A PUTATIVE MOLECULAR MECHANISM OF ANALGESIC EFFECT OF DEFENSIN PEPTIDE FRAGMENTS

Abstract


Effects of defensin NP-1 hexapeptide fragments on Na v1.8 channels of nocicepitive neuron membrane were investigated by patchclamp method. The data obtained indicate that the ligand-receptor interaction of the peptides with the channel occurs due to formation of salt bonds between positively charged functional groups of the peptide molecules (Arg or Lys) and negatively charged residues of the channel aminoacid chain (Glu or Asp). The significant positive charge of the peptides under investigation conduces their electrostatic attraction to the negatively charged membrane surface at the initial stage of binding and further retention at the surface, after which the ligand-receptor complex with Na v1.8 channel is formed. The acting hexapeptide concentrations are relatively low (≈100 nM), but they exceed the value of defensin NP-1 KD (2 pM) by several orders of magnitude. The unique spatial and structural design of the defensin molecule makes it possible to very effectively serve both as an endogenous antibiotic and an analgesic agent.

Введение. Эндогенные антибиотики дефенсины продуцируются нейтрофильными гранулоцитами и клетками покровного эпителия слизистой оболочки кишечника. Замечательным свойством этих молекул является их способность в очень низких концентрациях снижать возбудимость мембраны ноцицептивного нейрона [1-5]. Ранее нами с помощью метода локальной фиксации потенциала было исследовано действие дефенсинов NP-1 и NP-4 на мембрану сенсорных нейронов [1-5]. Оно приводило к снижению эффективного заряда активационной воротной системы Nav1.8-каналов ноцицептивных нейронов. Этот процесс зависел от концентрации исследованных агентов. Применение уравнения Хилла позволило установить, что величина КД для дефенсина NP-4 (80 нмоль/л) почти на 5 порядков больше, чем величина КД (2 пмоль/л) для дефенсина NP-1. Это означает, что физиологическая активность дефенсина NP-1 чрезвычайно высока. Следовательно, можно предположить наличие сильного анальгетического эффекта у данного агента. Проведенные ранее квантовохимические расчеты позволили предположить, что для двух исследованных молекул дефенсинов анальгетический эффект может быть обусловлен образованием межмолеку-лярной связи между карбоксильной группой амино МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 79 кислоты 14Glu и активным центром молекулы-мишени [1-5]. В случае дефенсина NP-4 на образование связи с каналом влияет также внутримолекулярное взаимодействие указанной карбоксильной группы с активными атомами соседних аминокислот, в результате сродство эндогенного антибиотика NP-4 к мембранной мишени уменьшается почти на 5 порядков по сравнению с дефенсином NP-1. Можно предположить, что молекула NP-1 обладает уникальной структурой, которая определяется ее первичной аминокислотной последовательностью и пространственным строением. Эта структура жестко стабилизирована тремя дисульфидными мостиками. Чрезвычайно низкая даже по сравнению с другими дефенсинами величина Кд для указанной молекулы обусловлена, видимо, этой уникальной структурой. Ответу на вопрос о том, могут ли более простые пептидные молекулы, являющиеся отрезками нативной формы аминокислотной последовательности дефенсина NP-1, проявлять свои анальгетиче-ские свойства, посвящена настоящая работа. Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на культивируемых изолированных нейронах спинальных ганглиев новорожденных крысят линии Вистар. Для выделения нейронов был применен модифицированный метод краткосрочного культивирования [6], обеспечивающий высокий выход жизнеспособных клеток. Методика выделения небольших темных ноцицептивных нейронов, характеризующихся высокой плотностью №^.8-каналов, подробно описана ранее [7]. В работе использовались следующие стандартные растворы (концентрации представлены в ммоль/л). Внеклеточный раствор: NaCl - 65, CaCl2 - 2, MgCl2 - 2, Choline Cl -70, HEPES-Na - 10, тетродотоксин (TTX) - 0,0001, pH = 7,4. Внутриклеточный раствор: CsF -100, NaCl - 10, CsCl - 40, MgCl2 - 2, HEPES-Na - 10, pH = 7,2. Исключение из вне- и внутриклеточного растворов ионов калия позволило избавиться от всех компонентов калиевого тока, а ионы фтора во внутриклеточном растворе обеспечивали блокирование кальциевых токов [6, 8]. Наличие во внеклеточном растворе ионов ТТХ в низкой концентрации обеспечивало блокирование быстрых ТТХ-чувствительных каналов, что делало возможным регистрировать характеристики только одной популяции натриевых каналов - медленных ТТХ-не-чувствительных (Nav1.8) каналов. В работе использованы реактивы фирмы «Sigma». Гексапептиды Pro-Arg-Glu-Arg-Arg-Ala-NH2 (PRERRA), Pro-Arg-Ala-Arg-Arg-Ala-NH2 (PRARRA) и Pro-Lys-Glu-Lys-Lys-Ala-NH2 (PKEKKA) применялись в концентрациях 125 нмоль/л, 100 нмоль/л и 100 нмоль/л соответственно. Все опыты проведены при комнатной температуре 22-24 С. Трансмембранные ионные токи регистрировали с помощью метода локальной фиксации потенциала на целой клетке [9] в условиях плотного контакта (метод «patch-clamp» в конфигурации «регистрация активности целой клетки»). Эксперименты проводили с использованием аппаратно-программного комплекса на основе усилителя «L/M EPC-7», ПЭВМ и разработанной нами системы автоматизации. Система автоматизации предназначена для выполнения ряда функций, главной из которых является определение величины эффективного заряда активационной воротной системы медленных натриевых каналов в ритме эксперимента. Регистрация семейств натриевых токов и их дальнейшая обработка осуществлялись общепринятым методом [7, 10, 11]. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стью-дента. Уровень статистической значимости различий экспериментальных и контрольных данных соответствовал р<0,05. Результаты исследования. Изменение потенци-алочувствительности Nav1.8-каналов исследовали с помощью измерения величины эффективного заряда (Zeff) их активационного воротного устройства до и после воздействия гексапептидов. Измерение этой величины основано на методе, предложенном Алмерсом [12]. В основе метода лежит гипотеза о том, что при смещении мембранного потенциала в сторону гиперполяризации отношение числа открытых каналов к числу закрытых может стремиться к единственной экспоненте, представляющей собой распределение Больцмана. Для построения этой экспоненты необходимо осуществить предельный переход при стремлении трансмембранного потенциала к минус бесконечности. Практически же надо осуществить регистрацию натриевых токов во всем возможном диапазоне ступенек напряжения (E), причем основную информацию о величине эффективного заряда в соответствии с методом Алмерса должны нести те токи, которые активируются при наиболее отрицательных потенциалах. Пример применения указанного метода при исследовании мембраны ноцицептивного нейрона в конкретном эксперименте приведен далее. Исходные записи семейства медленных натриевых токов в контрольных условиях и после приложения гексапептида PKEKKA (100 нмоль/л) представлены на рис. 1. Регистрировали амплитудные (пиковые) значения токов (Imax), которые позволяют получить функцию Imax(E). Приложение гексапептида PKEKKA (100 нмоль/л) с наружной стороны мембраны изме- 80 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 няет форму нормированной пиковой вольт-амперной характеристики медленных натриевых токов по сравнению с контрольными данными (рис. 2). Рис. 1. Семейства медленных натриевых токов до (а) и после (б) приложения гексапептида PKEKKA в концентрации 100 нмоль/л. Тестирующий потенциал изменялся от -50 до 50 мВ с шагом 10 мВ. Поддерживаемый потенциал, длительность которого составляла 300 мс, был равен -110 мВ. Токи утечки и емкостные токи вычтены программным способом. Пиковые значения токов были нормированы, т. е. строились по формуле: Ipic / | Ip1^ I , где Ipic - пиymax ковое значение тока, Ipic - максимальное значение. Зависимости построены по данным контрольного эксперимента и после действия вещества. Стрелка указывает на изменение начального нелинейного участка, определяющего предельное пороговое изменение потенциалочувствительности медленных натриевых каналов. Эффект, позволяющий обнаружить количественную связь между потенциалочувствительностью активационной воротной системы медленных натриевых каналов и воздействием исследуемого агента, проявляется в изменении крутизны левой ветви вольт-амперной характеристики. Важно отметить, что при этом не изменяется потенциал реверсии: правая ветвь вольт-амперной характеристики пересекает ось абсцисс в той же точке (с учетом погрешности эксперимента) как до, так и после приложения гексапептида PKEKKA (рис. 3). 0,2 0 в Е, мв -40 Н-20 В 20 40 60 -0,2 ё‘3. ” -0,4 -0,6 -0,8 -1,0 J I I Контроль П Действие гексапептида РКЕККА Рис. 2. Нормированные значения пиковых вольт-амперных характеристик медленных натриевых каналов до и после воздействия гексапептида PKEKKA в концентрации 100 нмоль/л. Следствием изменения крутизны левой ветви вольт-амперной характеристики является возникновение S-образного начального участка зависимости хордовой проводимости от потенциала GNa(E): GNa(E) = Imax(E)/(E - ENa), где ENa - величина потенциала реверсии натриевого тока, Ipic(E) - амплитудное значение тока при де- 1,0 в 0,5 <в z и □ □ □ □ □ □ □ -В- □ □ □ □ □ □ □ □ □ □ Е, мВ -35 -15 I I Контроль I I Действие РКЕККА 25 Рис. 3. Потенциалозависимость хордовой проводимости медленных натриевых каналов. Функция GNa(E) была нормирована, т. е. строилась GNa(E)norm = GNa(E)/ GNamax(E), где GNamax(E) - ее максимальное значение. Показаны данные контрольного эксперимента и результаты, полученные после приложения гексапептида PKEKKA в концентрации 100 нмоль/л. поляризующем потенциале Е. Функция GNa(E) имеет начальный S-образный участок, крутизна которого отражает наиболее важные особенности потенциало-чувствительности активационного процесса. Стационарным параметром, определяющим возможный механизм лиганд-рецепторного связывания действующих агентов с мембраной сенсорного нейрона, служит эффективный заряд (Zeff) активационной воротной системы [7, 13]. Именно он был выбран на МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 81 ми как количественный показатель, отражающий эффект воздействия исследуемых пептидов. Для оценки наблюдаемого эффекта в рамках мембранной ионной теории Ходжкина-Хаксли [16] можно предположить, что число открытых каналов (No) пропорционально величине хордовой проводимости GNa(E), а число закрытых каналов (N^ определяется функцией \ GNamax - GNa(E) К Тогда [12]: lim(No/Nc)=lim[GNa(E)/ ^GNamax --^ - ^ - GNa(E) H^Cexp[ZeffeE/kT], E^ -^ где С - константа, Zeff - эффективный заряд, выраженный в единицах заряда электрона е, k - постоянная Больцмана, T - абсолютная температура. При Е^ -^ предел исследуемой функции стремится к одноэкспоненциальной зависимости, представляющей собой распределение Больцмана. В логарифмическом масштабе эта функция может быть наглядно представлена с удовлетворительной точностью с помощью регрессионной прямой, проходящей через начальные экспериментальные точки. На рис. 4 представлен этот способ построения Zeff. Тангенсы углов наклона регрессионных прямых построены здесь по первым точкам и определяют предельную логарифмическую чувствительность к потенциалу №^.8-кана-лов. Значения Zeff указаны рядом с регрессионными прямыми, что позволяет оценить изменение Zeff при добавлении исследуемого агента. Приложение гексапептида PKEKKA снижало значение с Zeff = 6,6 (в контрольном эксперименте) до значения Zeff =5,0. Рис. 4. Влияние гексапептида PKEKKA в концентрации 100 нмоль/л на потенциалочувствительность активационной воротной системы медленных натриевых каналов. Экспоненциальная функция, представленная в логарифмическом масштабе (ось ординат), позволяет определить величину Zeff по тангенсу угла наклона асимптот, проведенных к начальным участкам этих функций в контрольном опыте и после приложения гексапептида. На рис. 5 суммированы полученные нами результаты. В контрольных опытах величина эффективного заряда составляла Zeff = 6,6±0,4 (n=12). После приложения 125 нмоль/л PRERRA величина Zeff составила 4,4±0,3 (n=8), после приложения 100 нмоль/л PRARRA величина Zeff снизилась до 5,0±0,5 (n=33), после приложения 100 нмоль/л PKEKKA Zeff был равен 4,9±0,4 (n=17). Обсуждение результатов. Изученные нами ранее молекулы дефенсинов кролика NP-1, NP-4 и NP-5 [1-5] состоят из 33 аминокислотных остатков и обладают сложной структурой, что сильно затрудняет возможность их прямого синтеза и, как следствие, ограничивает их потенциальную применимость в качестве лекарственных средств. В этой связи были предприняты попытки выделить фрагсистемы медленных натриевых каналов после воздействия пептидов. Контрольное значение Zeff = 6,6±0,4 (n=12). После приложения 125 нмоль/л PRERRA величина Zeff составила 4,4±0,3 (n=8), после приложения 100 нмоль/л PRARRA величина Zeff составила 5,0±0,5 (n=33), после приложения 100 нмоль/л PKEKKA Zeff составила 4,9±0,4 (n=17). * Отличия от контрольного значения статистически достоверны. менты молекул дефенсинов, которые были бы относительно легко синтезируемы, но в то же время сохраняли бы необходимый спектр физиологически важных свойств, в первую очередь в отношении их анальгетического действия. Рассматриваемые в настоящей работе гексапептиды были выбраны следующим образом. Гексапептид PRERRA (Pro-Arg-Glu-Arg-Arg-Ala-NH2) является отрезком аминокислотной последовательности молекулы дефенсина NP-1 (c 12-го по 17-й остатки). Он включает глутаминовую кислоту (Glu), которая, согласно высказанному нами ранее предположению, может быть ответственна за лиганд-рецепторное связывание дефенсина с молекулярной мишенью, ведущему к снижению величины эффективного заряда ак 82 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 тивационной воротной системы №^.8-каналов, управляющих кодированием болевого сигнала [14, 15]. Гексапептид PRARRA (Pro-Arg-Ala-Arg-Arg-Ala) был получен из PRERRA точечной заменой Glu на Ala, а PKEKKA - заменой трех Arg на Lys. Все три указанные молекулы в соответствии с результатами наших экспериментов (см. рис. 5) способны модулировать функционирование Nav1.8-каналов в концентрациях, составляющих приблизительно 100 нмоль/л. Следовательно, поскольку замена Glu на Ala (переход от PRERRA к PRARRA) не приводит к потере активности пептида, можно сделать вывод, что наличие в молекуле Glu не является необходимым условием, определяющим способность пептида к связыванию с каналом, что расходится с нашими более ранними представлениями. С другой стороны, сохранение наблюдаемого эффекта при переходе от PRERRA к PKEKKA свидетельствует о том, что в формировании лиганд-рецепторного комплекса участвует положительно заряженная функциональная группа. Только Arg и Lys в ряду 20 естественных аминокислот несут положительный заряд в боковой цепи при физиологически адекватных условиях, и наличие у PKEKKA достоверно определенной способности снижать Zeff говорит о взаимозаменяемости этих двух аминокислот в процессе связывания гексапептидов с молекулярной мишенью, являющейся частью аминокислотной последовательности канала. На основании этого можно предположить, что ли-ганд-рецепторное взаимодействие указанных пепти дов происходит за счет формирования солевых связей, включающих положительно заряженные функциональные группы в составе молекул пептидов (Arg или Lys) и отрицательно заряженные аминокислотные остатки в составе мишени (например, Glu или Asp). Значительная величина положительного заряда исследуемых гексапептидов свидетельствует в пользу того, что на начальном этапе связывания рассматриваемые молекулы за счет электростатических сил притягиваются к отрицательно заряженной поверхности клеточной мембраны и удерживаются около нее, после чего происходит образование лиганд-рецептор-ного комплекса с медленным натриевым каналом. Анализируя возможные анальгетические свойства исследуемых молекул, необходимо еще раз отметить, что хотя действующие концентрации гексапептидов весьма низки и находятся в диапазоне 100 нмоль/л, они на несколько порядков превышают полученную нами величину КД для молекулы дефенсина NP-1 (2 пмоль/л). Возможно, это является следствием эволюционного процесса, результатом которого стал уникальный созданный природой пространственный и структурный дизайн указанной молекулы, способной выступать в качестве как эндогенного антибиотика, так и анальгетика. Она отличается высокой структурной жесткостью за счет присутствия трех дисульфидных мостиков, устойчива к действию гидролизующих ферментов, относительно компактна, а также обладает амфипатически-ми свойствами.

V B Plakhova

I. P. Pavlov Institute for Physiology RAS

St.-Petersburg, Russia

I V Rogachevskiy

I. P. Pavlov Institute for Physiology RAS

St.-Petersburg, Russia

T N Shelykh

I. P. Pavlov Institute for Physiology RAS

St.-Petersburg, Russia

S A Podzorova

I. P. Pavlov Institute for Physiology RAS

St.-Petersburg, Russia

B V Krylov

I. P. Pavlov Institute for Physiology RAS

Email: krylov@infran.ru
St.-Petersburg, Russia

  1. Ноздрачев А. Д., Крылов Б. В., Сабанов В. С. и др. Эндогенные антибиотики дефенсины как возможные регуляторы функционирования натриевых каналов нейронов спинномозговых ганглиев // Доклады Академии наук.- 1997.- Т. 355, № 5.- С. 705-707.
  2. Плахова В. Б., Рогачевский И. В., Щеголев Б. Ф. и др. Дефенсин NP-4 уменьшает потенциалочувствительность медленных натриевых каналов сенсорных нейронов // Сенсорные системы.- 2005.- Т. 19, № 2.- С. 110-116.
  3. Плахова В. Б., Щеголев Б. Ф., Рогачевский И. В. и др. Возможный молекулярный механизм взаимодействия дефенсина с мембраной сенсорного нейрона // Росс. физиол. журн.- 2000.- Т. 86, № 11.- С. 1471-1480.
  4. Рогачевский И. В., Плахова В. Б., Щеголев Б. Ф. и др. Рецептор дефенсина: возможный механизм снижения возбудимости мембраны сенсорного нейрона // Доклады Академии наук.- 2000.- Т. 375, № 6.- С. 843-846.
  5. Щеголев Б. Ф., Рогачевский И. В., МакКи М. Л. и др. Квантовохимическое исследование равновесной геометрии и электронного строения молекул эндогенных пептидов NP-4 и NP-5 // Журнал общей химии.- 2005.- Т. 75, № 3.- С. 509-515.
  6. Elliott A. A., Elliott J. R. Characterization of TTX-sensitive and TTX-resistant sodium currents in small cells from adult rat dorsal root ganglia // J. Physiol. (Lond.).- 1993.- Vol. 463, № 1.- P. 39-56.
  7. Yachnev I. L., Plakhova V. B., Podzorova S. A. et al. Mechanism of pain relief by low-power infrared irradiation: ATP is an IR-target molecule in nociceptive neurons // Med. Chemistry.- 2012.- Vol. 8, № 1.- P. 14-21.
  8. Kostyuk P. G., Krishtal O. A., Pidoplichko V. I. Effect of internal fluoride and phosphate on membrane currents during intracellular dialysis of nerve cells // Nature.- 1975.- Vol. 257, № 5528.- P. 691-693.
  9. Hamill O. P., Marty A., Neher E. et al. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches // Pflugers Arch.- 1981.- Vol. 391, № 1.- P. 85-100.
  10. Hodgkin A. L., Huxley A. F. Currents carried by sodium and potassium ions through the membrane of the giant axon of Loligo // J. Physiol.-1952.- Vol. 116, № 4.- P. 449-472.
  11. Hodgkin A. L., Huxley A. F. The dual effect of membrane potential on sodium conductance in the giant axon of Loligo // J. Physiol.- 1952.-Vol. 116, №4.- P. 497-506.
  12. Алмерс В. Воротные токи и движение зарядов в возбудимых мембранах // Мембраны: ионные каналы.- M.: Мир, 1981.-С. 129-236.
  13. Крылов Б. В., Дербенев А. В., Подзорова С. А. и др. Морфин уменьшает чувствительность к потенциалу медленных натриевых каналов // Росс. физиол. журн.- 1999.- Т. 85, № 2.- С. 225-236.
  14. Карымова Е. А., Катина И. Е., Плахова В. Б. и др. Возможный механизм кодирования ноцицептивных сигналов: роль медленных натриевых каналов // Сенсорные системы.- 2008.- Т. 22, № 3.- С. 257-270.
  15. Jarvis M. F., Honore P., Shieh C. C. et al. A-803467, a potent and selective Nav1.8 sodium channel blocker, attenuates neuropathic and inflammatory pain in the rat // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 2007.- Vol. 104, № 20.- P. 8520-8525.
  16. Hodgkin A. L., Huxley A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve // J. Physiol.- 1952.- Vol. 117, № 4.- P. 500-544.

Views

Abstract - 57

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2013 Plakhova V.B., Rogachevskiy I.V., Shelykh T.N., Podzorova S.A., Krylov B.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies