IDENTIFIKATsIYa I FUNKTsIONAL'NYY ANALIZ NOVOY MUTATsII V GENE FAKTORA TRANSKRIPTsII KLF11, VYZYVAYuShchEY DIABET MODY

Abstract



Full Text

Введение. MODY (maturity onset diabetes of the young) - сахарный диабет взрослого типа у молодых, представляющий собой гетерогенную группу наследственных заболеваний, обусловленных дефектами в функционировании ß -клеток поджелудочной железы и характеризующихся аутосомно-доминантным типом наследования [1]. Изучение моногенных форм диабета имеет большое значение для выяснения генетических основ развития такого многофакторного заболевания, как сахарный диабет 2 типа. На данный момент выделяют 13 форм MODY, которые обусловлены мутациями в различных генах. В настоящей работе идентифицирована новая мутация в гене транскрипционного фактора KLF11. Данный фактор транскрипции участвует в регуляции инсулинового промотора в ß -клетках поджелудочной железы, но для функционирования KLF11 необходимо наличие дополнительных факторов - p300 и PDX-1. Фактор p300 является коактиватором и одновременно связующим звеном между KLF11 и PDX-1, т. к. прямого взаимодействия между этими белками не обнаружено [2]. У пациентов с MODY7 ранее была найдена мутация Ala347Ser, изменяющая активность транскрипционного фактора KLF11 [3]. Данная мутация затрагивает эволюционно консервативный домен TRD3, участвующий в различных белок-белковых взаимодействиях. Мутация Ala347Ser влияет на метаболизм клетки, и может являться причиной уменьшения секреции инсулина [4]. В ходе секвенирования генома у больного с симптомами MODY была обнаружена новая мутация c. 1231 A ^ G (Asn357Ser) в гене транскрипционного фактора KLF11. Эта мутация, по данным биоинформатического анализа, может влиять на сплайсинг пре-мРНК. Цель исследования: охарактеризовать новую мутацию c.1231 A ^ G (Asn357Ser) в гене транскрипционного фактора KLF11. Материалы и методы. Для проверки влияния новой мутации на сплайсинг пре-мРНК нами был сконструирован миниген KLF11, содержащий 3-й и 4-й экзоны и расположенный между ними 3-й интрон. При этом, в 3-й экзон с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза была введена замена c.1231 A ^ G. Далее с использованием системы временной экспрессии минигена KLF11 в клетках HEK293 мы проанализировали влияние замены c.1231 A ^ G на сплайсинг пре-мРНК. Поскольку обнаруженная мутация приводит также к замене аминокислоты в домене TRD3, следующей задачей было оценить влияние мутации на взаимодействие KLF11 с другими белками. Для этого нами были получены конструкции, содержащие кДНК KLF11 дикого типа (pcDNA3. 1 -KLFwt), с известной мутацией Ala347Ser, описанной в литературе (pcDNA3.1-KLF347), с новой мутацией Asn357Ser (pcDNA3.1-KLF357), а также содержащие ДНК инсулинового промотора, встроенную в вектор pGL3-basic и кДНК белков-партнеров KLF11 - pcDNA3.1-PDX-1 и pCMV-p300. Результаты и их обсуждение. Нами было показано, что замена, обнаруженная у пациента, не приводит к появлению продуктов сплайсинга пре-мРНК, отличных от дикого типа. После котрансфекции клеток HEK293 плазмидой, содержащей репортерный ген люциферазы под контролем инсулинового промотора, и разными комбинациями плазмид, обеспечивающих экспрессию белков р300, PDX-1, KLF11 и его мутантных вариантов, мы установили, что инсулиновый промотор проявляет активность в клетках HEK293. Каждый из исследованных факторов транскрипции по отдельности незначительно повышает уровень экспрессии гена люциферазы. При одновременной экспрессии р300 и KLF11, как дикого типа, так и мутантных вариантов Ala347Ser или Asn357Ser, увеличение активности промотора было несколько выше. Использование KLF11 или его мутантных вариантов в комбинации с р300 и PDX-1 значительно повышало активность инсулинового промотора. Заключение. Мы подтвердили данные об активации инсулинового промотора в клетках HEK293 под действием KLF11 в комбинации с р300 и PDX-1. Однако различий в активности промотора в присутствии KLF11 дикого типа и двух мутантных вариантов мы не выявили. Таким образом, вопрос о возможной роли мутации Asn357Ser в раз МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2016 г., ТОМ 16, № 4 221 витии MODY остается открытым. Для его решения необходимо использование других клеточных систем.

About the authors

T S Krasnova

Email: tkrasnova24@mail.ru

A S Orekhova

N A Zubkova

A N Tyul'pakov

P M Rubtsov

References

  1. Bell J., Wainscoat J. Maturity onset diabetes of the young is not linked to the insulin gene // Br. Med. J.- 1983.- Vol. 286, № February.- P. 590-592.
  2. Perakakis N., Danassi D., Alt M. et al. Human Krüppel-like factor 11 differentially regulates human insulin promoter activity in β-cells and non-β-cells via p300 and PDX1 through the regulatory sites A3 and CACCC box // Mol. Cell. Endocrinol.- 2012.- Vol. 363, №№ 1-2.- P. 20-26.
  3. Neve B., Fernandez-Zapico M., Ashkenazi-Katalan V. et al. Role of transcription factor KLF11 and its diabetes-associated gene variants in pancreatic beta cell function // Proc. Natl Acad. Sci. USA.- 2005.- Vol. 102, № 13.- P. 4807-4812.
  4. Lomberk G., Grzenda A., Mathison A. et al. Krüppel-like factor 11 regulates the expression of metabolic genes via an evolutionarily conserved protein interaction domain functionally disrupted in maturity onset diabetes of the young // J. Biol. Chem.- 2013.- Vol. 288, № 24.- P. 17745-17758.

Statistics

Views

Abstract - 32

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2016 Krasnova T.S., Orekhova A.S., Zubkova N.A., Tyul'pakov A.N., Rubtsov P.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies