APPLICATION OF DIFFERENT FLUORESCENT DYES FOR THE CELL NUCLEUS STAINING IN A FIXED BIOLIDGICAL MATERIAL

Abstract


Fluorescent nuclear dyes are widely applicable to cell nucleus staining in various tissues. Application of dye for concrete research is serious problem and it is necessary to consider a number of parameters, such as extent of chromatin condensation in studied cells, method of tissue fixation etc. Features of fluorescent staining were studied for cells of various tissues fixed in zinc-ethanol-formaldehyde, 10% neutral formalin, Bouin’s fluid. The optimal staining protocol was developed for each fluorescent dye. Each protocol considers some features of used dye and method of material processing. The possibility of effective combination of nuclear fluorescent staining with immunofluorescent methods was also shown.

Введение. В современной клеточной биологии широко применяются иммунофлуоресцентные методы окраски тканей и флуоресцентная микроскопия. Применение лазерной конфокальной микроскопии для объектов, подвергшихся флуоресцентной окраске, позволяет с высокой точностью определять внутриклеточную локализацию специфических молекул и различных органелл, а также дает возможность производить трехмерную реконструкцию исследуемых объектов [1]. Для селективного окрашивания клеточных структур используют флуоресцентные красители - флуоресцирующие органические соединения, обладающие способностью взаимодействовать с различными компонентами клетки. Важнейшими среди них являются вещества, избирательно связывающиеся с нуклеиновыми кислотами (НК),- ядерные флуоресцентные красители. Существует и другой класс веществ, относящихся к флуорохромам, которые не способны связываться с тканевыми элементами [2]. Они используются для маркировки антител, применяемых в иммуноцитохимии и проточной цитометрии [3]. Флуоресцентные ядерные красители используются при флуоресцентной и лазерной конфокальной микроскопии для подкрашивания ядер клеток после проведения иммуноцитохимической реакции [4]. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 2 35 Кроме того, такие красители могут быть использованы для решения самостоятельных задач при изучении изменений структуры клеточного ядра (при пролиферации и клеточной гибели - апоптозе) [5, 6]. Количество синтезированных и применяемых в настоящий момент флуоресцентных красителей, селективно связывающихся с ДНК и РНК, насчитывает не один десяток субстанций, которые обладают различными свойствами: избирательностью, своеобразными спектральными характеристиками и нуждаются в определенных условиях для флуоресценции (например, pH среды). Ядерные флуоресцентные красители могут быть использованы в сочетании с иммунофлюоресцентными методами двойного и тройного окрашивания тканевых элементов [7-9]. При выборе флуоресцентного ядерного красителя необходимо учитывать волновые параметры его возбуждения и флуоресценции, а также квантовый выход, в значительной степени определяющий интенсивность флуоресценции. На практике оказывается, что интенсивность флуоресценции существенно зависит от степени конденсации хроматина изучаемых клеток, селективности связывания реагента с НК и качества пробоподготовки (тип фиксатора, способ фиксации, продолжительность обработок). Таким образом, при наличии большого количества флуоресцентных красителей и разнообразных факторов, определяющих качество проводимой окраски, возникает необходимость в унификации подходов, применяемых при флуоресцентной окраске ядер клеток, а если это невозможно, то для каждого конкретного случая необходимо вновь отрабатывать методику флуоресцентного окрашивания гистологических препаратов. Цель настоящей работы состояла в изучении возможности получения оптимальных результатов флуоресценции ядер клеток различных тканей в гистологических срезах при окраске с использованием четырех ядерных красителей, способных избирательно связываться с нуклеиновыми кислотами и обладающих флуоресценцией в различных областях видимой части спектра, а также в проверке пригодности отработанных протоколов окраски для применения совместно с иммуноцитохимическими реакциями. Материалы и методы исследования. Для исследования были выбраны следующие флуоресцентные красители: 4’,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), SYTOX Green, 7-аминоактиномицин D (7-AAD) и пропидия йодид (PI) (Invitrogen, USA). DAPI - ядерный краситель, флуоресцирующий в синем диапазоне. Наиболее часто ядерную ДНК идентифицируют с помощью DAPI, который избирательно взаимодействует с A-T участками двухцепочечной ДНК. Является неинтеркалирующим кра сителем, локализующимся в малом желобке ДНК, и проникает через мембрану живых клеток [10]. SYTOX Green - ядерный краситель, флуоресцирующий в зеленом диапазоне. Представляет собой непроникающий цианиновый краситель, который наиболее часто применяется для выявления НК в фиксированных образцах клеток и тканей, а также бактерий. SYTOX Green обладает высоким сродством к нуклеиновым кислотам и легко проникает в клетки с нарушенной цитоплазматической мембраной. Является малоселективным к какой-либо нуклеотидной последовательности и не взаимодействует с цитоплазматической РНК [11, 12]. PI и 7-AAD - ядерные красители, флуоресцирующие в красном диапазоне. Пропидия йодид - ин-теркалирующий непроникающий краситель. Поскольку область связывания PI с молекулой НК лежит в области нуклеотидной пары гуанин и цитозин [9], то краситель также способен взаимодействовать с двухцепочечными участками РНК [13]. 7-AAD - флуоресцентный интеркалятор, избирательно взаимодействующий с GC-нуклеотидной парой [14]. Показано, что 7-AAD связывается преимущественно в области расплетенных участков ДНК и плохо проникает через мембраны живых клеток [11, 15]. Для отработки окраски флуоресцирующими красителями использовались следующие биологические материалы, полученные из архива Отдела общей и частной морфологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН: парафиновые срезы (3-10 мкм) спинного мозга эмбриона крысы и взрослой крысы и легких половозрелых крыс-самцов, головного мозга крысы, парааортального лимфатического узла и сердца человека. Материал фиксировали в растворе 10% нейтрального формалина, цинк-этанол-формальдегиде и жидкости Буэна по описанным ранее методикам [7]. Часть срезов после стандартной процедуры де-парафинирования и регидратации подвергали тепловой обработке в модифицированном цитратном буфере S1700 (Dako, Дания). Далее наносили флуорохромы и инкубировали в течение определенного времени (данные представлены в табл. 1). После этого промывали полученные срезы в буфере и заключали в 10% глицерин. Для изучения влияния гидрофобной среды на флуоресценцию препараты после просмотра и фотографирования перезаключали в Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, USA). Препараты исследовали под микроскопом Leica DM2500, оснащенным системой фильтров флуоресценции от 340 до 560 нм, фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры Leica DР-480 (Германия). В комплект блок системы фильтров входили: возбуждающий фильтр ВР=340-380 нм 36 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 2 (первый - «А»); возбуждающий фильтр ВР=450-490 нм (второй - «I3»); возбуждающий фильтр ВР=515-560 нм (третий - «N2,1»). Для проверки возможности использования ядерных флуоресцентных красителей в сочетании с им- (разведение 1:50, Invitrogen, США) Ядра клеток подкрашивали PI как описано в табл. 1. Препараты заключали в среду Fluorescence Mounting Medium (Dako, Дания). Анализ препаратов и фотосъемку производили на микроскопе Leica DM2500. Таблица 1 Сводная таблица по оптимальным условиям проведения окрашивания ядерными красителями Максимумы Концентрация красителя Краситель Мг, г/моль возбуждения / излучения исходный раствор рабочий раствор Условия инкубации 4‘ ,6-диамидино-2фенилиндол (DAPI) 350.25 г/моль 358/461 нм 180 мкМ 1:100 (0,6 мкг/мл (1,8 мкМ)) 8 мин при 27° С SYTOX Green 249,1 г/моль 504/523 нм 50 мкМ 1:100 (0,6 мкг/ мл (0,5 мкМ)) 40 мин при 27° С Пропидия йодид (PI) 668,4 г/моль 535/617 нм * 0,25 мкг/мл (0,38 мкМ) 15 мин при 27° С 7-аминоактиномицин D(7-AAD) 1270,4 г/моль 546/647 нм 1580 мкМ 1:50 40 мкг/мл (31,6 мкМ) 45 мин при 21° С * Исходный реактив представляет собой сухое вещество (250 мкг). мунофлуоресцентными методами применяли антитела к триптазе тучных клеток (ТК) человека и моноклональные антитела к глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP). Для одновременного выявления ядер клеток и гранул ТК срезы миокарда человека после депарафини-рования, регидратации и тепловой обработки инкубировали с мышиными моноклональными антителами к триптазе (ready to use; Monosan, Нидерланды) в течение 30 мин при температуре 40° С. Для выявления комплекса антиген-антитело после обработки реагентом EnVision+ Labelled Polymer-HRP AntiMouse (Dako, Дания) проводили инкубацию с козьими антителами против HRP, конъюгированными с флуорохромом Cy3 (Cy3-conjugated Goat antihorseradish Peroxidase, Jackson ImmunoResearch, США; разведение 1:100). Ядра клеток подкрашивали SYTOX Green как описано в табл. 1. Препараты заключали в среду Fluorescence Mounting Medium (Dako, Дания). Анализ препаратов и фотосъемку производили на микроскопе Leica DM2500. Для одновременного выявления ядер клеток и ас-троцитов спинного мозга взрослых крыс препараты депарафинировали, инкубировали с мышиными моноклональными антителами к GFAP (клон SPM507) (Spring Bioscience, США; 1:100) в течение 5 суток при температуре 27° С, далее применяли биотинилированные вторичные антимышиные антитела (Donkey anti-mouse biotin) (1:200) в течение 3 часов при температуре 27° С. Для выявления комплекса антиген-антитело использовали стрепта-видин, конъюгированный с флуорохромом Cy2 Результаты и их обсуждение. Результаты проведенного исследования показали, что рекомендуемые производителем концентрации красителей и условия окрашивания не являются оптимальными для гисто- Рис. 1. Применение различных ядерных красителей для окраски срезов разных тканей: а - сердце человека (фиксация в 10% формалине), ядра окрашены Sytox Green; б - головной мозг крысы (фиксация в цинк-этанол-формальдегиде), ядра окрашены 7-AAD; в - парааортальный лимфатический узел (фиксация в жидкости Буэна), ядра окрашены PI; г - спиной мозг эмбриона крысы (фиксация в цинк-этанол-формальдегиде), ядра окрашены DAPI. логических препаратов. В связи с этим был экспериментально осуществлен подбор концентраций флуо-рохромов и условий инкубации, которые обеспечили наилучшую визуализацию ядер клеток (см. табл. 1). Лучшие результаты были получены на срезах, фиксированных в цинк-этанол-формальдегиде (рис. 1). МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 2 37 Все четыре ядерных красителя дали селективную ным окрашиванием тучных клеток свидетельствуют окраску ядер (данные приведены в табл. 2). о том, что введение в протокол этапа окраски ядер Таблица 2 Обобщенные результаты по материалам, фиксированным в различных фиксирующих смесях Флюорохром Материал, фиксированный в цинк-этанол-формальдегиде Материал, фиксированный в 10% формалине Материал, фиксированный в жидкости Буэна без тепловой обработки/с тепловой обработкой 4’,6-диамидино-2фенилиндол (DAPI) +/- +/- SYTOX Green +/+* -/ + Пропидия йодид (PI) +/+* +/ + +/- 7-аминоактиномицин D (7-AAD) +/- ' Результаты после тепловой обработки хорошие, однако уровень флуоресценции по сравнению с окраской не подвергавшегося тепловой обработке аналогичного материала понижен. Тепловая обработка значительно ухудшала визуализацию ядерных элементов, терялась четкость диф-ференцировки ядра и проявлялась флуоресценция цитоплазматических структур и волокон межклеточного вещества. Флуоресценция ядер клеток, полученная на материале, фиксированном в 10% формалине, была достаточна, но практически всегда помимо ядерных структур флуоресцировали окружающие ткани (фон), что значительно ухудшало визуализацию реакции. Наиболее удачными ядерными красителями для данных срезов оказались DAPI и PI, причем четкость визуализации не зависела существенно от того, подвергали ли препарат тепловому воздействию или нет. Гистологические препараты, фиксированные в жидкости Буэна, показали себя как наименее пригодные для флуоресцентной окраски выбранными ядерными красителями. Избирательное окрашивание ядер клеток наблюдалось лишь при использовании пропидия йодида без тепловой обработки. Для всех исследуемых тканей тепловая обработка способствовала снижению интенсивности флуоресценции ядер или приводила к появлению фоновой флуоресценции. После просмотра препаратов, заключенных в глицерин, их обрабатывали этанолом и пропанолом, просветляли в ксилоле и заключали в гидрофобную среду Cytoseal 60 (Richard-Allan Scientific, США). Это проводилось для проверки устойчивости красителей к стандартной процедуре обезвоживания и просветления гистологических препаратов. Выяснилось, что эта обработка приводила к частичному угасанию флуоресценции в большинстве представленных образцов. Наиболее устойчивым к такой обработке оказался PI. Результаты окрашивания препаратов миокарда SYTOX Green в сочетании с иммунофлуоресцентне влияет на результат иммунофлуоресцентного окрашивания. В результате обработки на препаратах миокарда отчетливо выявляются триптаза-позитив-ные тучные клетки с типичной морфологией и четко выраженной гранулярностью (рис. 2). Некоторые клетки демонстрируют признаки частичной дегрануляции, которая выражается в высвобождении части гранул из цитоплазмы клетки в межклеточное пространство. При этом вокруг тучной клетки формируется ареол триптаза-позитив-ных гранул, некоторые из которых располагаются на значительной расстоянии от дегранулирующей клетки. Ядра эндотелиоцитов сосудов, фибробластов соединительной ткани и кардиомиоцитов четко выявляются за счет флуоресценции SYTOX Green. Результаты окраски ядер по селективности и интенсивности сопоставимы с вышеописанными результатами окраски препаратов миокарда SYTOX Green без иммуногистохимической окраски ТК. При этом, как и в случае с моноокраской миокарда SYTOX Green, наблюдается возникновение небольшого фонового окрашивания ткани. Применение пропидия йодида для подкраски ядер клеток не препятствует иммунофлуоресцентному выявлению астроцитов спинного мозга крысы (рис. 2). Положительную реакцию на GFAP проявляют радиально вытянутые волокнистые астроциты, локализованные в белом веществе спинного мозга и клетки звездчатой формы с длинными иммунопозитивными ветвящимися отростками в сером веществе. Четко дифференцируются ядра клеток, окрашенные пропи-дия йодидом, фоновая флуоресценция отсутствует. Известно, что предварительная обработка исследуемых тканей влияет на интенсивность и избирательность окраски флуоресцентными красителями. В результате исследования обнаружено, что наименьшую 38 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 2 интенсивность флуоресценции имели ядра клеток тканей, фиксированных в жидкости Буэна.J.E. Greenlee и соавт. показали, что при проведении флуоресцентного исследования тканей, фиксированных в жидкости Буэна, необходимо предварительное удаление пикри- Рис. 2. Использование флуоресцентных ядерных красителей для подкрашивания ядер клеток после проведения иммуноцитохимичес-кой реакции: а-в - одновременное выявление ядер клеток и астро-цитов в спинном мозге крысы. Ядра клеток окрашены PI (красная флуоресценция), астроциты - моноклональными антителами к GFAP (зеленая флуоресценция); г-е - одновременное выявление ядер клеток и гранул тучных клеток в миокарде человека. Одна стрелка указывает на липофусцин в миокарде (яркая желто-оранжевая флуоресценция), две стрелки указывают на дегранулирующую тучную клетку. Ядра клеток окрашены Sytox Green (зеленая флуоресценция), гранулы тучных клеток - моноклональными антителами к триптазе (красная флуоресценция). новой кислоты [16]. В нашей работе такие срезы подвергались предварительной обработке этанолом, который растворяет пикриновую кислоту. Однако в ходе исследования не удалось добиться селективного выявления ядер клеток. Вероятнее всего, это связано с физико-химическими особенностями пикриновой кислоты, которая способна к обменным реакциям с образованием солей металлов (пикратов), представляющих собой нерастворимые соединения, которые остаются в тканях, несмотря на обработку этанолом. В ходе фиксации биологического материала возможно возникновение флуоресцирующих соединений, такое явление характерно для тканей, фиксированных в растворе 10% формалина, наиболее распространенном фиксаторе. В настоящем исследование показано, что такой материал обладает сильной фоновой флуоресценцией при окраске ядерными красителями. Этот эффект объясняется образованием альдегидов в процессе фиксации, обладающих аутофлуоресценцией. В современной литературе, посвященной применению флуоресцентных маркеров для окраски ядер клеток, широко обсуждается проблема взаимодействия молекул красителя с цитоплазматической РНК [12]. Присутствие такого цитоплазматического окрашивания требует применения РНК-азы. Известно, что 7-AAD и PI не обладают избирательностью по отношению к молекулам ДНК, однако в нашем исследовании не обнаружено значительной цитоплазматической флуоресценции при окрашивании клеток разных тканей (за исключением цитоплазматической флуоресценции на срезах тканей, фиксированных в жидкости Буэна), что может объясняться экстракцией РНК при пробоподготовке. Следовательно, эти красители могут быть использованы при совместном иммуногистохимическом выявлении цитоплазматических антигенов. Единственным недостатком материала, фиксированного в цинк-этанол-формальдегиде, было значительное снижение интенсивности флуоресценции при проведении тепловой обработки всех представленных образцов тканей, что объясняется частичной денатурацией и возможно экстракцией ДНК [17]. Известно, что некоторые флуоресцентные красители не могут быть использованы совместно с рядом иммунофлуоресцентных окрасок. Анализ препаратов, полученных при использовании SYTOX Green, в сочетании с иммунофлуоресцентными методами выявления триптазы и глиального фибриллярного белка, позволяет говорить о хорошей сочетаемости данных методов окрашивания. Так, при использовании антител к триптазе тучных клеток и GFAP, показано, что на селективность реакции и интенсивность иммунофлуоресценции подкраска ядер флуоресцентным красителем не оказывает негативного влияния. Выводы. Таким образом, установленные условия окраски и полученные данные о влиянии метода фиксации материала на флуоресценцию позволяют достаточно точно подобрать необходимый ядерный краситель для окраски гистологических срезов, учитывая все особенности самого флуоресцентного красителя и условий фиксации окрашиваемых объектов. Наиболее подходящей фиксацией для каждого из четырех МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 2 39 выбранных ядерных красителей является цинк-эта-нол-формальдегид. Метод фиксации материала в формалине является наиболее подходящим при окраске гистологических срезов DAPI и PI. Жидкость Буэна является наименее подходящей для работы с ядерными флуоресцентными красителями. Установленные в рамках настоящей работы протоколы окраски могут быть использованы не только для визуализации ядерных элементов клеток, но и в исследованиях с применением метода многоцветовой флюоресцентной микроскопии.

M A Syrczova

Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Science

Email: marina.syrczova@mail.ru
St.-Petersburg, Russia

E A Kolos

Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Science

Email: Koloselena1984@yandex.ru
St.-Petersburg, Russia

V A Snegova

Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Science

Email: biolaber@inbox.ru
St.-Petersburg, Russia

V V Guselnicova

Institute of Experimental Medicine of the North West Branch of the Russian Academy of Medical Science; St.-Petersburg State University

Email: Guselnicova.Valeriia@yandex.ru
St.-Petersburg, Russia

  1. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Гиляров А.В., Соловьев К.В., Грудинина Н.А. Изучение пространственной организации астроцитов головного мозга при помощи конфокальной лазерной микроскопии // Морфология. - 2009. - Т. 135, № 3. - С. 76-79.
  2. Лёвшин В.Л. Фотолюминесценция жидких и твердых веществ. - М. - Л.: Гостехиздат, 1951. - 456 с.
  3. Вежеева О.А., Сергеева Т.Н., Сергеев В.Г. Ингибирование нейровоспаления редуцирует дегенерацию дофаминергических нейронов черной субстанции мозга, индуцированную гиперэксперессией в них рекомбинантного гена альфа-синуклеина человека // Медицинский академический журнал. - 2013. - Т. 13, № 3. - С. 71-77.
  4. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Карпенко М.Н. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии (руководство) / под ред. Д.Э. Коржевского. - СПб.: СпецЛит, 2012. - 116 с.
  5. Коржевский Д.Э., Кирик О.В. Специальные методы окраски, используемые для изучения структур клеточного ядра // Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии (руководство) / под ред. Д.Э. Коржевского. - СПб.: СпецЛит, 2012. - С. 59-65.
  6. Коржевский Д.Э. Нейрогенез и нейральные стволовые клетки // Медицинский академический журнал. - 2010. - Т. 10, № 4. - С. 175-182.
  7. Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. - СПб.: СпецЛит, 2010. - 96 с.
  8. Коржевский Д.Э., Григорьев И.П., Новикова А. Д., Ковальчук В.А., Кирик О.В. Холинергические структуры поясной коры головного мозга крысы // Медицинский академический журнал. - 2013. - Т. 13, № 4. - С. 49-53.
  9. Suzuki T., Fujikura K., Higashiyama T., Takata K. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy // J. Histochem. Cytochem. - 1997. - Vol. 45, № 1. - P. 49-53.
  10. Takata K., Hirano H. Use of fluorescein-phalloidin and DAPI as a counterstain for immunofluorescence microscopic studies with semithin frozen sections // Acta Histochem. Cytochem. - 1990. - Vol. 23, № 5. - P. 679-683.
  11. Сибирцев В.С. Флуоресцентные ДНК-зонды: исследование механизмов изменения спектральных свойств и особенностей практического применения // Биохимия. - 2007. - Т. 72, вып. 8. - С. 1090-1106.
  12. Matsuzaki T., Suzuki T., Fujikura K., Takata K. Nuclear staining for laser confocal microscopy // Acta Histochem. Cytochem. - 1997. - Vol. 30. - P. 309-314.
  13. Suzuki T., Matsuzaki T., Takata K. Fluorescence counter-staining of cell nuclear DNA for Multi-Color Laser Confocal Microscopy // Acta histochemica et cytochemica. - 1998. - Vol. 31, № 4. - P. 297-301.
  14. Никитин С.М., Гроховский С.Л., Жузе А.Л., Михайлов М.В., Заседателев А.С., Гурский Г.В., Готтих Б.П. Лиганды, обладающие сродством к определенным или последовательностям оснований ДНК // Биоорганическая химия. - 1981. - Т. 7, № 4. - С. 542-551.
  15. Битехтина М.А., Векшин Н.Л. 7-Аминоактиномицин как флуоресцентный зонд на расплетание и денатурацию ДНК // Биоорганическая химия. - 2008. - Т. 34, № 6. - С. 781-785.
  16. Greenlee J.E., Keeney P.M. Immunofluorescent labelling of K-papovavirus antigens in glycol methacrylate embedded material: a method for studying infected cell populations by fluorescence microscopy and histological staining of adjacent sections // Stain Technol. - 1982. - Vol. 57, № 4. - P. 197-205.
  17. Коржевский Д.Э., Сухорукова Е.Г., Гилерович Е.Г., Петрова Е.С. Преимущества и недостатки цинк-этанол-формальдегида как фиксатора для иммуноцитохимических исследований конфокальной лазерной микроскопии // Морфология. - 2013. - Т. 143, № 2. - С. 81-85.

Views

Abstract - 41

PDF (Russian) - 3

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2014 Syrczova M.A., Kolos E.A., Snegova V.A., Guselnicova V.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies