PEPTIDES OF THYMUS IN THE REGULATION OF STRESS

Abstract


The aim of this clinical and experimental research is the examination of the role of peptides of thymus in the regulation of stress. At the first stage of research, levels of serum thymic activity (STA) in 112 mother-child pairs have been analyzed in the moment of birth stress. Level of STA of healthy non pregnant women of childbearing age has been taken as the reference rate (n=10). Only healthy parturient women with non-compromised history of physiologically progressing pregnancy had adequate reaction of the organism to the birth stress in the form of the increase of the level of the examined indicator. The next stage of the research was the study of the influence of thymus polypeptide drug tactivin on the behavior, training and ability to resist stress in the experimental animals. The research has been carried out on 510 rats of Wistar line. The drug has been increasing orientative-exploratory behavior of animals and has been exerting mnemotropic effect comparable to the effect of classic nootropic drug piracetam. On the basis of models of memory impairments, it was shown that tactivin improves reproduction of avoidance response in conditions of emotional stress. This effect was comparable to the influence of nootropic drug piracetam and was different from the effect of anxiolytic diazepam. The data received as the result of this research lead to the declaration of stress-limiting activity of polypeptides of thymus.

Введение. В настоящее время обсуждается вопрос о взаимодействии иммунной, нервной и эндокринной систем. Возникло новое направление нейроиммуноэндокринологии. Современные исследования показывают, что центральная нервная система испытывает влияние со стороны иммунной системы. Продукты иммунокомпетентных клеток - цитокины -обладают нейротропной активностью, участвуют в физиологических механизмах памяти, регуляции сна, активности гипоталамо-гипофизарно-надпочеч-никовой системы, реализации стресс-реакции [1-5]. В основу данной работы легло предположение, что тимус, а следовательно и продуцируемые им пептиды, играют существенную роль не только в регуляции иммунной системы, но и в адаптации организма в целом при любых стрессорных воздействиях, запуская МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 65 различные клеточные и молекулярные каскады, оказывая влияние на все органы и системы, и в первую очередь изменяя активность нейронов ЦНС [6]. Материалы и методы исследования. Проведен анализ уровня сывороточной тимической активности в 112 парах мать-дитя в момент родового стресса. В качестве группы сравнения оценивали уровень исследуемого показателя у здоровых небеременных женщин (n=10). В зависимости от состояния здоровья, особенностей соматического и акушерско-гинекологического анамнеза и течения беременности матери были разделены на четыре группы: 1-я группа (n=19) - здоровые матери с неотягощенным анамнезом и нормально протекавшей беременностью; 2-я группа (n=14) - матери с отягощенным соматическим и/или акушерско-гинекологическим анамнезом, настоящая беременность у которых протекала также нормально; 3-я группа (n=20) - матери с благоприятным соматическим и акушерско-гинекологическим анамнезом, но с осложненным течением беременности в виде раннего токсикоза и/или повышенного тонуса матки; 4-я группа (n=59) -матери с отягощенным соматическим и/или акушерско-гинекологическим анамнезом и осложненным течением беременности, в числе которых такие же осложнения, как у матерей детей 3-й группы. Группой сравнения (5-я группа - n=10) служили здоровые небеременные женщины. Статистически значимых различий в возрасте женщин не было. Уровень сывороточной тимической активности определяли по методу J. Bach [7] в модификации V. Ya. Arion и соавт. [8]. Кровь для исследования забирали у женщин из кубитальной вены сразу после рождения ребенка. У детей исследовали пуповинную кровь, при заборе которой избегали смешивания с кровью матери. Статистическая обработка результатов исследования проводилась методом вариационной статистики с определением средней арифметической (М), стандартного отклонения (а), стандартной ошибки средней (m). Достоверность различий определялась по критерию Стьюдента (t). Экспериментальное исследование проводилось на 400 крысах Вистар массой 180-200 г. Все животные содержались в стандартных условиях вивария с 12-часовым циклом день-ночь со свободным доступом к пище и воде. Перед началом эксперимента всех животных тестировали в открытом поле для создания идентичных по поведению групп. После тестирования животные делились на четыре группы: 1-ю группу составили контрольные животные, которым вводили изотонический раствор натрия хлорида; 2-я группа получала полипептидный препарат тимуса в дозе 0,5 мг/кг; 3-я группа - эталонный ноотропный препарат пирацетам в дозе 300 мг/кг; 4-я группа - эталонный анксиолитический препарат диазепам в дозе 0,5 мг/кг. Все препараты вводились внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. Перед началом экспериментов тактивин и изотонический раствор натрия хлорида вводили 5 дней, в последующем через день на протяжении всего опыта. Предварительного курса диазепама и пирацетама не проводили. Через 5 дней после первого тестирования животных вновь тестировали в открытом поле на фоне действия препаратов. Кроме того, проводили тестирование в приподнятом крестообразном лабиринте и светло-темной камере. После проведения тестов у животных вырабатывали условные рефлексы: пищевой условный рефлекс [9], условный рефлекс пассивного избегания, условный рефлекс активного избегания. После достижения животными критерия обученности (80% реакций избегания) у животных формировали эмоциональный стресс. Для этого в работе использовали два приема обратимых функциональных нарушений реакции избегания, которые вызывались внезапными изменениями условий опыта: сбой [10] и пространственную переделку навыка [11]. За 45 мин до проведения функциональных нарушений животным вводили препараты. Статистическую обработку полученных данных проводили с применением программы STATISTICA 6.0 (Statsoft, США), используя непараметрический критерий Вилкоксона. Результаты исследования. На первом этапе исследования проанализирован уровень сывороточной тимической активности в парах мать-дитя при родовом стрессе (табл. 1). У матерей 1-й группы уровень исследуемого показателя был статистически значимо выше, чем аналогичный показатель у здоровых небеременных женщин. Таким образом, полученные нами результаты подтвердили данные, выявленные ранее в 1991 году И. Ф. Лабунец и соавт. [12], что уровень сывороточной тимической активности повышается перед родами. Обращает на себя внимание факт, что у матерей 1-й группы уровень данного показателя в сыворотке крови, взятой из кубитальной вены сразу после рождения ребенка, был статистически значимо выше, чем у матерей 2-й, 3-й и 4-й групп с патологическим и/или отягощенным течением беременности. На втором этапе исследования был проведен анализ действия полипептидов тимуса тактивина на поведение животных в условиях с разной степенью стессогенности. В поведенческих тестах при повторном тестировании в «открытом поле» препарат снижал уровень страха, что проявлялось в сопоставимом с действием эталонных препаратов уменьшении 66 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Т аблица 1 Распределение значений сывороточной тимической активности в пуповинной крови доношенных новорожденных детей и в крови их матерей, взятой из кубитальной вены сразу после рождения ребенка Группа Число наблюдений Уровень сывороточной тимической активности (log2 N), M±m Уровень значимости различия показателей в парах мать-ребенок, р женщины дети 1-я группа - здоровые роженицы 19 3,9±0,3 2,8±0,3 р<0,05 2-я группа - роженицы с отягощенным 14 2,1±0,3** 2,7±0,2 р>0,05 анамнезом 3-я группа - роженицы с ранним токсико 20 2,5±0,2** 3,3±0,2 р<0,01 зом и/или гипертонусом матки 4-я группа - роженицы с отягощенным 59 2,2±0,1** 2,7±0,1 р<0,001 анамнезом и с ранним токсикозом и/или гипертонусом матки X (2±3±4)* 93 2,3±0,2** 2,9±0,25 р>0,05 5-я группа - здоровые небеременные 10 2,6±0,1** женщины Уровень значимости различия показателей р<0,001, по срав р>0,05 нению с 1 группой Среднее значение уровня СТА во 2-й, 3-й и 4-й группах, взятых вместе. нахождения животных в периферических секторах и увеличении ориентировочно-исследовательской активности. На фоне тактивина уменьшалось количество норковых реакций, что также свидетельствует об уменьшении тревоги (рис. 1). В приподнятом крестообразном лабиринте и тесте «светло-темнового» выбора препарат не проявил выраженных анксиолитических свойств, однако жиобучению. Особенно выраженно действие тактивина на обучение проявлялось на начальном этапе, чему, видимо, способствовало уменьшение чрезмерно высокого эмоционального напряжения животных, вызываемого новой обстановкой и более частым элект-роболевым воздействием. При тестировании через 24 ч после формирования у животных условного рефлекса пассивного избегания 120 .100 1S !80 § 60 I 40 О) ■ ЕГ § 20. 0 | | Контроль | | Тактивин | | Пирацетам | | Диазепам Центр Медиальная часть Периферическая Стойки Норки часть Рис. 1. Поведение животных в открытом поле (% по отношению к результатам первого тестирования). * р<0,05 относительно контроля. вотное в лабиринте и темном отсеке «светло-темно-вой» камеры чувствовали себя комфортно, что проявлялось в четком последовательном груминге, достигающем своих финальных стадий. Более высокая двигательная активность на фоне тактивина и пирацетама во всех перечисленных тестах сочеталась с более быстрой выработкой как оборонительных (рис. 2, 3), так и пищевых условных рефлексов, т. е. такое поведение способствовало латентный период захода в темный отсек увеличился во всех группах животных при этом статистически значимых отличий между животными, получавшими тактивин, изотонический раствор натрия хлорида и диазепам не обнаруживалось. Животные, получавшие пирацетам, при тестировании через 24 ч, 48 ч, 1 и 2 нед в темный отсек не входили, что отражалось в максимально большом значении латентного периода 180 с. Под действием тактивина наблюдалось отсро- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 67 Дни эксперементов Рис. 2. Доля положительных реакций (%) при выработке пищевого условного рефлекса у крыс. * р<0,05 по сравнению с контролем. Дни обучения Рис. 3. Динамика формирования условного рефлекса активного избегания. *р<0,05 относительно контроля. ченное действие на память. Через неделю латентный период захода животного в темный отсек на фоне полипептидов тимуса статистически значимо (р<0,001) превышал контрольный уровень (107,8±3,3 с и 96,1±4,5 c) и этот эффект сохранялся через две недели (106,9±3,2 с и 95,0±5,2 c). У животных, получавших диазепам, латентный период перехода в темный отсек не отличался от контрольных животных на протяжении всего опыта (24 ч - 126,9±2,8 с; 48 ч - 100,0±3,3 с; 1-я неделя - 98,3±4,1 с; 2 недели - 98,7±3,3). Следовательно, тактивин, в отличие от диазепама и подобно пирацетаму, оказал положительное влияние на память. Это позволяет заключить, что полипептиды тимуса обладают ноо-тропоподобными свойствами. В процессе выработки пищевого условного рефлекса количество положительных реакций увеличивалось во всех группах (рис. 2). К концу опыта все группы животных достигали критерия обученности (80% и более положительных реакций). Животные, получавшие тактивин и пир-ацетам, во все дни экспериментов статистически значимо превышали уровень обучения контрольных животных, а группа животных, получавших диазепам, обучалась значимо хуже в 1-4-й дни эксперимента. Полученные нами данные свидетельствуют, что процесс обучения в группах, получавших тактивин и пирацетам, происходил значительно быстрее, чем в контрольной, на протяжении 300 предъявлений условного и безусловного стимулов (рис. 3). Первые реакции избегания, а также 5 и 10 реакций избегания подряд у животных указанных групп также появлялись раньше. В то же время анксиолитичес-кий препарат диазепам удлинял процесс обучения относительно контроля (рис. 3). Одним из проявлений ускорения тактивином процесса обучения было уменьшение латентного периода перехода в другую часть камеры под действием условного сигнала. Во все дни эксперимента животным на фоне действия тактивина, так же как на фоне действия ноотропного препарата, требовалась меньшая продолжительность действия условного сигнала для совершения реакции, в отличие от контрольной группы животных. Таким образом, тактивин, так же как ноотропный препарат, ускоряет формирование условного рефлекса активного избегания. Как и в поведенческих тестах, на фоне обучения, в частности при формировании условного рефлекса активного избегания, под влиянием тактивина мы наблюдали четкий последовательный груминг, доходящий до финальных стадий, что свидетельствовало о более спокойном, комфортном состоянии животного. При наблюдении за животными при формировании данного рефлекса мы обратили внимание, что на фоне тактивина и пирацетама животные в межсиг-нальном периоде предпочитали находиться возле отверстия или в центре камеры, у них наблюдались элементы исследовательской активности, тогда как животные контрольной группы находились почти неподвижно в углах камеры далеко от отверстия. Следующим этапом нашей работы стало изучение влияния исследуемого препарата на эмоциональный стресс, вызываемый обратимыми функциональными нарушениями реакции избегания, обусловленными сбоем и переменой местоположения отверстия (табл. 2). Тактивин предупредил развитие сбоя, превысив по своей активности ноотропный препарат и анксио-литик, которые лишь уменьшили его последствия. Нарушение реакции избегания при перемене местоположения отверстия на фоне тактивина и пирацета-ма уменьшилось в 2 и 2,3 раза соответственно, в контрольной группе количество реакций избегания уменьшилось в 3 раза, а на фоне действия диазепама этот показатель был даже ниже, чем в контрольной группе. При этом на фоне эмоционального стресса у животных, получавших тактивин, так же как у животных, получавших эталонные препараты пирацетам и диазепам, мы не наблюдали реакций, 68 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Таблица 2 Влияние тактивина на воспроизведение условной реакции активного избегания после обратимых функциональных нарушений Функциональное нарушение Вещество Реакции избегания, % до ФН после ФН 16-20 1-5 6-10 11-15 16-20 Сбой реакции Контроль (n=50) 92,0±7,3 28,0±7,3# 76,0±6,3# 76,0±4,3# 80,0±7,0 избегания Тактивин (n=50) 99,8±0,2 99,8±0,2* 96,0±5,1* 88,8±4,6* 87,9±4,8 Пирацетам (n=30) 99,8±0,2 80,0±3,3#* 73,3±4,8 93,3±3,9* 99,8±0,2* Диазепам (n=30) 90,0±6,7 85,0±7,7#* 80,0±6,8# 70,0±5,4 90,0±5,8 Перемена мес Контроль, (n=55) 86,1±4,1 32,0±8,5# 44,0±9,7# 60,0±4,3 48,0±9,3# тоположения Тактивин (n=50) 99,8±0,2 49,0±3,1#* 74,2±7,3* 77,5±4,1* 79,2±4,7* отверстия Пирацетам (n=30) 99,8±0,2 43,8±2,8#* 60,0±6,4#* 93,3±3,7* 96,1±3,5* Диазепам (n=30) 99,8±0,2 35,0±4,6# 51,0±8,6# 55,0±5,8# 58,0±5,2# р<0,05 относительно контроля; # р<0,05 относительно средней величины до ФН. характерных для срыва высшей нервной деятельности, наблюдаемые в контрольной группе. Обсуждение результатов. На первом этапе исследования нас привлек интегральный показатель деятельности тимуса - сывороточная тимическая активность. Данный биотест в настоящее время является единственным методом для выявления имму-ноактивных молекул тимуса, циркулирующих в крови [13]. Повышение уровня СТА перед родами и сохранение его высокого значения после естественных родов было отмечено ранее [12]. Если предположить, что при первой фазе любого стресса, а не только инфекционного, тимус отвечает усилением функции, то более высокий уровень сывороточной тимической активности у здоровых рожениц является адекватной реакцией на родовой стресс. Уровень исследуемого показателя у рожениц с осложненным течением первой половины беременности и/или на фоне ремиссии хронических заболеваний был ниже, чем у здоровых рожениц. Это может косвенно свидетельствовать об истощении функции тимуса у данной категории рожениц. При изучении функции любой железы можно использовать ее гормон. При введении гормона в ин-тактный организм возникает картина усиленной работы эндокринного органа. Для изучения функции тимуса можно использовать его полипептиды, которые, как считается, обладают гормональной активностью. В настоящей работе исследовалось действие комплексного полипептидного препарата тимуса тактивина, широко применяемого в клинической практике иммуномодулятора. Его действие на иммунную систему хорошо известно и не вызывает сомнения, нас же интересовала способность тактивина усиливать стрессоустойчивость организма. Следующим этапом исследования явилось изучение антистрессорной активности тактивина в экспериментальных моделях, где участие иммунитета в классическом понимании было бы незначительным. На наш взгляд, модели поведения животных в новой обстановке, обучение и формирование эмоционального стресса путем обратимых функциональных нарушений памяти хорошо соответствуют поставленной цели. Новая обстановка является несомненно стрессовым фактором как для животных, так и для человека. Изучая действие препаратов на поведение животных в новой для них обстановке, можно судить об их возможной стресс-протективной способности. В поведенческих тестах мы наблюдали, что на фоне действия полипептидов тимуса животные чувствовали себя более комфортно в новых для себя условиях. Более высокий уровень ориентировочно-исследовательского поведения на фоне тактивина обеспечивает животное знанием об окружающей среде и является существенным психологическим механизмом адаптации высших позвоночных. По данным ряда авторов, с количественными показателями ориентировочно-исследовательского поведения коррелирует также индивидуальная устойчивость к эмоциональному стрессу. При этом повышенную эмоциональную реактивность связывают с низкой двигательной активностью и повышенной дефекацией и наоборот [14-19]. Наши данные демонстрируют, что и ноотропный препарат пирацетам, и анксиолитик диазепам, и поли-пептидный препарат тимуса тактивин уменьшили нарушение выработанного навыка при сбое реакции избегания. При этом также отсутствовали реакции, характерные для срыва высшей нервной деятельности. Одинаковое влияние выглядит как парадокс, поскольку анксиолитики относят к препаратам депримирую- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 69 щего типа, а ноотропные препараты и, видимо, тактивин - к средствам стимулирующего типа. Основой для объяснения этого феномена служат двусторонние отношения между эмоциональным напряжением, возникающим при сбое, и решением задачи [20]. Анксиолитик уменьшает эмоциональное напряжение, следствием чего является улучшение воспроизведения избегания после сбоя. При этом он не может улучшить избегания после пространственной переделки, поскольку требуется усвоение нового навыка. Ноотропные препараты и тактивин улучшают решение задачи как при сбое, так и при перемене местоположения отверстия, оптимизируя аналитико-синте-тическую деятельность и активируя интегративные возможности ЦНС. Уменьшение ноотропными препаратами дефицита информации, вызываемого изме нением условий опыта при функциональных нарушениях памяти, приводит к снижению эмоционального стресса, выражающемуся в уменьшении или отсутствии генерализованной активности. Следовательно, в используемых методиках тактивин проявил стресс-протекторную активность, приводящую к улучшению адаптации животных к условиям опыта. Анализируя литературные данные и результаты собственных исследований, можно заключить, что гормоны и полипептиды тимуса являются естественными функциональными антагонистами стресс-системы. Под действием гормонов и полипептидов тимуса повышается устойчивость организма к различным стрессогенным воздействиям, а сам тимус вследствие этого является, помимо центрального органа иммунной системы, органом стресс-лимитирующей системы.

N M Kiseleva

Russian National Research Medical University named after N. I. Pirogov; Scientific Research Institute of Physico-Chemical Medicine

Email: kiseleva.67@mail.ru
Moscow, Russia

A V Novoseletskaya

Lomonosov Moscow State University; Scientific Research Institute of Physico-Chemical Medicine

Moscow, Russia

A N Inozemtsev

Lomonosov Moscow State University

Moscow, Russia

I V Zimina

Scientific Research Institute of Physico-Chemical Medicine

Moscow, Russia

V Ya Arion

Scientific Research Institute of Physico-Chemical Medicine

Moscow, Russia

  1. Арушанян Э. Б., Бейер Э. В. Взаимосвязь психоэмоционального состояния и иммунной системы // Успехи физиол. наук.- 2004.-Т. 35, № 4.- С. 49-64.
  2. Девойно Л. В., Идова Г. В., Альперина Е. Л. Психонейроиммуномодуляция: поведение и иммунитет. Роль «нейромедиаторной установки мозга».- Новосибирск: Наука, 2009.- 168 с.
  3. Dantzer R., Wollman E. E. Relationships between the brain and the immune system // J. Soc. Biol.- 2003.- Vol. 197, № 2.- P. 81-88.
  4. Quan N., Banks W. A. Brain-immune communication pathways // Brain, Behavior, and Immunity.- 2007.- Vol. 21, № 6.- P. 727-735.
  5. Wrona D. Neural-immune interactions: an integrative view of the bidirectional relationship between the brain and immune systems // J. Neuroimmunology.- 2006.- Vol. 172.- P. 38-58.
  6. Киселева Н. М., Иноземцев А. Н. Возможная роль тимуса в работе стресс-лимитирующей системы // Иммунопатология, аллергология, инфектология.- 2010.- № 3.- С. 13-20.
  7. Bach J.-F., Bach M.-A., Charreire J. et al. The circulation thymic factor (TF). Biochemistry, physiology, biological activities, and clinical application // Biological activity of thymic hormones / D. W. van Bekkum.- Kooyker Sci Publ., 1975.- P. 145-158.
  8. Arion V. Ya., Moskvina S. N., Zimina I. V., Lopuchin Yu. M. Evaluation of thymic functional state by non-invasive method // Russian J. Immunol.- 2001.- Vol. 6, № 1.- P. 77-80.
  9. Меринг Т. А. Условнорефлекторная деятельность в процессе старения у белых крыс // Журн. высш. нерв. деят.- 1988.- Т. 38, № 4.- С. 667-673.
  10. Иноземцев А. Н., Прагина Л. Л. Обратимое нарушение реакции избегания как методическое средство для изучения действия психотропных препаратов на высшую нервную деятельность // Журн. высш. нервн. деят.- 1989.- Т. 39, № 4.- С. 764-766.
  11. Иноземцев А. Н., Прагина Л. Л. Методические приемы стрессогенных воздействий для исследования ноотропных влияний на обучение и память // Вест. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология.- 1992.- № 4.- С. 23-31.
  12. Лабунец И. Ф., Гриневич Ю. А., Коханевич Е. В. Состояние эндокринной функции вилочковой железы при нормальном и осложненном течении беременности //Акушерство и гинекология - 1991.- № 7.- С. 37-39.
  13. Mezza C., Mocchegiani E., Pagani S. et al. Relationship between thymulin and growth hormone secretion in healthy human neonates // Am. J. Perinatol.- 2007.- Vol. 24, № 4.- P. 227-233.
  14. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения.- М.: Высшая школа, 1991.- С. 175-189.
  15. Герштейн Л. М. Роль нейромедиаторов и белков в генетико-функциональной организации мозга животных // Онтогенез.- 2001.-Т. 32.- С. 35-40.
  16. Герштейн Л. М., Камышева А. С., Чеботарёва Т. Л. и др. Морфохимическая характеристика мозга крыс линии Вистар, различающаяся по локомотивной активности в открытом поле. // Журн. высшей нервн. деят.- 1991.- Т. 41, № 2.- С. 300-305.
  17. Гуляева Н. В., Левшина И. П. Соотношение индивидуально-типологических особенностей поведения и состояние липидной компоненты церебральных мембран при стрессе. // Индивидуальный мозг: Структурные основы индивидуальных особенностей поведения.- М.: Наука, 1993.- С. 82-91.
  18. Маркель А. Л. К оценке основных характеристик поведения крыс в тесте «открытого поля» // Журн. высш. нерв. деят.- 1981.- Т. 31, № 2.- С. 301-307.
  19. Юматов Е. А., Мещерякова О. А. Прогнозирование устойчивости к эмоциональному стрессу на основе индивидуального тестирования поведения // Журн. высш. нервн. деят.- 1990.- Т. 40, № 3.- С. 575-583.
  20. Иноземцев А. Н. Биологические предпосылки защитных механизмов при срывах высшей нервной деятельности // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология.- 2009.- № 2.- С. 3-8.

Views

Abstract - 23

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2013 Kiseleva N.M., Novoseletskaya A.V., Inozemtsev A.N., Zimina I.V., Arion V.Y.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies