Full Text

Введение. Актуальность изучения цитомегаловирусной инфекции (ЦМВИ) обусловлена широкой циркуляцией цитомегаловирусов в популяции и высокой частотой передачи их от матери к плоду [1, 2]. Цитомегаловирусная инфекция рассматривается как одна из ведущих причин мертворождаемо-сти, самопроизвольных выкидышей, преждевременных родов, заболеваемости новорожденных и младенческой смертности [3, 4]. Значимое место в защите новорожденных от цитомегаловирусной инфекции занимает иммунная система. Известно, что течение ЦМВИ сопряжено с иммунодепрессией, в частности со снижением функциональной активности Т-лимфоцитов [5]. Выраженность иммунного ответа может определять клиническое течение и исход заболевания при ЦМВИ, поэтому изучение механизмов иммунодепрессии при данном заболева нии является чрезвычайно важным. Исследованиями последних лет идентифицированы пути передачи клеточных и межклеточных сигналов, осуществляемых с участием молекул костимуляции, усиливающих пролиферативную активность Т-лимфоцитов и повышающих способность к синтезу цитокинов. Однако в доступной литературе имеются единичные работы по изучению молекул костимуляции (CD28 и CD40) у детей первых месяцев жизни [6-8]. Причастность апоптоза к формированию иммунодепрессии при ЦМВИ недостаточно изучена. Усиление экспрессия CD95 на лимфоцитах периферической крови может обусловливать дальнейшее развитие программированной клеточной гибели [9]. Целью данной работы явилось изучение костиму-лирующих молекул (CD28, CD40), маркеров активации (CD69, CD71) и маркера готовности к апоп- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 85 тозу (CD95) на лимфоцитах периферической крови у новорожденных с клиническими проявлениями ци-томегаловирусной инфекции и определение прогностических критериев исхода церебральной патологии к концу первого года жизни у детей, перенесших ци-томегаловирусную инфекцию (ЦМВИ) в периоде новорожденности. Материалы и методы исследования. Изучены иммунологические показатели у 106 новорожденных с цитомегаловирусной инфекцией, находившихся на стационарном лечении в отделении патологии новорожденных ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. В зависимости от тяжести заболевания дети были разделены на группы: 1-я - цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), типичная генерализованная форма (тяжелая) - 54 человек; 2-я - ЦМВИ, типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой (среднетяжелая) - 52 человек. Контрольную группу составили 15 условно здоровых детей обоего пола в возрасте до одного месяца, не инфицированных герпесвирусами. Всем детям на первом месяце жизни проводили комплексное клинико-лабораторное обследование, включавшее использование молекулярно-биологического (ПЦР) метода определения вируса цитомегалии. В качестве материала для исследования пациентов служили периферическая кровь и моча. Использовали набор реагентов производства «АмплиСенс» (ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ) и оборудования, включающего многоканальный амплификатор ДНК «Терцик» (производство ДНК-Технология, г. Москва) с компьютером и программным обеспечением «Sigmagel» (Швеция). Определение специфических антител классов IgG и IgM в сыворотке крови к цито-мегаловирусу (CMV) проводилось непрямым твердофазным иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест», г. Новосибирск. Диагностика цито-мегаловирусной инфекции основывалась на комплексной оценке клинической картины заболевания и результатах лабораторных исследований. Диагноз цитомегаловирусной инфекции ставился при выявлении ДНК цитомегаловируса, в крови и в моче и нарастании титров специфических антител класса IgG в сыворотке крови к цитомегаловирусу в динамике в последующие сроки наблюдения либо при наличии специфических антител IgM в сыворотке крови у ребенка. Содержание лимфоцитов, экспрессирующих CD28, CD40, СD3+, СD4+, СD8+, СD69+, СД71+, СD95+, СD3+СD28+, СD3+ СD28-, СD3-СD28+, СD20+СD40+ периферической крови определяли на проточном лазерном цитофлуори-метре «Beckman COULTER» Epics XL II (США) с помощью моноклональных антител к кластерам диф-ференцировки СD3+, СD20+, СD4+, СD8+, СD69+, СD71+СD28+, СD40+, СD95+ фирмы IMMUNOTECH (Франция). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «STATISTICA-6». В связи с тем, что распределение данных не подчинялось нормальному закону, для оценки статистической значимости различий между сравниваемыми группами использовался непараметрический критерий Вилкок-сона. Для представления результатов использованы медиана и интерквартильный размах. Различия сравниваемых величин признавались статистически достоверными при уровне значимости р<0,05. Пересечение интерквартильных интервалов не говорит об отсутствии достоверных различий сравниваемых групп [10]. Анализ многомерных нелинейных зависимостей проведен с помощью пакета «PolyAnalist 3.5. Pro». Применены также методы логистической регрессии и «деревья решений» с использованием пакета ППП Deductor 5. Результаты исследования. Проведена сравнительная оценка содержания абсолютного и относительного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции СD3+CD28+, CD20+CD40+ в периферической крови на первом месяце жизни у детей с различными формами герпесвирусной инфекции. У детей с тяжелой формой ЦМВИ отмечалось достоверное (p<0,04) снижение относительного количества клеток с маркерами костимуляции CD3+CD28+ (табл. 1) на фоне достоверного снижения CD28 в общей популяции в сравнении с детьми контрольной группы. Наряду с этим достоверно возрастало (p<0,01) количество CD3+CD28- (табл. 2). При среднетяжелой форме ЦМВИ также отмечалось снижение относительного и абсолютного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции CD3+CD28- при снижении количества лимфоцитов, экспрессирующих CD28, при этом не отмечалось возрастания числа T-лимфоцитов без маркеров костимуляции CD28 (CD3+CD28-). В наших исследованиях с целью более глубокого понимания нарушений в гуморальном звене иммунитета было проведено определение молекул CD40 (табл. 3). Полученные данные сравнивались с данными контрольной группы. При этом в группе детей с ЦМВИ, 86 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 генерализованной формой необходимо отметить достоверное увеличение количества активированных лимфоцитов с маркерами костимуляции CD20+CD40+. явило уточняющие критерии прогноза сохранения церебральной патологии у обследованного контингента детей. Таб лица 1 Динамика показателей клеточного иммунитета у детей с герпесвирусной инфекцией (CD28 и CD3+ CD28+) (срок наблюдения 1 мес) Группа CD28 CD3+CD28+ % 109/л % 109/л ЦМВИ, тяжелая Медиана 1,70 0,09 50,55 2,79 форма (1-я) (n=54) (0,64-3,45)** (0,03-0,18) (46,80-60,20) (1,70-3,75) * 0,0002 0,001 0,04 0,46 р1-2 0,35 0,37 0,01 0,001 ЦМВИ, среднетяже Медиана 1,70 0,06 52,35 1,87 лая форма (2-я) (0,40-3,59) (0,01-0,19) (47,18-59,95) (1,67-3,30) (n=52) * 0,0002 0,0004 0,002 0,0008 Контрольная группа Медиана 3,70 0,15 68,10 2,93 (n=15) (2,25-6,60) (0,09-0,24) (42,05-85,50) (1,38-3,17) Здесь и в табл. 2, 3: достоверность отличий от показателей контрольной группы в возрасте 1 мес; н/д - недостоверно; в скобках даны значения 1-3-го квартиля; р - достоверность различий между группами. Таблица 2 Динамика показателей клеточного иммунитета у детей с герпесвирусной инфекцией CD3-CD28+ и CD3+CD28- (срок наблюдения 1 мес) Группа CD3-CD28+ CD3+CD28- % 109/л % 109/л ЦМВИ, тяжелая Медиана 2,01 0,13 6,70 0,49 форма (1-я) n=54 (0,34-5,40)** (0,02-0,35) (2,87-22,45) (0,15-1,41) * 0,28 0,16 0,01 0,0001 р1-2 0,0001 0,0001 0,0002 0,0001 ЦМВИ, среднетяже Медиана 1,00 0,08 5,35 0,27 лая форма (2-я) (0,49-5,13) (0,02-0,37) (3,38-10,3) (0,12-0,42) (n=52) * 0,0002 0,0009 0,1 0,19 Контрольная группа Медиана 4,20 0,22 3,10 0,012 (n=15) (2,40-8,70) (0,09-0,66) (1,50-7,80) (0,04-0,22) В результате динамического наблюдения за обследуемыми детьми в течение первого года жизни выявлено, что к концу первого года жизни у части детей с ЦМВИ имела место задержка психомоторного развития (44,8%), которая сочеталась в ряде случаев с глухотой (5,9%), эпилепсией (11,9%), спастическим тетрапарезом (32,2%) и слепотой (13,4%). Нами обследованы в возрасте трех месяцев 122 ребенка, перенесших ЦМВИ в периоде новорож-денности, из них 35 человек с сохраняющейся неврологической симптоматикой к концу первого года жизни и 87 - с отсутствием неврологической симптоматики к концу первого года жизни. Применение методов логистической регрессии и «деревья решений» с использованием пакета ППП Deductor 5 вы- При использовании в качестве исходных параметров для прогнозирования сохранения неврологи-ческой симптоматики при ЦМВИ к концу первого года жизни значения лимфоцитов с рецепторами CD3+, СD4+, CD8+, CD20+, CD28, CD40, CD3+CD28+, CD3+CD28-, CD3-CD28+, CD20+CD40 в результате процедуры отсеивания было обнаружено, что статистически значимым для сохранения неврологической симптоматики при ЦМВИ к концу первого года жизни является определение в периферической крови функциональной активности Т-лимфоцитов CD3, CD4, лимфоцитов, экспрессирующих CD 28, CD3-CD28+ в общей популяции, Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 (CD3+CD28-) и молекул CD40 (табл. 4). МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 87 Для лучшей интерпретации и представления полученных данных нами применялись методы логистической регрессии и ROC-анализа. Коэффициенты логистической регрессии, используемые для расчета точки разделения с использованием вышеуказанных параметров, представлены в табл. 5. Прогностическая ценность положительного результата - 32,3. Для визуальной оценки полученной формулы построена ROC-кривая (рис. 1). Показатель AUC, отражающий площадь под кривой, равный 0,873, свидетельствует об очень хорошем качестве модели. Таблица 3 Динамика показателей гуморального звена иммунной системы у детей с герпесвирусной инфекцией (CD40+, CD 20+CD40+) (срок наблюдения 1 мес) Группа CD40+ CD20+CD40+ % 109/л % 109/л ЦМВИ, тяжелая Медиана 0,90 0,05 18,20 0,85 форма (1-я) (n=54) (0,26-1,56)** (0,02-0,11) (10,60-27,95)** (0,52-1,24) * 0,006 0,005 0,0001 0,0001 р1-2 0,09 0,25 0,001 0,0007 ЦМВИ, среднетяже Медиана 0,40 0,03 18,30 0,66 лая форма (2-я) (0,13-0,84) (0,01-0,07) (11,85-23,60) (0,32-1,36) (n=52) * 0,0003 0,0006 0,0003 0,0001 Контрольная группа Медиана 1,27 0,06 5,90 0,22 (n=15) (0,30-5,80) (0,01-0,22) (3,15-11,45) (0,11-0,38) Таблица 4 Уровень значимости содержания в сыворотке крови популяций Т- и В-лимфоцитов для прогноза сохранения неврологической симптоматики у новорожденных, перенесших ЦМВИ Таблица 5 Коэффициенты логистической регрессии для популяций Т- и В-лимфоцитов, используемые для прогноза сохранения неврологической симптоматики у новорожденных, перенесших п п/ 2 Показатель Значимость, % ЦМВИ Показатель Коэффициент 1 CD3-CD28+ 44,053 24,104 2 CD4 <Константа> -0,45877 3 CD3+CD28- 14,015 CD3 0,1062 4 CD40 6,991 CD4 -0,18201 5 CD3 6,536 CD8 0,016714 6 CD28 4,300 CD20 -0,08715 7 CD20+CD40+ 0 CD3+CD28+ -0,015979 8 CD8 0 CD3-CD28+ 0,074216 9 CD3+CD28+ 0 CD3+CD28- 0,034959 10 CD20 0 CD20+CD40+ CD28 0,090792 0,19524 С использованием коэффициентов логистической CD40 -0,2862 регрессии рассчитана формула прогноза сохранения неврологической симптоматики. ((CD3-CD28+ X 0,074) + CD4+ X (-0,182) + + (CD3+CD28- X 0,035) + CD40 X (-0,2862) + + CD3 X 0,1062)+ (CD28 X 0,1952)) - 0,4588 Если результат расчета по формуле >0,39 у ребенка будут церебральные нарушения к концу первого года жизни. При значении <0,32 у ребенка к концу года церебральные нарушения выявляться не будут. Чувствительность - 71,43%, специфичность - 88,89%. При использовании для прогноза сохранения церебральной патологии к концу года у детей, перенесших цитомегаловирусную инфекцию в периоде но-ворожденности, в качестве исходных параметров уровней Т-лимфоцитов с рецепторами CD69, CD71, CD95 в результате процедуры отсеивания была обнаружена статистическая значимость всех трех показателей. Уровень значимости содержания в сыворотке крови маркеров активации лимфоцитов отражен в табл. 6. 88 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 Для лучшей интерпретации и представления полученных данных нами применялись методы логистической регрессии и ROC-анализа. Коэффициенты логистической регрессии, используемые для расчета точки разделения с использованием вышеуказанных параметров представлены в табл. 7. AUC=0,873 Negatre=False; Positire=True Специфичность% Рис. 1. ROC -кривая для показателей CD3 CD28+, CD3+CD28 , CD3, CD4, CD28, CD40 при прогнозировании сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни у новорожденных, перенесших ЦМВИ. Cut off - точка разделения; AUC - площадь под кривой. Таблица 6 Уровень значимости содержания маркеров активации лимфоцитов для прогноза сохранения неврологической симптоматики у новорожденных, перенесших ЦМВИ № Показатель Значимость, % 1 CD95 80,691 2 CD71 14,260 3 CD69 5,049 Таблица 7 Коэффициенты логистической регрессии маркеров активации лимфоцитов, используемые при прогнозе сохранения неврологической симптоматики у новорожденных, перенесших ЦМВИ Показатель Коэффициент Константа -8,4371 CD69 -9,0761 CD71 4,1389 CD95 2,8098 С использованием коэффициентов логистической регрессии рассчитана формула прогноза сохранения неврологической симптоматики. (CD69 X (-9,0761) + CD71 X 4,1389 + CD95 X X 2,8098) - 8,4271. Если результат расчета по формуле >0,32 у ребенка будут церебральные нарушения к концу первого года жизни. При значении <0,32 у ребенка к концу года церебральные нарушения выявляться не будут. Чувствительность - 97,37%, специфичность - 97,37%. Прогностическая ценность положительного результата 645. Для визуальной оценки полученной формулы построена ROC-кривая (рис. 2). AUC=0,996 Negatre=False; Positire=True Специфичность% Рис. 2. OC -кривая для показателей CD69,CD71, CD95 при прогнозировании сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни у новорожденных, перенесших ЦМВИ. Cut off - точка разделения; AUC - площадь под кривой. Показатель AUC, отражающий площадь под кривой, равный 0,996, свидетельствует об очень хорошем качестве модели. Обсуждение результатов. Проведенными исследованиями установлено, что при ЦМВИ у новорожденных детей выявлялось иммунодефицитное состояние, характеризующееся нарушениями кооперации Ти В-лимфоцитов и преобладанием процессов негативной активации (апоптоз). Изучение экспрессии молекул костимуляции привело к пониманию механизмов, лежащих в основе развития ЦМВИ, и позволило по-новому взглянуть на их патогенез. Сигналы, поступающие в T-клетку, недостаточны для индукции экспрессии генов активации и пролиферации. Эти процессы усиливаются благодаря сигналам, запускаемым через молекулу CD28. Отсутствие одного из компонентов комплекса костимуляции приводит к дефектам иммунной защиты. При ЦМВИ, тяжелой форме более высокий, чем в других группах больных, уровень абсолютного и относительного количества МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 89 клеток без маркеров костимуляции СD3+CD28-и более выраженное снижение числа клеток с маркерами CD3+CD28+, через которые проводятся в клетку костимулирующие сигналы, необходимые для активации Т-хелперов, вызвало угнетение клеточного звена иммунитета на внедрение патогена. Это являлось одной из причин более тяжелого течения заболевания у пациентов этой группы. Как и при взаимодействии антигенпредставляющей клетки с Т-хел-перами, при T-B-кооперации имеется двусторонняя направленность сигналов, однако преобладающее направление их в этом случае происходит от T- к B-клетке, и при этом активируется B-лимфоцит. Высокая значимость определения повышенного содержания В-клеток, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы CD40 (CD20+CD40+), отражает важность прямого контакта между Ти В-клетками, которые осуществляются через эту молекулу. Сигнал, возникающий в результате участия клеток CD20+CD40+, является основным ко-стимулирующим сигналом при включении ответа В-лимфоцитов, что в конечном итоге обеспечивает пролиферацию B-лимфоцитов. Изменения в иммунном статусе пациентов со среднетяжелой формой ЦМВИ носили однонаправленный характер, но по некоторым параметрам были менее выраженными, чем при тяжелой форме ЦМВИ. Статистическая значимость Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 свидетельствует о специфичности CD3+CD28- Т-лимфоцитов для ЦМВИ. Т-лимфоциты CD3+CD28- появляются как следствие ЦМВИ, коррелируют обратно пропорционально с CD3+CD28+ Т-лимфоцитами, что указывает на важность отсутствия молекулы костимуляции CD28 для прогноза неблагоприятного течения ЦМВИ в виде сохранения неврологических нарушений к концу первого года жизни. Заключение. Развитие цитомегаловирусной инфекции у детей обусловлено нарушением противовирусного иммунитета с иммунологическими сдвигами в Т-клеточном (снижение CD3+CD28+) и в В-кле-точном (увеличение CD20+CD40+) звеньях иммунной системы. Тяжелая форма ЦМВИ характеризуется достоверно более выраженным снижением экспрессии CD3+CD28+ и увеличением CD20+CD40+. Дети, перенесшие ЦМВИ в периоде новорожденности, в 44,8% случаев имеют сохранение неврологической симптоматики к концу первого года жизни. Статистически значимым для сохранения неврологической симптоматики к концу первого года жизни является определение в периферической крови функциональной активности Т-лимфоцитов CD3, CD4, CD40, лимфоцитов, экспрессирующих CD 28, CD3-CD28+ в общей популяции, Т-лимфоцитов без маркера костимуляции CD28 (CD3+CD28-), а также Т-лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности маркеры активации CD69, CD71 и готовности к апоптозу CD95.

About the authors

L V Kravchenko

Rostov Scientific-Research Institute of Obstetrics and Pediatrics

Email: larakra@list.ru
Russia

A A Afonin

Rostov Scientific-Research Institute of Obstetrics and Pediatrics

Russia

References

Statistics

Views

Abstract - 34

PDF (Russian) - 1

Refbacks

• There are currently no refbacks.