PROGNOSIS OF NEUROLOGICAL SYMPTOMATOLOGY PRESERVATION BY THE END OF THE FIRST YEAR OF LIFE IN NEWBORN BABIES, WHO HAD CYTOMEGALOVIRUS INFECTION

Abstract


Follow-up clinical and immunological studies were undertaken to examine the CD28+ T-lymphocyte, CD40+ B-lymphocyte response in the sera of neonatal infants with cytomegalovirus infection. The pathogenetic role of anti-infective protection was established. The significant decrease in the levels of CD20 +CD40 + and lowering CD3 +CD20 + was found to be a prognostically poor determinant serios cytomegalovirus virus infection. It was revealed that for the preservation of neurological symptoms by the end of the first year of life it is statistically significant to determine in peripheral blood functional activity of CD3, CD4, CD40T-lympho-cytes, lymphocytes expressing CD28, CD3 -CD28+ in the total population, T-lymphocytes without CD28 (CD3+CD28 -) costimulation marker and also T-lymphocytes expressing CD71+, CD95+ markers of late activation on their surface.

Введение. Актуальность изучения цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) обусловлена широкой циркуляцией цитомегаловирусов в популяции и высокой частотой передачи их от матери к плоду [1, 2]. Цитомегаловирусная инфекция рассматривается как одна из ведущих причин мертворождаемо-сти, самопроизвольных выкидышей, преждевременных родов, заболеваемости новорожденных и младенческой смертности [3, 4]. Значимое место в защите новорожденных от цитомегаловирусной инфекции занимает иммунная система. Известно, что течение ЦМВИ сопряжено с иммунодепрессией, в частности со снижением функциональной активности Т-лимфоцитов [5]. Выраженность иммунного ответа может определять клиническое течение и исход заболевания при ЦМВИ, поэтому изучение механизмов иммунодепрессии при данном заболева нии является чрезвычайно важным. Исследованиями последних лет идентифицированы пути передачи клеточных и межклеточных сигналов, осуществляемых с участием молекул костимуляции, усиливающих пролиферативную активность Т-лимфоцитов и повышающих способность к синтезу цитокинов. Однако в доступной литературе имеются единичные работы по изучению молекул костимуляции (CD28 и CD40) у детей первых месяцев жизни [6-8]. Причастность апоптоза к формированию иммунодепрессии при ЦМВИ недостаточно изучена. Усиление экспрессия CD95 на лимфоцитах периферической крови может обусловливать дальнейшее развитие программированной клеточной гибели [9]. Целью данной работы явилось изучение костиму-лирующих молекул (CD28, CD40), маркеров активации (CD69, CD71) и маркера готовности к апоп- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 85 тозу (CD95) на лимфоцитах периферической крови у новорожденных с клиническими проявлениями ци-томегаловирусной инфекции и определение прогностических критериев исхода церебральной патологии к концу первого года жизни у детей, перенесших ци-томегаловирусную инфекцию (ЦМВИ) в периоде новорожденности. Материалы и методы исследования. Изучены иммунологические показатели у 106 новорожденных с цитомегаловирусной инфекцией, находившихся на стационарном лечении в отделении патологии новорожденных ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. В зависимости от тяжести заболевания дети были разделены на группы: 1-я - цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), типичная генерализованная форма (тяжелая) - 54 человек; 2-я - ЦМВИ, типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой (среднетяжелая) - 52 человек. Контрольную группу составили 15 условно здоровых детей обоего пола в возрасте до одного месяца, не инфицированных герпесвирусами. Всем детям на первом месяце жизни проводили комплексное клинико-лабораторное обследование, включавшее использование молекулярно-биологического (ПЦР) метода определения вируса цитомегалии. В качестве материала для исследования пациентов служили периферическая кровь и моча. Использовали набор реагентов производства «АмплиСенс» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ) и оборудования, включающего многоканальный амплификатор ДНК «Терцик» (производство ДНК-Технология, г. Москва) с компьютером и программным обеспечением «Sigmagel» (Швеция). Определение специфических антител классов IgG и IgM в сыворотке крови к цито-мегаловирусу (CMV) проводилось непрямым твердофазным иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест», г. Новосибирск. Диагностика цито-мегаловирусной инфекции основывалась на комплексной оценке клинической картины заболевания и результатах лабораторных исследований. Диагноз цитомегаловирусной инфекции ставился при выявлении ДНК цитомегаловируса, в крови и в моче и нарастании титров специфических антител класса IgG в сыворотке крови к цитомегаловирусу в динамике в последующие сроки наблюдения либо при наличии специфических антител IgM в сыворотке крови у ребенка. Содержание лимфоцитов, экспрессирующих CD28, CD40, СD3+, СD4+, СD8+, СD69+, СД71+, СD95+, СD3+СD28+, СD3+ СD28-, СD3-СD28+, СD20+СD40+ периферической крови определяли на проточном лазерном цитофлуори-метре «Beckman COULTER» Epics XL II (США) с помощью моноклональных антител к кластерам диф-ференцировки СD3+, СD20+, СD4+, СD8+, СD69+, СD71+СD28+, СD40+, СD95+ фирмы IMMUNOTECH (Франция). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «STATISTICA-6». В связи с тем, что распределение данных не подчинялось нормальному закону, для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовался непараметрический критерий Вилкок-сона. Для представления результатов использованы медиана и интерквартильный размах. Различия сравниваемых величин признавались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. Пересечение интерквартильных интервалов не говорит об отсутствии достоверных различий сравниваемых групп [10]. Анализ многомерных нелинейных зависимостей проведен с помощью пакета «PolyAnalist 3.5. Pro». Применены также методы логистической регрессии и «деревья решений» с использованием пакета ППП Deductor 5. Результаты исследования. Проведена сравнительная оценка содержания абсолютного и относительного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции СD3+CD28+, CD20+CD40+ в периферической крови на первом месяце жизни у детей с различными формами герпесвирусной инфекции. У детей с тяжелой формой ЦМВИ отмечалось достоверное (p<0,04) снижение относительного количества клеток с маркерами костимуляции CD3+CD28+ (табл. 1) на фоне достоверного снижения CD28 в общей популяции в сравнении с детьми контрольной группы. Наряду с этим достоверно возрастало (p<0,01) количество CD3+CD28- (табл. 2). При среднетяжелой форме ЦМВИ также отмечалось снижение относительного и абсолютного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции CD3+CD28- при снижении количества лимфоцитов, экспрессирующих CD28, при этом не отмечалось возрастания числа T-лимфоцитов без маркеров костимуляции CD28 (CD3+CD28-). В наших исследованиях с целью более глубокого понимания нарушений в гуморальном звене иммунитета было проведено определение молекул CD40 (табл. 3). Полученные данные сравнивались с данными контрольной группы. При этом в группе детей с ЦМВИ, 86 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 генерализованной формой необходимо отметить достоверное увеличение количества активированных лимфоцитов с маркерами костимуляции CD20+CD40+. явило уточняющие критерии прогноза сохранения церебральной патологии у обследованного контингента детей. Таб лица 1 Динамика показателей клеточного иммунитета у детей с герпесвирусной инфекцией (CD28 и CD3+ CD28+) (срок наблюдения 1 мес) Группа CD28 CD3+CD28+ % 109/л % 109/л ЦМВИ, тяжелая Медиана 1,70 0,09 50,55 2,79 форма (1-я) (n=54) (0,64-3,45)** (0,03-0,18) (46,80-60,20) (1,70-3,75) * 0,0002 0,001 0,04 0,46 р1-2 0,35 0,37 0,01 0,001 ЦМВИ, среднетяже Медиана 1,70 0,06 52,35 1,87 лая форма (2-я) (0,40-3,59) (0,01-0,19) (47,18-59,95) (1,67-3,30) (n=52) * 0,0002 0,0004 0,002 0,0008 Контрольная группа Медиана 3,70 0,15 68,10 2,93 (n=15) (2,25-6,60) (0,09-0,24) (42,05-85,50) (1,38-3,17) Здесь и в табл. 2, 3: достоверность отличий от показателей контрольной группы в возрасте 1 мес; н/д - недостоверно; в скобках даны значения 1-3-го квартиля; р - достоверность различий между группами. Таблица 2 Динамика показателей клеточного иммунитета у детей с герпесвирусной инфекцией CD3-CD28+ и CD3+CD28- (срок наблюдения 1 мес) Группа CD3-CD28+ CD3+CD28- % 109/л % 109/л ЦМВИ, тяжелая Медиана 2,01 0,13 6,70 0,49 форма (1-я) n=54 (0,34-5,40)** (0,02-0,35) (2,87-22,45) (0,15-1,41) * 0,28 0,16 0,01 0,0001 р1-2 0,0001 0,0001 0,0002 0,0001 ЦМВИ, среднетяже Медиана 1,00 0,08 5,35 0,27 лая форма (2-я) (0,49-5,13) (0,02-0,37) (3,38-10,3) (0,12-0,42) (n=52) * 0,0002 0,0009 0,1 0,19 Контрольная группа Медиана 4,20 0,22 3,10 0,012 (n=15) (2,40-8,70) (0,09-0,66) (1,50-7,80) (0,04-0,22) В результате динамического наблюдения за обследуемыми детьми в течение первого года жизни выявлено, что к концу первого года жизни у части детей с ЦМВИ имела место задержка психомоторного развития (44,8%), которая сочеталась в ряде случаев с глухотой (5,9%), эпилепсией (11,9%), спастическим тетрапарезом (32,2%) и слепотой (13,4%). Нами обследованы в возрасте трех месяцев 122 ребенка, перенесших ЦМВИ в периоде новорож-денности, из них 35 человек с сохраняющейся неврологической симптоматикой к концу первого года жизни и 87 - с отсутствием неврологической симптоматики к концу первого года жизни. Применение методов логистической регрессии и «деревья решений» с использованием пакета ППП Deductor 5 вы- При использовании в качестве исходных параметров для прогнозирования сохранения неврологи-ческой симптоматики при ЦМВИ к концу первого года жизни значения лимфоцитов с рецепторами CD3+, СD4+, CD8+, CD20+, CD28, CD40, CD3+CD28+, CD3+CD28-, CD3-CD28+, CD20+CD40 в результате процедуры отсеивания было обнаружено, что статистически значимым для сохранения неврологической симптоматики при ЦМВИ к концу первого года жизни является определение в периферической крови функциональной активности Т-лимфоцитов CD3, CD4, лимфоцитов, экспрессирующих CD 28, CD3-CD28+ в общей популяции, Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 (CD3+CD28-) и молекул CD40 (табл. 4). МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 87 Для лучшей интерпретации и представления полученных данных нами применялись методы логистической регрессии и ROC-анализа. Коэффициенты логистической регрессии, используемые для расчета точки разделения с использованием вышеуказанных параметров, представлены в табл. 5. Прогностическая ценность положительного результата - 32,3. Для визуальной оценки полученной формулы построена ROC-кривая (рис. 1). Показатель AUC, отражающий площадь под кривой, равный 0,873, свидетельствует об очень хорошем качестве модели. Таблица 3 Динамика показателей гуморального звена иммунной системы у детей с герпесвирусной инфекцией (CD40+, CD 20+CD40+) (срок наблюдения 1 мес) Группа CD40+ CD20+CD40+ % 109/л % 109/л ЦМВИ, тяжелая Медиана 0,90 0,05 18,20 0,85 форма (1-я) (n=54) (0,26-1,56)** (0,02-0,11) (10,60-27,95)** (0,52-1,24) * 0,006 0,005 0,0001 0,0001 р1-2 0,09 0,25 0,001 0,0007 ЦМВИ, среднетяже Медиана 0,40 0,03 18,30 0,66 лая форма (2-я) (0,13-0,84) (0,01-0,07) (11,85-23,60) (0,32-1,36) (n=52) * 0,0003 0,0006 0,0003 0,0001 Контрольная группа Медиана 1,27 0,06 5,90 0,22 (n=15) (0,30-5,80) (0,01-0,22) (3,15-11,45) (0,11-0,38) Таблица 4 Уровень значимости содержания в сыворотке крови популяций Т- и В-лимфоцитов для прогноза сохранения неврологической симптоматики у новорожденных, перенесших ЦМВИ Таблица 5 Коэффициенты логистической регрессии для популяций Т- и В-лимфоцитов, используемые для прогноза сохранения неврологической симптоматики у новорожденных, перенесших п п/ 2 Показатель Значимость, % ЦМВИ Показатель Коэффициент 1 CD3-CD28+ 44,053 24,104 2 CD4 <Константа> -0,45877 3 CD3+CD28- 14,015 CD3 0,1062 4 CD40 6,991 CD4 -0,18201 5 CD3 6,536 CD8 0,016714 6 CD28 4,300 CD20 -0,08715 7 CD20+CD40+ 0 CD3+CD28+ -0,015979 8 CD8 0 CD3-CD28+ 0,074216 9 CD3+CD28+ 0 CD3+CD28- 0,034959 10 CD20 0 CD20+CD40+ CD28 0,090792 0,19524 С использованием коэффициентов логистической CD40 -0,2862 регрессии рассчитана формула прогноза сохранения неврологической симптоматики. ((CD3-CD28+ X 0,074) + CD4+ X (-0,182) + + (CD3+CD28- X 0,035) + CD40 X (-0,2862) + + CD3 X 0,1062)+ (CD28 X 0,1952)) - 0,4588 Если результат расчета по формуле >0,39 у ребенка будут церебральные нарушения к концу первого года жизни. При значении <0,32 у ребенка к концу года церебральные нарушения выявляться не будут. Чувствительность - 71,43%, специфичность - 88,89%. При использовании для прогноза сохранения церебральной патологии к концу года у детей, перенесших цитомегаловирусную инфекцию в периоде но-ворожденности, в качестве исходных параметров уровней Т-лимфоцитов с рецепторами CD69, CD71, CD95 в результате процедуры отсеивания была обнаружена статистическая значимость всех трех показателей. Уровень значимости содержания в сыворотке крови маркеров активации лимфоцитов отражен в табл. 6. 88 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Для лучшей интерпретации и представления полученных данных нами применялись методы логистической регрессии и ROC-анализа. Коэффициенты логистической регрессии, используемые для расчета точки разделения с использованием вышеуказанных параметров представлены в табл. 7. AUC=0,873 Negatre=False; Positire=True Специфичность% Рис. 1. ROC -кривая для показателей CD3 CD28+, CD3+CD28 , CD3, CD4, CD28, CD40 при прогнозировании сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни у новорожденных, перенесших ЦМВИ. Cut off - точка разделения; AUC - площадь под кривой. Таблица 6 Уровень значимости содержания маркеров активации лимфоцитов для прогноза сохранения неврологической симптоматики у новорожденных, перенесших ЦМВИ № Показатель Значимость, % 1 CD95 80,691 2 CD71 14,260 3 CD69 5,049 Таблица 7 Коэффициенты логистической регрессии маркеров активации лимфоцитов, используемые при прогнозе сохранения неврологической симптоматики у новорожденных, перенесших ЦМВИ Показатель Коэффициент Константа -8,4371 CD69 -9,0761 CD71 4,1389 CD95 2,8098 С использованием коэффициентов логистической регрессии рассчитана формула прогноза сохранения неврологической симптоматики. (CD69 X (-9,0761) + CD71 X 4,1389 + CD95 X X 2,8098) - 8,4271. Если результат расчета по формуле >0,32 у ребенка будут церебральные нарушения к концу первого года жизни. При значении <0,32 у ребенка к концу года церебральные нарушения выявляться не будут. Чувствительность - 97,37%, специфичность - 97,37%. Прогностическая ценность положительного результата 645. Для визуальной оценки полученной формулы построена ROC-кривая (рис. 2). AUC=0,996 Negatre=False; Positire=True Специфичность% Рис. 2. OC -кривая для показателей CD69,CD71, CD95 при прогнозировании сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни у новорожденных, перенесших ЦМВИ. Cut off - точка разделения; AUC - площадь под кривой. Показатель AUC, отражающий площадь под кривой, равный 0,996, свидетельствует об очень хорошем качестве модели. Обсуждение результатов. Проведенными исследованиями установлено, что при ЦМВИ у новорожденных детей выявлялось иммунодефицитное состояние, характеризующееся нарушениями кооперации Ти В-лимфоцитов и преобладанием процессов негативной активации (апоптоз). Изучение экспрессии молекул костимуляции привело к пониманию механизмов, лежащих в основе развития ЦМВИ, и позволило по-новому взглянуть на их патогенез. Сигналы, поступающие в T-клетку, недостаточны для индукции экспрессии генов активации и пролиферации. Эти процессы усиливаются благодаря сигналам, запускаемым через молекулу CD28. Отсутствие одного из компонентов комплекса костимуляции приводит к дефектам иммунной защиты. При ЦМВИ, тяжелой форме более высокий, чем в других группах больных, уровень абсолютного и относительного количества МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 89 клеток без маркеров костимуляции СD3+CD28-и более выраженное снижение числа клеток с маркерами CD3+CD28+, через которые проводятся в клетку костимулирующие сигналы, необходимые для активации Т-хелперов, вызвало угнетение клеточного звена иммунитета на внедрение патогена. Это являлось одной из причин более тяжелого течения заболевания у пациентов этой группы. Как и при взаимодействии антигенпредставляющей клетки с Т-хел-перами, при T-B-кооперации имеется двусторонняя направленность сигналов, однако преобладающее направление их в этом случае происходит от T- к B-клетке, и при этом активируется B-лимфоцит. Высокая значимость определения повышенного содержания В-клеток, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы CD40 (CD20+CD40+), отражает важность прямого контакта между Ти В-клетками, которые осуществляются через эту молекулу. Сигнал, возникающий в результате участия клеток CD20+CD40+, является основным ко-стимулирующим сигналом при включении ответа В-лимфоцитов, что в конечном итоге обеспечивает пролиферацию B-лимфоцитов. Изменения в иммунном статусе пациентов со среднетяжелой формой ЦМВИ носили однонаправленный характер, но по некоторым параметрам были менее выраженными, чем при тяжелой форме ЦМВИ. Статистическая значимость Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 свидетельствует о специфичности CD3+CD28- Т-лимфоцитов для ЦМВИ. Т-лимфоциты CD3+CD28- появляются как следствие ЦМВИ, коррелируют обратно пропорционально с CD3+CD28+ Т-лимфоцитами, что указывает на важность отсутствия молекулы костимуляции CD28 для прогноза неблагоприятного течения ЦМВИ в виде сохранения неврологических нарушений к концу первого года жизни. Заключение. Развитие цитомегаловирусной инфекции у детей обусловлено нарушением противовирусного иммунитета с иммунологическими сдвигами в Т-клеточном (снижение CD3+CD28+) и в В-кле-точном (увеличение CD20+CD40+) звеньях иммунной системы. Тяжелая форма ЦМВИ характеризуется достоверно более выраженным снижением экспрессии CD3+CD28+ и увеличением CD20+CD40+. Дети, перенесшие ЦМВИ в периоде новорожденности, в 44,8% случаев имеют сохранение неврологической симптоматики к концу первого года жизни. Статистически значимым для сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни является определение в периферической крови функциональной активности Т-лимфоцитов CD3, CD4, CD40, лимфоцитов, экспрессирующих CD 28, CD3-CD28+ в общей популяции, Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 (CD3+CD28-), а также Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры активации CD69, CD71 и готовности к апоптозу CD95.

L V Kravchenko

Rostov Scientific-Research Institute of Obstetrics and Pediatrics

Email: larakra@list.ru
Russia

A A Afonin

Rostov Scientific-Research Institute of Obstetrics and Pediatrics

Russia

  1. Орджоникидзе Н. В., Агаронян Н. Г. Современные аспекты внутриутробной инфекции // Журнал Российского общества акушеров-гинекологов.- 2005.- № 1.- С. 8-12.
  2. Перинатальные инфекции / под ред. А. Я. Сенчук, З. М. Дубоссарской.- М.: Медицинское информационное агентство, 2005.
  3. Неонатология: национальное руководство / под ред. Н. Н. Володина.- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.- 848 с.
  4. Бочарова И. И., Аксенов А. Н., Башкин Н. Ф. и др. Итоги и перспективы научных исследований по проблеме внутриутробной инфекции новорожденных // Российский вестник акушера-гинеколога.- 2007.- № 5.- С. 60-63.
  5. Whitley R. Neonatal herpes simplex virus infection // Curr. Opin. Infect. Dis.- 2004.- Vol. 17, № 3.- P. 243-246.
  6. Хаитов Р. М., Манько В. М. Физиологические особенности активации и торможения функций клеток иммунной системы. Рецепторные структуры и внутриклеточные сигнальные пути макрофагов и естественных клеток-киллеров // Российский физиологический журнал им. И. М. Сеченова.- 2006.- Т. 92, № 6.- С. 662-667.
  7. Gaytant M. A., Rours G. I., Steegers E. A. et al. Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature // Eur. J. Pеdiatr.- 2003.- Vol. 162, № 34.- P. 248-253.
  8. Рабсон А., Ройт А., Далвз П. Основы медицинской иммунологии.- М.: Бином, 2006.
  9. Барышников А. Ю. Иммунологические проблемы апоптоза.- М.: Эдиториал УРСС, 2002.
  10. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA.- М.: МедиаСфера, 2002.

Views

Abstract - 21

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2013 Kravchenko L.V., Afonin A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies