVMATIChESKIKh KIST SPINNOGO MOZGA

Abstract



Введение. Существующие хирургические и медикаментозные методы лечения посттравматических кист спинного мозга часто оказываются малоэффективными. В качестве перспективного направления для восстановления утраченной нервной ткани рассматривается клеточная терапия. Обонятельная выстилка (ОВ) человека является потенциальным источником аутологичных клеток для клеточной терапии посттравматических повреждений спинного мозга [1]. Накоплено большое количество экспериментальных данных об использовании этих клеток для терапии травм спинного мозга как в острой, так и в хронической фазах [2]. Однако практически нет данных об использовании клеток ОВ для лечения посттравмати-ческих кист спинного мозга. Для клеточной терапии наиболее перспективными считаются нейральные стволо-вые/прогениторные клетки (НСПК) обонятельного эпителия, поскольку они способны дифференцироваться в зрелые нейроны [3], а также обкладочные клетки (ОК) из собственной пластинки эпителия ОВ, поскольку они создают микроокружение для нейронов, способствуют росту аксонов и ремиелинизации нервных волокон [4]. Для применения этих клеток в клеточной терапии необходимо разработать оптимальный, хорошо воспроизводимый протокол. Цель исследования: разработать оптимальный протокол для получения клеток ОВ человека, предполагаемых для использования в клеточной терапии посттравматиче-ских кист спинного мозга. Испытуемые, материалы и методы. В исследовании были использованы образцы ОВ, полученные из верхних и нижних носовых ходов у 13 пациентов при плановом хирургическом вмешательстве в Отделении пластической хирургии У КБ № 1. Все пациенты дали своё согласие на участие в данной научной работе. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом РНИМУ им. Н. И. Пирогова. Площадь образцов ОВ составляла 5-25 мм2 (суммарно). Нами были оптимизированы методы получения первичной культуры и дальнейшего культивирования клеток из ОВ человека. НСПК выявлялись методом иммунофлуоресценции по одновременной экспрессии маркера стволовых клеток Sox-2 и маркера ранней нейральной дифференциров-ки nestin. ОК выявлялись по коэкспрессии маркера GFAP (кислого глиального фибриллярного белка) и p75NTR (низкоаффинного рецептора фактора роста нервов). Результаты и их обсуждение. Разработаны оптимальные протоколы получения и культивирования 1) НСПК из обонятельного эпителия ОВ и 2) ОК из собственной пластинки эпителия ОВ. Для получения культуры НСПК на первом этапе проводили культивирование обонятельного эпителия в среде DMEM/F12 + L-glutamine + 10% FBS + 1% anti-anti + 1% gentamicine в течение 5-7 дней до образования монослоя. Методом иммунофлуоресценции в обонятельном эпителии ОВ были выявлены НСПК по коэкспрессии nestin и Sox-2. На втором этапе полученные клетки культивировали в бессывороточной среде DMEM/F12+L-glutamine+1% anti-anti+1% gentamici-ne+1% ITS+EGF+FGF на чашках, покрытых poly-L-lys, в течение 4-5 дней. В результате были получены нейросферы, состоявшие из НСПК. Для получения культуры ОК наиболее предпочтительным оказалось культивирование в среде DMEM/F12+L-glutamine+10% FBS+1% ITS+1% anti-anti+1% gentamicine на чашках, покрытых poly-L-lys. ОК были выявлялены по коэкспрессии маркера G FAP и p75NTR. В многочисленных работах с использованием различных типов клеток: эмбриональных стволовых клеток, индуцированных плюрипотентных клеток, мезенхимальных стволовых клеток, Шванновских клеток и др. были получены положительные результаты с восстановлением сенсорной и моторной функций спинного мозга. Однако использование некоторых их них связано с определёнными методическими и этическими проблемами, применение некоторых типов клеток малоэффективно или приводит к возникновению побочных эффектов. Получение ОВ является процедурой доступной и безопасной для пациентов, а клетки ОВ являются тканеспецифичными и аутологичными, т.к. они могут быть получены от пациента с травмой спинного мозга, и после наращивания в культуре и направленной дифференциров-ки трансплантированы тому же пациенту. Такие преимущества клеток ОВ делают их наиболее перспективными и открывают широкие возможности их применения в клеточной терапии посттравматических кист спинного мозга. Заключение. Показано, что в ОВ человека присутствуют НСПК и ОК. После наращивания клеток ОВ в культуре и направленной дифференцировки получены культуры НСПК и ОК. Разработанные оптимальные протоколы получения и культивирования НСПК и ОК из ОВ человека воспроизводимы, и будут использованы нами в дальнейшем для изучения терапевтического эффекта на посттравматические кисты спинного мозга.

A D Voronova

Email: nastyanastyav@mail.ru

O V Stepanova

A V Chadin

G K Biryukova

I V Reshetov

V P Chekhonin

  1. Human adult olfactory neural progenitors promote axotomized rubrospinal tract axonal reinnervation and locomotor recovery /Xiao M., Klueber K. M., Guo Z., Lu C., Wang H., Roisen F. J. // Neurobiol. Dis.- 2007.- Vol. 26, № 2.- P. 363-374.
  2. Li J., Lepski G. Cell transplantation for spinal cord injury: a systematic review // Biomed. Res. Int.- 2013.- Vol. 2013.- Art. ID 786475.- 32 pp.
  3. Mackay-Sim A. Stem cells and their niche in the adult olfactory mucosa // Arch. Ital. Biol.- 2010.- Vol. 148, № 2.- P. 47-58.
  4. Ramon-Cueto A., Avila J. Olfactory ensheathing glia: properties and function / / Brain Res. Bull.- 1998.- Vol. 46, № 3.- P. 175-187.

Views

Abstract - 27

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2016 Voronova A.D., Stepanova O.V., Chadin A.V., Biryukova G.K., Reshetov I.V., Chekhonin V.P.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies