APPLICATION OF CALBINDIN IMMUNOCYTOCHEMISTRY FOR STUDY OF STRUCTURAL ORGANISATION OF THE PURKINJE CELL DENDRITES OF THE HUMAN CEREBELLUM

Abstract


The calbindin immunocytochemistry-based fluorescent technique is proposed for revealing the dendrites of the Purkinje cells in the human cerebellum. By improving the sensitivity of the immunocytochemical reaction and application of embedding medium with a high refractive index, fluorescence level was reached sufficient for the high resolution laser confocal microscopy and the informative three-dimensional reconstructions. Despite the use of the fixed material and the paraffin sections the presented protocol provides high-quality visualization of the structures studied.

Введение. В настоящее время методы иммуноцитохимии становятся неотъемлемой частью методологической базы современного нейрогистологического исследования [1-3]. Это объясняется высокой селективностью иммуноцитохимических реакций и возможностями применения флуоресцентной и конфокальной микроскопии, существенно расширяющих возможности морфологического и цитохимического анализа различных нейрональных популяций. Одну из важнейших популяций крупных нейронов центральной нервной системы образуют клетки Пуркинье коры мозжечка. При описании цитохимических характеристик этих клеток отмечают полное отсутствие экспрессии общенейронального маркера - ядерного белка NeuN [4], и высокую экспрессию кальбиндина [5], что не свойственно другим нейронам мозжечка. Клетки Пуркинье занимают центральное положение в структурно-функциональной системе коры мозжечка. Их первичные дендриты образуют густое дендритное дерево, терминальные ветви которого покрыты многочисленными шипиками, участвующими вместе с параллельными волокнами в формировании возбуждающих синапсов [6]. Морфологические характеристики дендритов и шипиков различных нейронов подвержены значительным изменениям под действием внешних (относительно организма) и внутренних, в том числе патологических, стимулов [7-11]. Вследствие этого для оценки функционального состояния коры мозжечка большое значение имеет определение структурной организации дендри-тов и дендритных шипиков клеток Пуркинье. Классическим методом выявления шипикового аппарата 34 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 3 нейронов является импрегнация по методу Гольджи, а также электронно-микроскопическое исследование. Однако трудоемкость и особые требования к пробоподготовке препятствуют широкому применению данных методических подходов для анализа структурной организации клеток Пуркинье мозжечка человека. Ряд современных методических приемов, применяемых для прижизненной визуализации дендритов и шипикового аппарата нейронов [12], не может быть использован при исследовании нервной ткани человека по этическим соображениям. Цель настоящего исследования состояла в изучении применимости иммуноцитохимической реакции на кальбиндин для изучения структуры дендритов клеток Пуркинье мозжечка человека и разработке простого и эффективного протокола обработки парафиновых срезов, пригодного для выявления ченных блоков готовили срезы толщиной 7 мкм. В качестве маркера, ассоциированного с клетками Пуркинье, был выбран кальбиндин. Для иммуноци-тохимического выявления кальбиндина использовали моноклональные антитела (клон CL-300, Ataam, Великобритания; разведение 1:100). Перед постановкой реакции проводили тепловое демаскирование антигена в модифицированном цитратном буфере (S1700; Dako, Дания) в пароварке [14]. Перед отработкой протокола окраски для конфокальной лазерной микроскопии была проведена им-мунопероксидазная реакция и микроскопия в проходящем свете, подтвердившая высокую селективность окраски дендритов клеток Пуркинье (рис. 1). В качестве вторичных антител для этой реакции применяли реагент «HRP Conjugate» из набора Reveal Polyvalent HRP DAB Detection System Рис. 1. Кора мозжечка человека. Селективная окраска клеток Пуркинье при реакции на кальбиндин. Одиночная стрелка - патологическая варикозность дендрита клетки Пуркинье. Двойная стрелка - аксон клетки Пуркинье. Иммуноцитохимическая реакция на кальбиндин с подкраской гематоксилином. Световой микроскоп DM750, цифровая камера ICC50. Масштабный отрезок равен 50 мкм. шипикового аппарата дендритов клеток Пуркинье с помощью конфокальной микроскопии. Материалы и методы исследования. В работе использованы фрагменты коры мозжечка человека (n=5, возраст от 23 до 81 года) из архива Отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины. Материал был фиксирован в цинк-этанол-формальдегиде [13], обезвожен и залит в парафин по общепринятой методике. Из полу- (SPD-060, SpringBioscience, США). Визуализацию связавшихся первичных антител осуществили с помощью хромогена DAB+ (Dako, Дания). При отработке протокола иммунофлуоресцентной реакции на кальбиндин с целью получения максимальной яркости флуоресценции и адекватной амплификации были использованы различные вторичные реагенты, конъюгированные с флуорохромами производства Dako, Invitrogen и JacksonImmunoResearch. МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 3 35 Наиболее удачной оказалась комбинация биотинили-рованных антимышиных Fab-фрагментов иммуноглобулинов осла (JacksonImmunoResearch, США; разведение 1:200) и стрептавидина, коньюгированно-го с флуоресцентным красителем Cy2 (JacksonImmunoResearch, США; разведение 1:50). Для заключения препаратов была выбрана гидрофобная перманентная среда Cytoseal 60 (Thermo Scientific, США), показатель преломления которой близок показателям преломления стекла и иммерсионного масла Immersol 518F (n=1,518; Zeiss, Германия), используемого при микроскопии для объектива Plan-Apochromat 100x/1.40 Oil DIC M27 конфокального микроскопа LSM710 (Zeiss, Германия). Результаты и их обсуждение. Постановка реакции на кальбиндин на срезах мозжечка человека с использованием иммунопероксидазной реакции (см. рис. 1) продемонстрировала высокую селективность реакции перикарионов клеток Пуркинье, их дендри-тов и аксона. Однако контурирование шипиков при наблюдении в проходящем свете видимого спектрального диапазона было неотчетливым. Для улучшения визуализации дендритов и их шипиков были использованы различные приемы техники флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. В результате отработки различных режимов инкубации с антителами и разных способов теплового демаскирования антигена был установлен оптимальный протокол обработки препаратов для флуоресцентного выявления клеток Пуркинье. 1. Удалить парафин и дегидратировать срезы обычным способом. 2. Промыть срезы в дистиллированной воде в течение 5 минут. 3. Перенести предметные стекла в предварительно нагретый до 60 С модифицированный цитрат -ный буфер (Dako, Дания; каталожный номер S1700) и провести тепловое демаскирование антигена в пароварке, установив таймер на 20 минут. 4. Сполоснуть стекла в дистиллированной воде и поместить в 0,01 М фосфатно-солевой буфер (ФСБ) pH 7,4 на 5 минут. 5. Удалив избыток жидкости вокруг срезов фильтровальной бумагой, нанести на срезы необходимое количество блокировочного раствора Protein block (SpringBioscience, США; каталожный номер DPB-125) и оставить при комнатной температуре на 10 мин. Чтобы реагенты при инкубации не растекались по предметному стеклу и срезы не высыхали, необходимо нарисовать специальным фломастером Dako Pen (Dako, Дания) гидрофобный круг вокруг срезов. 6. Аккуратно удалить блокировочный раствор и, не промывая препараты, нанести на срезы необходи мое количество моноклональных мышиных антител к кальбиндину (Abcam, Великобритания; разведение 1:100), равномерно распределив раствор по срезу покачиванием. Поместить стекла во влажную камеру и инкубировать при 27° C в термостате в течение 72 часов. 7. Смыть антитела со срезов при помощи ФСБ и поместить стекла в свежую порцию ФСБ на 10 минут. 8. Удалив избыток жидкости вокруг срезов, нанести необходимое количество раствора биотинилиро-ванных антимышиных Fab-фрагментов иммуноглобулинов осла (JacksonImmunoResearch, США; разведение 1 : 200), поместить предметные стекла во влажную камеру и инкубировать при 27° C в термостате в течение 3,5 часов. 9. Смыть реагент со срезов и оставить препараты в ФСБ на 10 мин. 10. Удалив избыток жидкости со стекол, нанести на срезы необходимое количество конъюгата стрепта-видина и флуорохрома Cy2 (JacksonImmunoResearch, США; разведение 1:50), и инкубировать во влажной камере при 27° C в термостате в течение 30 минут. 11. Удалить реагент со срезов и промыть препараты в дистиллированной воде (5 минут при постоянном перемешивании). 12. Аккуратно удалив воду вокруг срезов фильтровальной бумагой, обезводить препараты в абсолютированном (99%) изопропиловом спирте (при помощи пипетки спирт наносится на срезы и свободно стекает по стеклу в смывочную емкость; время обработки - 15-20 с). 13. Быстро просветлить препараты в смеси ксилол-спирт (1:1) 20-30 секунд при перемешивании и в двух сменах ксилола по 1 минуте в каждом, после чего заключить в перманентную среду Cytoseal 60 (Thermo Scientific, США). Полученные препараты изучали при помощи конфокального лазерного микроскопа LSM 710 Zeiss (Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер (458 нм). Регистрация флуоресценции Cy2 проводилась в расширенном диапазоне (474-627 нм) для обеспечения максимальной яркости изучаемых объектов. При исследовании серийных оптических срезов (рис. 2, а) и комбинированных изображений (рис. 2, б), полученных с помощью конфокального микроскопа, четко определяется гладкий ствол крупного дендрита, который не имеет шипиков. Инициальная часть стволов, отходящих от крупного дендрита, содержит редкие одиночные шипики. Ветви меньшего диаметра можно разделить на две группы. Это идущие параллельно главному стволу тонкие ветви, от 36 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014 г., ТОМ 14, № 3 ходящие от гладких частей дендрита, которые содержат небольшое количество шипиков (см. рис. 2), и многочисленные третичные ветви, их анастомозы, которые усеяны находящимися на них многочисленными шипиками. Трехмерные реконструкции (рис. 2, в), выполненные с использованием программного обеспечения ZEN 2011 (Zeiss, Германия), позволяют изучать пространственную организацию дендритов клеток Пуркинье. Сравнение полученных изображений с опубликованными ранее фотографиями шипиков нейронов лабораторных животных [5, 15], для визуализации которых применялись иные методические приемы, показывает, что достигнутое качество плоскостных изображений и трехмерных реконструкций превосходит результаты, полученные на фиксированном материале, и отвечает существующему уровню методов прижизненной визуализации шипикового аппарата нейронов. Заключение. На основании полученных данных можно сделать вывод, что иммуноцитохимическая реакция на кальбиндин с использованием конфокальной микроскопии действительно позволяет изучать структурную организацию дендритов клеток Пуркинье мозжечка человека, включая их шипики, размеры которых приближаются к пределу разрешения обычного оптического микроскопа. Для получения максимально возможного разрешения, необходимого для высококачественной трехмерной реконструкции дендритов, следует использовать заключающие и иммерсионные среды с высоким показателем преломления (около 1,5). Представленный протокол позволит получить препараты необходимого качества для проведения пространственной реконструкции дендритов клеток Пуркинье.

D E Korzhevskii

Institute of Experimental Medicine of the North-Western Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: iemmorphol@yandex.ru
St. Petersburg, Russia

V V Gusel’nikova

Institute of Experimental Medicine of the North-Western Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: iemmorphol@yandex.ru
St. Petersburg, Russia

E G Gilerovich

Institute of Experimental Medicine of the North-Western Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: iemmorphol@yandex.ru
St. Petersburg, Russia

O V Kirik

Institute of Experimental Medicine of the North-Western Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: iemmorphol@yandex.ru
St. Petersburg, Russia

E G Sukhorukova

Institute of Experimental Medicine of the North-Western Branch of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: iemmorphol@yandex.ru
St. Petersburg, Russia

  1. Коржевский Д.Э., Григорьев И.П., Новикова А.Д., Ковальчук В.А., Кирик О.В. Холинергические структуры поясной коры головного мозга крысы // Медицинский академический журнал. - 2013. - Т. 13, № 4. - С. 49-53.
  2. Чумасов Е.И., Майстренко Н.А., Петрова Е.С., Прядко А.С., Бойко И.Ю., Коржевский Д.Э. Морфологическое исследование поджелудочной железы при хроническом панкреатите с использованием иммуногистохимических маркеров // Медицинский академический журнал. - 2013. - Т. 13, № 2. - С. 71-77.
  3. Чумасов Е.И., Петрова Е.С., Сухорукова Е.Г., Коржевский Д.Э. Распределение PGP 9.5-иммунопозитивных нервных волокон в сердце человека // Медицинский академический журнал. - 2013. - Т. 13, № 1. - С. 61-66.
  4. Коржевский Д.Э., Петрова Е.С., Кирик О.В., Безнин Г.В., Сухорукова Е.Г. Нейральные маркеры, используемые при изучении дифференцировки стволовых клеток // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - Т. V, № 3. - С. 57-63.
  5. Schmidt H., Schwaller B., Eilers J. Calbindin D28k target myo-inositol monophosphatase in spines and dendrites of cerebellar Purkinje neurons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2005. - Vol. 102, № 16. - P. 5850-5855.
  6. Hawkes R. An anatomical model of cerebellar modules // Prog. Brain Res. - 1997. - Vol. 114. - P. 39-52.
  7. Боголепов Н.Н. Закономерности пластичности и стабильность синапсоархитектоники мозга // Вестник международной академии наук (русская секция). - 2010. - № 1. - С. 18-22.
  8. Скребицский В.Г., Штарк М.Б. Фундаментальные основы пластичности нервной системы // Вестник РАМН. - 2012. - № 9. - С. 39-44.
  9. Mavroudis I.A., Manani M.G., Petrides F., Petsoglou K., Njau S.D., Costa V.G., Baloyannis S.J. Dendritic and spinal pathology of the Purkinje cells from the human cerebellar vermis in Alzheimer’s disease // Psychiatr. Danub. - 2013. - Vol. 25, № 3. - P. 221-226.
  10. Pascual R., Bustamante C. Early postweaning social isolation but not environmental enrichment modifies vermal Purkinje cell dendritic outgrowth in rats // Acta Neurobiol Exp (Wars). - 2013. - Vol. 73, № 3. - P. 387-393.
  11. Wessel L., Balakrishnan-Renuka A., Henkel C. Meyer H.E., Meller K., Brand-Saberi B., Theiss C. Long-term incubation with mifepristone (MLTI) increases the spine density in developing Purkinje cells: new insights into progesterone receptor mechanisms // Cell Mol. Life Sci. - 2014. - Vol. 71, № 9. - P. 1723-1740.
  12. Tonnesen J., Katona G., Rozsa B., Nagerl U.V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses // Nat. Neurosci. - 2014. - Vol. 17, №5. - P. 678-685.
  13. Коржевский Д.Э., Сухорукова Е.Г., Гилерович Е.Г., Петрова Е.С., Кирик О.В., Григорьев И.П. Преимущества и недостатки цинк-этанол-формальдегида как фиксатора иммуноцитохимических исследований и конфокальной лазерной микроскопии // Морфология. - 2013. - Т. 143, вып. 2. - С. 81-85.
  14. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Карпенко М.Н., Коржевский Д.Е. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии: руководство / под ред. Д.Э. Коржевского. - 2-е изд., испр., и доп. - СПб: СпецЛит, 2014. - 119 с.
  15. Васильев Д.С., Туманова Н.Л., Журавин И.А. Исследование распределения белка шипикового аппарата синаптоподина в кортикальных отделах мозга крыс, перенесших гипоксию в разные периоды эмбриогенеза // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. - 2010. - Т. 4, № 5. - С. 435-439.

Views

Abstract - 46

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2014 Korzhevskii D.E., Gusel’nikova V.V., Gilerovich E.G., Kirik O.V., Sukhorukova E.G.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies