RAZRABOTKA, SINTEZ I IZUChENIE BIOLOGIChESKOY AKTIVNOSTI PROLIN-BOGATYKh PEPTIDOV SEMEYSTVA BAKTENETsINOV

Abstract



Full Text

Введение. Антимикробные пептиды (АМП) - природные молекулы, содержащиеся в клетках системы врожденного иммунитета и играющую важную роль в защите организма человека и животных от инфекций. В настоящее время остро стоит проблема борьбы с бактериями, выработавшими резистентность к применяемым в медицине лекарственным препаратам, что определяет актуальность поиска принципиально новых антибиотических средств. АМП могут стать основой для разработки лекарственных препаратов нового поколения. Одним из главных препятствий практического применения АМП является их недо- статочно высокая селективность - повреждающему действию пептидов могут подвергаться не только бактерии, но и собственные клетки макроорганизма. Для преодоления этой проблемы проводится изучение путей направленной модификации молекул, позволяющее создавать синтетические аналоги АМП с оптимизированными для практического применения свойствами. Целью работы являлось сравнительное изучение биологической активности структурных аналогов природного пролин-богатого линейного пептида семейства бактене-цинов - ChBac3.4. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 4 217 Методы. Пептиды получены твердофазным методом с использованием Fmoc/tBu-стратегии на 2-хлортритил-хлоридной смоле. Наращивание пептидной последовательности проводилось в автоматическом синтезаторе Symphony X (Protein Technologies, Inc.). Для временной защиты а-аминогрупп аминокислот применялась Fmoc-защита. Активация проводилась in situ под действием HCTU/N-этилморфолин в среде диметилформамида (ДМФ). Аминокислотная последовательность отщеплялась с полимера с одновременным удалением всех защитных групп под действием трифторуксуной кислоты с добавками H2O/Tis (триизопропилсилан). Пептиды были очищены с помощью обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) и высушены. Чистота полученных пептидов была не менее 95%, что подтверждалось с помощью аналитического электрофореза, ОФ-ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа (MALDI TOF). Антимикробную активность аналогов бактенецина ChBac3.4 определяли с помощью метода серийных разведений в жидкой питательной среде [1]. Влияние пептидов на проницаемость цитоплазматической мембраны бактерии E.coli ML35p для хромогенных маркеров исследовали по методике [2]. Гемолитическую активность в отношении эритроцитов человека оценивали, как описано [1], цитотоксичность для культивируемых клеток человека - с применением МТТ-теста [3]. Результаты и обсуждение. Объектом исследования послужил пролин-богатый антимикробный пептид лейкоцитов домашней козы ChBac3.4: RFRLPFRRPPI-RIHPPPFYPPFRRFL-NH2 [4]. Этот пептид проявляет высокую антимикрбную активность, а также некоторые цитотоксические свойства в отношении клеток млекопитающих. В задачи работы входило исследование особенностей структуры пептида и выявление их значимости для проявления его биологической активности. Синтезирован пептид, имеющий идентичную природному бактенецину ChBac3.4 аминокислотную последовательность - антимикробный пептид 1 (АП1), два N-концевых фрагмента ChBac3.4 - с 1 по 14 аминокислотный остаток - АП2 и с 1 по 19 - АП3, а также пептид, имеющий модификацию в участке с 12 по18 аминокислотный остаток - АП4. Показано, что все исследованные пептиды обладают антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий Escherichia coli ML35p, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Acinetobacter baumannii (клинический изолят) и грамположительной бактерии Staphylococcus aureus SG-511. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) для АП1 составляли 0,5-4 мкМ; АП2 - 0,5-8 мкМ; АП3 - 4-16 мкМ; АП4 - 14 мкМ. Было установлено в отношении способности пеп тидов нарушать барьерную функцию бактериальных мембран, что только пептиды АП1 и АП4 вызывают увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны для маркерных молекул, пептиды АП2 и АП3 оказались неэффективными (пептиды применяли в концентрациях, в 2 раза превышающих МИК). Исследуемые АМП не проявляли гемолитической активности на эритроциты человека в диапазоне концентраций 1-64 мкМ. По данным МТТ-теста пептиды АП1 и АП4 оказывали цитотоксическое действие in vitro в отношении клеток линии К-562 (клетки эритромиелоидного лейкоза человека) - 50% ингибирующие концентрации (ИК50) составили 13,9 и 7,0 мкМ, соответственно. АП2 и АП3 имели значительно более низкие показатели (ИК50 - 33 и 28 мкМ, соответственно). Заключение. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что N-концевые области пептида важны для реализации его антибактериальных свойств, но не цитотоксической активности для эукариотических клеток, в то время как модификации участка молекулы 12-18, могут приводить к повышению цитотоксической активности аналогов ChBac3.4. Полученные данные содержат информацию об особенностях структуры бактенецина, важных для проявления его антимикробной активности и цитотоксических свойств. Продолжение исследований аналогов данного пептида позволит выяснить возможность повышения селективности антимикробного и противоопухолевого действия этих веществ, что может стать основой для разработки новых лекарственных средств.

About the authors

P M Kopeykin

Email: pmkopeikin@mail.ru

T A Luk'yanova

D S Orlov

B L Mil'man

A Yu Artamonov

O V Shamova

References

  1. Antibacterial peptide protocols / Ed. by W. Shafer.- Totowa, N.J.: Humana Press Inc., 1997.- 250 р.
  2. Артамонов А. Ю., Шамова О. В., Кокряков В., Орлов Д. С. Фото- и флюориметрические методы оценки проницаемости мембран E.coli ml-35p// Вестник Санкт-Петербургского университета. - 2008.- Сер. 3, №. 2.- С. 139-142.
  3. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays// Journal of Immunological Methods.- 1983.- Vol. 65.- P. 55-63.
  4. ChBac3.4: A Novel Proline-Rich Antimicrobial Peptidefrom Goat Leukocytes / Shamova O., Orlov D., Stegemann C., Czihal P., Hoffmann R., Brogden., Kolodkin N., Sakuta G., Tossi A., Sahl S., Kokryakov V., Lehrer R. // Int. J. Pept. Res. Ther.- 2009.- Vol. 15.- P. 107-119.

Statistics

Views

Abstract - 50

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2016 Kopeykin P.M., Luk'yanova T.A., Orlov D.S., Mil'man B.L., Artamonov A.Y., Shamova O.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies