DEPENDENCE OF STREPTOCOCCUS PYOGENES PROPERTIES FROM THE RGG GENE TRANSCRIPTIONAL LEVEL

Abstract


Streptococcus pyogenes is well-known human pathogen. The transcriptional regulatory protein Rgg controls the variety of S. pyogenes phenotypes, in particular, virulent phenotype. In this study the rgg gene was restored in SF370 rgg- и NZ131 rgg- mutant strains under native and plasmid heterologous promoters. Transcriptional level of rgg gene under the control of heterologous promoter was 2-fold higher than that under the control of native promoter. Restoration of rgg in the chromosome under the control of the native promoter restored wild-type phenotypes. In contrast, episomal complementation of rgg under plasmid heterologous promoter did not restore any of phenotypic properties. Together, the results indicate that the mechanism of Rgg-mediated regulation is complex. Given the importance of Rgg in controlling virulence properties in S. pyogenes, further characterization of the mechanism of Rgg-mediated gene transcription is necessary.

Введение. Streptococcus pyogenes - грамполо-жительный микроорганизм, приводящий к многочисленным патологическим процессам, от фарингита до некротизирующего фасцита, и тяжелым пост-стрептококковым осложнениям [1]. Патогенез заболеваний, вызываемых S. pyogenes, во многом связан с наличием у него секретируемых и локализованных на поверхности микроорганизма факторов патогенности, синтез которых контролируется на стадиях транскрипции, трансляции и по-сттрансляционно [2]. На уровне транскрипции экс прессия генов патогенности находится под контролем разветвленной регуляторной сети, включающей в себя двухкомпонентные регуляторные системы и ДНК-связывающие белки-регуляторы транскрипции. Одним из таких белков-регуляторов является белок Rgg, влияющий на транскрипцию большого числа генов S. pyogenes, что отражается на фенотипических свойствах микроорганизма. В штамме NZ131 инактивация гена rgg привела к изменениям в уровнях транскрипции более 700 генов, и эти изменения отразились на свойствах S. pyogenes, в частности мутант МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 115 ный штамм стал неспособен синтезировать эритро-генный токсин SpeB [3]; у мутантного штамма изменилась экспрессия таких факторов патогенности, как стрептолизин О, стрептолизин S, стрептокиназа, белок Ma^ НАД-гликогидролаза, М-белок, митоген-ный фактор MF-1 и др. [4-6]; инактивация гена rgg оказала влияние на адаптацию S. pyogenes к условиям стресса и повлияла на способность S. pyogenes использовать аминокислоты и углеводы для размножения и роста [6, 7]; инактивация гена rgg повлияла на частоту индукции профага NZ131.1 [6]; штамм, мутантный по гену rgg, стал более вирулентным по сравнению с исходным штаммом NZ131 [8, 9]. Сравнительный анализ транскриптомов четырех штаммов S. pyogenes MGAS5005, CS101, SF370, NZ131 и их rgg мутантов показал, что инактивация гена rgg привела к изменению уровней транскрипции 3, 13, 45 и 706 генов соответственно, что может свидетельствовать о штаммовой специфичности активности регулятора Rgg [10]. Некоторые аминокислоты в белке Rgg, например серин в положении № 103, аргинин в положении № 11, триптофан в положении №142, а также аминокислоты на С-терми-нальном конце белка, принципиально важны для проявления им функциональных свойств [11-13]. Кроме того, не исключено, что на функциональную активность белка Rgg могут влиять не только отдельные аминокислоты, но и изменения в уровне транскрипции кодирующего его гена rgg, которые теоретически могут происходить под действием факторов окружающей среды. Таким образом, целью настоящей работы явилось моделирование изменений в уровне транскрипции гена rgg и изучение этого влияния на фенотипические свойства S. pyogenes. Материалы и методы исследования. В работе использовали штаммы S. pyogenes SF370 (серотип М1, выделен в США от пациента с раневой инфекцией) и NZ131 (серотип М49, выделен в Новой Зеландии от пациента с острым постстрептококковым гломеру-лонефритом), а также созданные на их основе мутантные штаммы по гену rgg, SF370 rgg- и NZ131 rgg- соответственно, охарактеризованные ранее [10], и штамм Enterococcus faecalis UV202. Штаммы S. pyogenes и E. faecalis выращивали в течение ночи при 37 C в присутствии 5% CO2 в среде Todd-Hewitt (Becton Dickinson, США), содержащей 0,2% дрожжевого экстракта (Difco, США). При необходимости добавляли эритромицин или канамицин до конечной концентрации 2,5 мкг/мл и 500 мкг/мл соответственно. Штамм Escherichia coli DH10B выращивали на качалке в течение ночи при 37° C в среде LB (Amresco, США), содержащей при необходимо сти ампициллин или канамицин в концентрации 75 мкг/мл или 50 мкг/мл соответственно. Большинство рутинных генно-инженерных процедур (выделение геномной ДНК, рестрикция, электрофорез ДНК и др.) осуществляли в соответствии с руководством [14]. Плазмидные ДНК выделяли с использованием Axy PrepTM Plasmid Midiprep Kit (Axygen, США). Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием праймеров, представленных в соответствующих разделах. Температуры отжига праймеров подбирали в зависимости от их последовательностей. Секвенирова-ние ДНК проводили на секвенаторе Beckman Coulter CEQTM 8000 (США), как описано ранее [15]. РНК выделяли с использованием RNeasy Mini Kit (Qiagen, США), как описано ранее [5]. Концентрацию и качество РНК определяли на микрочипах RNA 6000 Nano LabChip с использованием анализатора Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, США) согласно инструкции производителя. ПЦР с обратной транскриптазой в режиме реального времени (количественная ОТ-ПЦР) проводили с использованием праймеров на гены rgg, speB, purN, sagA и TaqMan проб, описанных ранее [6, 10], и системы ABI Prism 7000 (PE Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя. Электротрансформацию штаммов проводили, используя электропоратор Gene Pulser Xcell™ (BioRad, США) согласно инструкции производителя. Экспрессию эритрогенного токсина SpeB и НАД-гликогидролазы определяли, как описано в работе А. С. Рождественской и соавт. [8]. Сравнительный анализ последовательностей ДНК проводили с использованием баз данных GenBank и программы BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Результаты и их обсуждение. Конструирование рекомбинантной плазмиды p1. Ген rgg штамма NZ131 клонировали в векторе pMSP3535Va размером 8,3 т. п. н., который способен к независимой репликации как в стрептококках, так и E. coli, и содержит ген устойчивости к канамицину. Для клонирования была выбрана следующая стратегия. На первом этапе сконструированы праймеры KpnFwd (5-GGGGTA CCCCATATGGAAATTGGTGAA-3’) и XbaRev (5’-GCTCTAGAGCCTCAGGACAGTTTATGT-3’), содержащие рестрикционные сайты KpnI и XbaI (подчеркнуты). Эти праймеры использовали для амплификации полноразмерного гена rgg. ПЦР продукт гидролизовали рестриктазами KpnI и XbaI, очищали и лигировали с вектором pMSP3535Va предварительно гидролизованным KpnI и XbaI. Лигазную смесь использовали для трансформации штамма E. faecalis strain UV202. Устойчивые к действию 116 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 канамицина клоны отбирали и анализировали. В дальнейшем один из устойчивых клонов выращивали в 100 мл питательной среды Todd-Hewitt и из полученной биомассы выделяли искомую рекомбинантную плазмиду размером 9,2 т. п. н., названную p1, которая содержала полноразмерный ген rgg (рис. 1). Особенностью такой генетической конструкции явилась возможность независимой экспрессии гена rgg под контролем гетерологичного плазмидного промотора. струкции явилась невозможность независимой экспрессии гена rgg под контролем гетерологичного плазмидного промотора, а возможность экспрессии гена rgg лишь в том случае, если эта плазмида будет интегрирована в хромосомную ДНК стрептококка. Восстановление гена rgg в мутантных штаммах. Восстановление гена rgg в мутантных штаммах SF370 rgg- и NZ131 rgg- осуществляли двумя способами. В первом случае мутантные штаммы транс- Трансформация мутантных штаммов, получение штаммов SF370 rgg/chrgg и NZ131 rgg/chrgg с экспрессией гена rgg под контролем природного промотора ▼ п Рис. 1. Восстановление полноразмерного гена rgg под контролем природного промотора (Prgg) и гетерологичного плазмидного промотора (Р) в штаммах S. pyogenes. Символами Гр+ и ColE1 обозначены ориджины репликации плазмид в грамположительных стрептококках и грамотрицательной E. coli соответственно. Конструирование рекомбинантной плазмиды p4.2. Для того чтобы создать вектор, содержащий ген rgg, но неспособный к независимой репликации в стрептококках, штамм E. coli DH10B трансформировали плазмидой p1. Ранее опубликованы данные, что в системе E. coli плазмиды на основе вектора pMSP3535Va могут потерять ориджин репликации для стрептококков [16]. В результате анализа трансформантов обнаружены два типа колоний E. coli, которые различались по диаметру. Колонии обоих типов были выращены в среде LB, а их плазмидные ДНК выделены. Анализ нуклеотидных последовательностей плазмидных ДНК показал различия в их размерах: одна из плазмид была идентична плазмиде p1 (9,2 т. п. н.), а во второй (размером 6,5 т. п. н.) оказался утраченным ориджин репликации для стрептококков. Именно эта плазмида, названная p4.2, была использована для дальнейших исследований (см. рис. 1). Особенностью такой генетической конформировали плазмидой p1 методом электропорации. В полученных штаммах, названных NZ131 rgg-/prgg и SF370 rgg-/prgg, как ожидалось, экспрессия гена rgg должна была осуществляться под контролем плазмидного промотора (см. рис. 1). Во втором случае мутантные штаммы трансформировали плазмидой p4.2 методом электропорации. Как описано выше, плазмида p4.2 неспособна к самостоятельной репликации в стрептококках, поэтому отбор селективных рекомбинантов проводили методами ПЦР и секвенирования, направленными на выявление клонов, в которых плазмида p4.2 была интегрирована в хромосомную ДНК стрептококка, а ген rgg восстановлен вместе с природным промотором. В результате трансформации и последующей интеграции плазмиды p4.2 в хромосомные ДНК мутантных штаммов были получены клоны, названные NZ131 rgg-/chrgg и SF370 rgg-/chrgg, в которых, как ожидалось, экспрессия гена rgg должна была МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 117 осуществляться под контролем природного промотора (см. рис. 1). Клонирование гена rgg под контроль природного промотора восстанавливает экспрессию эритро-генного токсина SpeB. Анализ штаммов NZ131, SF370, их rgg изогенных мутантов, а также всех штаммов с восстановленным геном rgg показал, что экспрессия эритрогенного токсина SpeB восстановилась в штаммах NZ131 rgg-/chrgg и SF370 rgg/chrgg, но не восстановилась в штаммах NZ131 rgg/prgg и SF370 rgg-/prgg (рис. 2). гочисленным изменениям в метаболизме штаммов [3-7, 9, 10]. Для того чтобы доказать, что все изменения действительно связаны с инактивацией гена rgg, а не с вторичной мутацией, которая могла произойти в каком-нибудь из фрагментов генома, проанализировано, действительно ли клонирование гена rgg под контроль природного промотора восстанавливает свойства штаммов. В результате исследований обнаружено, что клонирование гена rgg в мутантных штаммах SF370 rgg-и NZ131 rgg- под контроль природного промотора NZ131 NZ131 rgg-NZ131 rgg-/chrgg NZ131 rgg-/prgg J J SF370 SF370 rgg-SF370 rgg-/ chrgg SF370 rgg- / prgg □ □ 0 8 10 0 8 10 Рис. 2. Зона экспрессии эритрогенного токсина SpeB вокруг колоний штаммов S. pyogenes, выраженная в миллиметрах. Для того чтобы выяснить, связаны ли различия в уровнях экспрессии SpeB с возможными различиями в уровнях экспрессии генов rgg и speB в различных штаммах, у всех штаммов на постэкспоненци-альной фазе роста была выделена мРНК, а уровни транскрипции генов rgg и speB оценены методом количественной ОТ-ПЦР. В результате исследования обнаружено, что уровни транскрипции генов rgg и speB в штаммах NZ131 rgg-/chrgg и SF370 rgg/chrgg сходны с таковыми в штаммах NZ131 и SF370, в то время как в штаммах NZ131 rgg-/prgg и SF370 rgg-/prgg они в 2 раза выше, чем в штаммах NZ131 и SF370 (рис. 3). восстановило свойства штаммов до таковых, характерных для SF370 и NZ131. В частности, гемолитическая активность, которая была существенно выше в штамме NZ131 rgg- [6], восстановлена в штамме NZ131 rgg-/chrgg до уровня NZ131. НАД-гликоги-дролазная активность, которая была в 16 раз выше в штамме NZ131 rgg- [6], восстановлена в штамме NZ131 rgg-/chrgg до уровня NZ131. Нарушенный метаболизм аминокислот в штамме NZ131 rgg- [5] восстановлен в штамме NZ131 rgg-/chrgg до уровня NZ131. Кроме того, восстановление гена rgg под природный промотор восстановило уровень спонтанной индукции бактериофага NZ131.1 (рис. 4). NZ131 NZ131 rgg-/chrgg NZ131 rgg-/prgg Уровень транскрипции гена rgg Уровень транскрипции гена speB NZ131 NZ131 rgg-/chrgg NZ131 rgg-/prgg 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0 20 40 60 80 100 120 140 Рис. 3. Относительные уровни транскрипции генов rgg и speB в штаммах S. pyogenes. Учитывая, что белок Rgg непосредственно взаимодействует с регуляторной областью гена speB и является активатором SpeB [17], полученные результаты указывают на репрессорный эффект повышенного уровня транскрипции rgg на уровень синтеза SpeB. Клонирование гена rgg под контроль природного промотора восстанавливает исходный фенотип штаммов NZ131 и SF370. Как опубликовано ранее, кроме нарушения синтеза SpeB, инактивация гена rgg в штаммах SF370 и NZ131 привела к мно- ПЦР проведена с использованием праймеров cpsFQ и mutX [6], направленных на детекцию attB сайта в геноме S. pyogenes. Интенсивность амплифи-ката размером 496 п. н. прямо пропорциональна уровню спонтанной индукции бактериофага NZ131.1. Восстановление гена rgg в штамме SF370 rgg- под контроль природного промотора восстановило кривую роста штамма до таковой, характерной для SF370 (рис. 5). Кроме того, уровни транскрипции генов purN и sagA были также восстановлены до уровней таковых в исходном штамме SF370. Все эти 118 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 3 данные свидетельствуют, что изменения свойств в обоих rgg мутантных штаммах (SF370 rgg-и NZ131 rgg-) действительно связаны с инактивацией гена rgg, а не с вторичной мутацией. 1 2 3 4 5 Рис. 4. Восстановление уровня спонтанной индукции бактериофага NZ131.1: трек 1 - штамм NZ131; трек 2 - штамм NZ131 rgg; трек 3 - штамм NZ131 rgg-/chrgg; трек 4 - штамм NZ131 rgg/prgg; трек 5 - маркер молекулярной массы. Следует отметить, что восстановление гена rgg под контроль гетерологичного плазмидного промотора в сконструированных штаммах NZ131 rgg/prgg и SF370 rgg-/prgg не восстановило вышеупомянутые фенотипические свойства (рис. 2, 4, 5). Несмотря на эффективную транскрипцию гена rgg (даже превышающую таковую в исходных штаммах), свойства штаммов остались такими же, как и у мутантных штаммов, что свидетельствует о значимости уровня транскрипции гена rgg для функциональной активности белка Rgg. Время роста, часы Рис. 5. Кривые роста штаммов S. pyogenes. Белок-регулятор Rgg функционирует в составе динамического транскрипционного регуляторного комплекса. Учитывая результаты, полученные в настоящем исследовании и работах других авторов, можно сделать несколько предположений о природе функционирования белка Rgg. По-видимому, все же взаимодействие белка Rgg с промотор-ными областями генов не является простым химическим взаимодействием ДНК с белком [17-19], в противном случае это не объясняет штаммовую специфичность действия Rgg [10]. Влияние опреде ленных аминокислот на C-терминальном конце белка Rgg на активацию экспрессии SpeB [12], но совершенно не вовлеченных в процесс непосредственного взаимодействия «ДНК-белок», указывает на взаимодействие белка Rgg с другими белками или ко-факторами. Одним из таких белков является белок LacD.1 (тагатоза-1,6-бифосфатальдолаза), который способен связываться с Rgg во время ранней логарифмической фазы роста, препятствуя активации транскрипции гена эритрогенного токсина SpeB [20]. Однако и это никак не объясняет, почему Rgg все же регулирует другие гены на этой же фазе роста [6, 10]. Таким образом, наиболее логичным представляется функционирование белка Rgg в составе динамического транскрипционного комплекса, включающего в себя Rgg и ряд штаммо-специфиче-ских белков. Косвенным доказательством такого взаимодействия являются еще неопубликованные данные о взаимодействии Rgg с рядом стрептококковых белков [21]. Из результатов данной работы очевидно, что не только аминокислотная последовательность Rgg и наличие неизвестных на сегодня кофакторов, но и уровень транскрипции гена rgg критически важны для регуляторных свойств белка Rgg. Как указано в данной работе, даже двукратное увеличение уровня транскрипции гена rgg приводит к уменьшению до нуля уровня транскрипции гена speB (рис. 3). Не исключено, что при достижении в бактериальной клетке определенного уровня синтеза Rgg эти молекулы начинают формировать неактивные гомодимеры или гетеродимеры с другими Rgg паралогами. Другим возможным объяснением инактивации свойств Rgg при высоком уровне его синтеза может быть изменение растворимости белка и, как следствие, его активности. Кроме того, возможно, что процесс синтеза белка Rgg на рибосомах непосредственно зависит от характеристик мРНК транскриптов, в частности, синтезированы ли они на матрице хромосомной ДНК или на матрице плазмидной ДНК. Заключение. Таким образом, функциональные свойства белка-регулятора Rgg во многом зависят от уровня экспрессии гена rgg, и даже двукратное его увеличение приводит к полной потере функциональных свойств Rgg. Кроме того, белок-регулятор Rgg функционирует в составе динамического транскрипционного регуляторного комплекса, характеризующегося штаммовой специфичностью, что открывает широкие перспективы для дальнейших исследований.

A V Dmitriev

Institute of Experimental Medicine of the North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences; St.-Petersburg State University

Email: admitriev10@yandex.ru
St.-Petersburg, Russia

M S Chaussee

University of South Dakota

Vermillion, USA

  1. Cunningham M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections // Clin. Microbiol. Rev.- 2000.- Vol.13, № 3.- P. 470-511.
  2. Kreikemeyer B., Mclver R. S., Podbielski A. Virulence factor regulation and regulatory networks in Streptococcus pyogenes and their impact on pathogen-host interactions // Trends Microbiol.- 2003.- Vol. 11, № 5.- P. 224-232.
  3. Chaussee M. S., Ajdic D., Ferretti J. J. The rgg gene of Streptococcus pyogenes NZ131 positively influences extracellular SPE B production // Infect. Immun.- 1999.- Vol. 67, № 4.- P. 1715-1722.
  4. Chaussee M. S., Watson, R. O., Smoot J. C. et al. Identification of Rgg-regulated exoproteins of Streptococcus pyogenes // Infect. Immun.-2001.- Vol. 69, № 2.- P. 822-831.
  5. Chaussee M. S., Somerville G. A., Reitzer L. et al. Rgg coordinates virulence factor synthesis and metabolism in Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.- 2003.- Vol. 185, № 20.- P. 6016-6024.
  6. Dmitriev A.V., McDowell E. J., Kappeler K. V. et al. The Rgg regulator of Streptococcus pyogenes influences the utilization of nonglucose carbohydrates, prophage induction, and expression of the NAD-glycohydrolase virulence operon // J. Bacteriol.- 2006.- Vol. 188, № 20.-P. 7230-7241.
  7. Chaussee, M.A., Callegari E.A., Chaussee M.S. Rgg regulates growth phase-dependent expression of proteins associated with secondary metabolism and stress in Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.- 2004.- Vol. 186, № 21.- P. 7091-7099.
  8. Рождественская А. С., Дмитриев А. В., Грабовская К. Б. и др. Инактивация гена регулятора транскрипции Rgg изменяет экспрессию секретируемых факторов патогенности и вирулентность Streptococcus pyogenes // Мед. акад. журн.- 2008.- Т. 8, № 2.- С. 21-27.
  9. Pulliainen A. T., Hytonen J., Haataja S. et al. Deficiency of the Rgg regulator promotes H2O2 resistance, AhpCF-mediated H2O2 decomposition, and virulence in Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.- 2008.- Vol. 190, № 9.- P. 3225-3235.
  10. Dmitriev A. V., McDowell E. J., Chaussee M. S. Inter- and intraserotypic variation in the Streptococcus pyogenes Rgg regulon // FEMS Microbiol. Lett.- 2008.- Vol. 284, № 1.- P. 43-51.
  11. Loughman, J. A., Caparon M. G. Contribution of invariant residues to the function of Rgg family transcription regulators // J. Bacteriol.- 2007.- Vol. 189, № 2.- P. 650-655.
  12. Hollands A., Aziz R. K., Kansal R. et al. A naturally occurring mutation in ropB suppresses SpeB expression and reduces M1T1 group A streptococcal systemic virulence // PLoS One.- 2008.- Vol.3, № 12.- P. e4102.
  13. Kappeler K. V., Anbalagan S., Dmitriev A. V. et al. A naturally occurring Rgg variant in serotype M3 Streptococcus pyogenes does not activate speB expression due to altered specificity of DNA binding // Infect. Immun.- 2009.- Vol.77, № 12.- P. 5411-5417.
  14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.- М.: Мир, 1984.- 479 с.
  15. Ильясов Ю. Ю., Дмитриев А. В. Геномный полиморфизм Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis // Мед. акад. журн.-2012.- Т. 12, № 2.- С. 90-96.
  16. Bryan E. M., Bae T., Kleerebezem M. et al. Improved vectors for nisin-controlled expression in gram-positive bacteria // Plasmid.- 2000.-Vol. 44, № 2.- P. 183-190.
  17. Neely M. N., Lyon W. R., Runft D. L. et al. Role of RopB in growth phase expression of the SpeB cysteine protease of Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.- 2003.- Vol. 185, № 17.- P. 5166-5174.
  18. Anbalagan S., McShan W. M., Dunman P. M. et al. Identification of Rgg binding sites in the Streptococcus pyogenes chromosome // J. Bacteriol.- 2011.- Vol. 193, № 18.- P. 4933-4942.
  19. Anbalagan S., Dmitriev A., McShan W. M. et al. Growth phase-dependent modulation of Rgg binding specificity in Streptococcus pyogenes // J. Bacteriol.- 2012.- Vol. 194, № 15.- P. 3961-3971.
  20. Loughman J. A., Caparon M. G. A novel adaptation of aldolase regulates virulence in Streptococcus pyogenes // EMBO J.- 2006.- Vol. 25, № 22.- P. 5414-5422.

Views

Abstract - 23

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2013 Dmitriev A.V., Chaussee M.S.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies