OXIDATIVE STRESS MARKERS IN THE CORD BLOOD PLASMA OF THE PRETERM INFANTS

Abstract


The differences in reactive oxygen species levels and protein oxidation degree in the cord blood plasma from full-term and premature newborns were studied using fluorescent probes. A correlation was found between reactive oxygen species levels and protein SH-groups, as well as the plasma total antioxidant activity in premature infants. Our results suggest that analysis of oxidative stress markers in newborn cord blood could be a useful laboratory diagnostic and prognostic test for assessing the newborns’ health and their ability to adapt to the changed environmental conditions.

Введение. Известно, что окислительный стресс определяется как нарушение баланса прооксидантов и антиоксидантов в пользу первых, что может привести к клеточному повреждению. Основной вклад в развитие окислительного стресса вносят свободные радикалы: супероксиданион (O2-), гидроксильный радикал (HO^), липидные радикалы (ROO-) и активные формы азота, такие как оксид азота (NO) [1]. Активные формы кислорода (АФК) могут нарушать экспрессию ген/белок путем воздействия на внутриклеточные сигнальные каскады и, в конечном счете, изменять клеточный фенотип и функцию. Более того, они могут напрямую окислять клеточные компоненты, приводя к повреждению клетки и таким образом способствуя развитию и прогрессированию ряда заболеваний [2]. Новорожденные, в частности недоношенные дети, более склонны к окислительному стрессу, чем дети других возрастных периодов [3, 4]. Этому может способствовать ряд причин: повышенная чувствительность недоношенных детей к инфекционным и воспалительным процессам [5], сниженная функциональная активность антиоксидантной защиты [6], более высокий уровень свободного железа, которое усиливает реакцию Фентона [7], вызывая продукцию высокотоксичных радикалов [8]. Доказана роль оксидативного стресса в патогенезе таких заболеваний недоношенных детей, как бронхолегочная дисплазия, внутрижелудочковые кровоизлияния, перивентрикулярная лейкомаляция, ретинопатия, не-кротизирующий энтероколит [6, 9]. Однако, несмотря на то, что дисбаланс в системе окислители-анти 72 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 4 оксиданты признается одним из важнейших этиопа-тогенетических факторов перинатальной гипоксии, на сегодняшний день существуют лишь немногочисленные данные литературы, демонстрирующие прямую взаимосвязь между уровнем АФК в клетках и исходом беременности [10-13]. Своевременное выявление повышенного уровня АФК в организме новорожденных является важной, но не всегда решаемой задачей из-за отсутствия надежных и простых в выполнении методов их определения. Поиск новых биомаркеров оксидативного стресса в неонатологии представляется весьма актуальным. В проведенных нами ранее исследованиях [14-16] выявлены достоверные изменения (ингибирование) активностей ферментов антиоксидантной системы (глутатионпероксидазы и супероксиддис-мутазы), уровня восстановленного глутатиона в эритроцитах и модификация физического состояния липидного бислоя мембран эритроцитов пуповинной крови новорожденных при различных вариантах реализации перинатальной гипоксии (новорожденные с асфиксией, задержкой внутриутробного развития и недоношенные дети). Цель данной работы: выявление маркеров окислительного стресса (уровень АФК, окисленность SH-групп) и анализ их связи с общей антиоксидант-ной активностью (ОАА) плазмы пуповинной крови у недоношенных детей. Материалы и методы исследования. В работе была использована плазма пуповинной крови 24 новорожденных младенцев. Клиническое обследование и наблюдение новорожденных проводились в УЗ «Родильный дом Минской области». В группу обследования включены 13 недоношенных детей. Гестационный возраст составил от 28 до 35 недель, масса тела от 1100 до 2400 г. 10 детей были рождены путем кесарева сечения, 3 ребенка родились через естественные родовые пути. Показаниями к выполнению кесарева сечения были фетоплацентарная недостаточность, преждевременное излитие вод, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты. Оценка по шкале Апгар у всех детей составила 8 баллов на первой и к окончанию пятой минуты жизни. Ранний неонатальный период протекал с клиническими проявлениями респираторного дистресс-синдрома и внутриутробной пневмонии. Всем детям с момента рождения проводились необходимый динамический клинико-метаболический мониторинг, инфузионная терапия, лечение антибактериальными препаратами, респираторная поддержка. В контрольную группу были включены 11 доношенных детей, родившихся в гестационном возрасте от 38 до 41 недели с массой тела от 3120 до 4410 г. Беременность протекала без осложнений, у матерей экстрагенитальной патологии не выявлено. Оценка по шкале Апгар у всех детей составила 8 баллов, к концу 5-й минуты — 9 баллов. Период ранней адаптации протекал без патологических осложнений, и все дети данной группы были выписаны из родильного дома в удовлетворительном состоянии на 5-6-е сутки после рождения. Плазма была отделена от форменных элементов путем центрифугирования крови при 800 g, в течение 15 мин (центрифуга Biofuge PrimoR Heraeus, Германия). Плазму отбирали в пластиковые пробирки, замораживали (-20° С) и хранили до начала исследования не более 2 недель. Перед исследованием плазму крови размораживали и разводили в 10 мM Na-фосфатном буфере pH 7,4 + 0,155 M NaCl в соотношениях 1:199 (для оценки уровня АФК и уровня SH-групп) либо 1:4 (для определения общей антиоксидантной активности). Уровень АФК в плазме крови оценивали с помощью флюоресцентного зонда 5-(6)-хлорометил-2 ’, 7 ’ - дихлородигидрофлюоресцеин диацетата (CM-H2DCFDA, Molecular Probes, США) на спектрофлюориметре CM2203 (СОЛАР, Беларусь) при ^возб/рег=500/524 нм согласно методу [17]. 5-(6)-хлорометил-2’,7’- дихлородигидрофлюо-ресцеин (CM-H2DCF) получали путем гидролиза CM-H2DCFDA в водном растворе NaOH в течение 30 мин при 37° С в темноте [18]. Итоговые данные для данного метода представлены в виде отношения среднего значения интенсивности флюоресценции 2’,7’-дихлорофлюоресцеина (DCF) в плазме недоношенных новорожденных 0фл) к среднему значению интенсивности флюоресценции DCF в контрольных пробах (!фл. к ), выраженного в процентах. Для определения уровня сульфгидрильных групп белков в плазме крови новорожденных детей использовали флюоресцирующий SH-реагент N-(1-пирен)малеимид (Sigma, США). Измерение интенсивности флюоресценции реагента проводили на длине волны 395 нм (^возб=340 нм) [19]. Полученные результаты представлены в виде отношения среднего значения интенсивности флюоресценции (I395) в плазме недоношенных новорожденных к среднему значению данного показателя контрольной пробы 0395к.), выраженного в процентах. Измерение ОАА плазмы крови проводили с помощью коммерческого набора Antioxidant assay kit (Sigma, США) согласно протоколу производителя. Принцип анализа заключается в формировании фер-рил-миоглобин радикала из метмиоглобина и перекиси водорода, который окисляет АБТС (2,2-ази- МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 4 73 но-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)), с образованием радикала АБТС + — растворимого хромогена, окрашенного в зеленый цвет. Его содержание определяли спектрофотометрически при длине волны 405 нм (D405) на универсальном анализаторе VICTOR2™ (Perkin Elmer, США). Антиоксиданты подавляют продукцию радикала АБТС+ концентрационно-зависимым образом, и интенсивность окраски пропорционально снижается. Численное значение концентрации антиоксидантов в исследуемых образцах плазмы выражали по эквиваленту концентрации тролокса (водорастворимого аналога витамина Е), используя калибровочную кривую. Итоговые данные представлены в виде отношения среднего значения концентрации антиоксидантов в плазме недоношенных детей ([AO]) к среднему значению концентрации антиоксидантов в плазме доношенных новорожденных ([AO^), выраженного в процентах. Результаты экспериментов анализировали методом вариационной статистики с использованием непараметрических критериев Манна-Уитни и Спирмена. Результаты и их обсуждение. Первым этапом работы явилось изучение основных маркеров окислительного стресса — пула АФК и SH-групп в белках плазмы крови исследованных групп новорожденных. Согласно данным литературы [17, 18], используемый нами зонд на АФК — CM-H2DCF (нефлюоресцирующая форма), становится окисленным (формируется флюоресцирующая форма DCF) в системе Н2О2 + Fe2+, в результате которой образуется гидроксильный радикал OH (реакция Фентона). В связи с этим для более точной оценки пула АФК в плазме крови обследованных групп новорожденных мы измеряли интенсивность флюоресценции DCF до стимулирования (к) и после стимулирования его флюоресценции FeSO4 (как источник Fe2+) и аскорбатом натрия (в качестве сильного прооксиданта) (IFe) (рис. 1) [18], а итоговое значение (К), отражающее уровень АФК в плазме, рассчитывали по соотношению: lFe — lo Обнаружено увеличение интенсивности флюоресценции DCF и показателя К (таблица) в плазме пуповинной крови недоношенных новорожденных, при этом среднее значение К для этой группы статистически достоверно (p<0,05) отличалось на 28±6% по сравнению со значениями данного показателя в контрольной группе (рис. 2). Это свидетельствует о более высоком содержании Н2О2 и OH в плазме пуповинной крови недоношенных детей. Известно, что белки плазмы крови играют важную физиологическую роль, регулируя такие процессы, как питание и контроль распределения воды в организме, транспорт и защита; неоспорима также их значимость в качестве гормонов и ферментов. Рис. 1. Спектры флюоресценции 2’,7’-дихлорофлюоресцеина (DCF) (Хвозб=500 нм), присутствующего в плазме пуповинной крови новорожденных до (кривая 1) и после воздействия 5 мкМ FeSO4 и 2,5 мкМ аскорбата натрия (кривая 2). % I I — Контрольная группа I I — Недоношенные новорожденные Рис. 2. Итоговые данные, отражающие изменения маркеров окислительного стресса, выявленных у недоношенных детей, по отношению к контрольной группе (доношенные новорожденные): 1 — показатель К, отражающий изменение уровня активных форм кислорода в плазме крови; 2 — уровень сульфгидрильных групп белков плазмы крови; 3 — общая антиоксидантная активность плазмы крови. Данные представлены как xcp.±sd. Различия достоверны по сравнению с контролем: р<0,05; **р<0,001. Некоторые белки действуют в качестве антиоксидантов [20]. Исследование окислительных деструкций белков плазмы предоставляет общую информацию, отражающую состояние органов и систем организма [21]. Так как об окислении белков можно судить по количеству в них SH-групп, нами прове- 74 МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 4 Т аблица Средние значения (xcp±sd) интенсивности флюоресценции DCF, показателя K и ТЭАА в плазме пуповинной крови обследованных групп детей Интенсивность флюоресценции DCF, отн. ед. Группы обследованных плазма разведена 10 мМ Na-фосф. буф. рН 7,4 + 0,155 М NaCl в присутствии 5 мкМ FeSÜ4 + 2,5 мкМ аскорбата натрия K ТЭАА, мМ Доношенные новорожденные, n=11 1,51±0,07 1,96±0,11 0,295±0,023 2,190±0,200 Недоношенные новорожденные, n=13 1,61±0,17 2,23±0,24 0,377±0,018 1,352±0,168 дена оценка их уровня в белках плазмы крови обследованных групп новорожденных. 360 400 440 480 X, нм Рис. 3. Спектры флюоресценции ^(1-пирен)-малеимида (Хвозб=340 нм), связанного с компонентами плазмы пуповинной крови доношенных (кривая 1) и недоношенных новорожденных (кривая 2). На рис. 3 представлены спектры флюоресценции ^(1-пирен)-малеимида, который взаимодействует с SH-группами белков, и по интенсивности его флюоресценции можно судить об изменении уровня сульфгидрильных групп. Из рис. 2 и 3 видно, что значение интенсивности флюоресценции зонда, связанного с SH-группами белков плазмы крови недоношенных новорожденных, было достоверно ниже (р<0,05) по сравнению с таковым в контрольной группе в среднем на 10-16%. Полученные результаты свидетельствуют об АФК-индуцируемых окислительных изменениях в белковых компонентах плазмы крови у недоношенных новорожденных, что приводит к снижению уровня SH-групп и, как следствие, к возможной конформационной модификации антиоксидантных белков плазмы. В частности, окисление сульфгидрильных групп белков (например, в альбумине) или пептидов (глутатион) может явиться основой для снижения общей антиоксидант-ной активности плазмы крови [22]. Известно, что живые организмы имеют сложную развитую антиоксидантную сеть, которая противостоит действию АФК, при этом плазма крови является сложной химической системой в отношении ан-тиоксидантной активности. Неферментативные антиоксиданты, такие как альбумин, а-токоферол, аскорбиновая кислота, мочевая кислота, глутатион, билирубин и флавоноиды, формируют сеть плазменных антиоксидантов, изучение которых необходимо для оценки антиоксидантного статуса организма человека in vivo [22], а также может быть важным показателем при мониторинге клинического статуса пациента и являться полезной мерой для решения вопроса о необходимости применения антиоксидантных препаратов [23]. Однако большое их количество в плазме крови создает определенные трудности в изучении каждого антиоксиданта в отдельности. По этой причине в последнее десятилетие предложены самые разнообразные методы интегральной оценки ОАА биологических жидкостей. Наиболее удачным считается метод «тролокс-эквивалент антиоксидантной активности» (ТЭАА), основанный на модельной системе «метмиоглобин-Н2О2-АБТС -тролокс» [ 24], в данной работе проведены исследования ОАА плазмы с использованием этого метода. Нами выполнена оценка ОАА плазмы крови у обследованных групп новорожденных, единицей измерения которой явился ТЭАА в мМ/л. Как видно из таблицы и рис. 2, у недоношенных новорожденных происходит достоверное (p<0,001) 50% снижение ОАА плазмы крови, которое составило в ТЭАА 1,352±0,168 мМ относительно 2,190±0,200 мМ у доношенных детей. Для выяснения вопроса о взаимосвязи между изученными маркерами окислительного стресса (АФК, SH-групп белков и ОАА) в плазме пуповинной крови обследованных групп новорожденных проведен корреляционный анализ. Обнаружена обратная статистически значимая зависимость между уровнем АФК и уровнем SH-групп белков плазмы как в группе доношенных новорожденных (коэффициент МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013 г., ТОМ 13, № 4 75 0,45 Ц 0,40 0,35 tLn и 0, 0,30 4 " 0,25 0,20 0,8 1,2 1,6 2,0 2,4 2,8 ТЭАА, мМ в Рис. 4. Корреляционные связи между параметрами, являющиеся маркерами окислительного стресса: уровень активных форм кислорода (I^ (DCF)), уровень SH-групп белков Офл (N-(1-пирен)-малеимида)) и общая антиоксидантная активность (ТЭАА, мМ) в плазме крови новорожденных: 1 — контрольная группа; 2 — группа недоношенных новорожденных. Спирмена, rs1 = -0,922, p=0,0011), так и у недоношенных детей (rs2=-0,826, p=0,011) (рис. 4, а, кривые 1 и 2). Однако мы наблюдали разнонаправленные взаимосвязи между уровнями SH-групп и АФК с общей антиоксидантной активностью плазмы в двух обследованных группах детей. Так, в контрольной группе обнаружена положительная корреляция (rs1 =0,657, p = 0,156) между уровнем SH-групп и ОАА (рис. 4, б, кривая 1), а в группе недоношенных новорожденных — обратная статистически значимая корреляция (rs2=-0,762, p=0,028) (рис. 4, б, кривая 2). Это согласуется с полученными нами результатами о взаимосвязи окисленности белков и пептидов и выполнением ими антиоксидантной функции. В свою очередь, для доношенных новорожденных не обнаружено статистически значимой корреляции между ОАА плазмы крови и уровнем АФК (rs1=—0,2, p=0,704) (рис. 4, в, кривая 1), а в группе недоношенных новорожденных данный показатель составил rs2=0,743, p=0,035, т. е. наблюдалась достоверная положительная корреляция (рис. 4, в, кривая 2). Полученные результаты подтверждают, что при нормальном функционировании организма существует оптимальный баланс между антиоксидантами и прооксидантами, а при патологиях, связанных с окислительным стрессом, организм «включает» защитную реакцию, направленную на активацию антиоксидантной системы клеток. Заключение. Полученные нами результаты свидетельствуют, что анализ маркеров окислительного стресса в пуповинной крови новорожденных является полезным лабораторным диагностическим и прогностическим тестом оценки здоровья новорожденных, способности новорожденных к обеспечению адаптации организма к изменению условий среды обитания.

Y M Harmaza

Institute of Biophysics and Cell Engineering of National Academy of Sciences of Belarus

Email: garmaza@yandex.by

N M Kozlova

Institute of Biophysics and Cell Engineering of National Academy of Sciences of Belarus

M V Artsiusheuskaya

Belorussian Medical Academy of Postgraduate Education

V A Petrovich

Institute of Biophysics and Cell Engineering of National Academy of Sciences of Belarus

A V Sapotnitski

Belorussian Medical Academy of Postgraduate Education

G A Shyshko

Belorussian Medical Academy of Postgraduate Education

E I Slobozhanina

Institute of Biophysics and Cell Engineering of National Academy of Sciences of Belarus

  1. Sies H. Oxidative stress: from basic research to clinical application // Am. J. Med. — 1991. — Vol. 91, № 3. — P. 31S-38S.
  2. Valko M., Leibfritz D., Moncol J. et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease // Int. J. Biochem. Cell Biol. — 2007. — Vol. 39. — P. 44-84.
  3. Мосько П.Л., Шишко Г.А., Качан С.Э. Междисциплинарный подход в обеспечении перинатальных технологий при преждевременных родах в УЗ «Родильный дом Минской области» // Репродуктивное здоровье. Восточная Европа. — 2012. — № 5 (23). — С. 536-538.
  4. Gitto E., Pellegrino S., Gitto P. et al. Oxidative stress of the newborn in the pre- and postnatal period and clinical utility of melatonin // J. Pineal Res. — 2009. — Vol. 46. — P. 128-139.
  5. Speer C.P., Silverman M. Issues relating to children born prematurely // Eur. Respir. J. Suppl. — 1998. — Vol. 27. — P. 13s-16s.
  6. ODonovan D.J., Fernandes C.J. Free radicals and diseases in premature infants // Antioxid. Redox. Signal. — 2004. — Vol. 6, № 1. — P. 169-176.
  7. Dani C., Cecchi A., Bertini G. Role of oxidative stress as physiopathologic factor in the preterm infant // Minerva Pediatr. — 2004. — Vol. 56, № 4. — P. 381-394.
  8. Saugstad O.D. Bronchopulmonary dysplasia-oxidative stress and antioxidants // Semin. Neonatol. — 2003. — Vol. 8, № 1. — P. 39-49.
  9. Saugstad O.D. Update on oxygen radical disease in neonatology // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. — 2001. — Vol. 13. — P. 147-153.
  10. Ng P.C., Lam H.S. Biomarkers in Neonatology: The next Generation of Tests // Neonatology. — 2012. — Vol. 102. — P.145—151.
  11. Ishihara O., Hayashi M., Osawa H. et al. Isoprostanes, prostaglandins and tocopherols in pre-eclampsia, normal pregnancy and non-pregnancy // Free Radic. Res. — 2004. — Vol. 38. — P. 913-918.
  12. Wiktor H., Kankofer M., Schmerold I. et al. Oxidative DNA damage in placentas from normal and pre-eclamptic pregnancies // Virchows Arch. — 2004. — Vol. 445. — P. 74-78.
  13. Назарова С.И., Прокопенко В.М., Кошелева Н.Г. и др. Уровень перекисной хемилюминесценции в сыворотке крови у здоровых и больных сахарным диабетом типа 1 женщин вне и в динамике беременности // Журн. акушерства и жен. болезней. — 2006. — Т. LV., Вып. 2. — C. 14-19.
  14. Гармаза Ю.М., Белевич Е.И., Сапотницкий А.В. и др. Изменение состояния антиоксидантной системы эритроцитов у новорожденных при перинатальной гипоксии // Мат. VI Межд. конф. Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы. — Минск, 2008. — Ч. 1. — С. 115-118.
  15. Сапотницкий А.В., Гармаза Ю.М., Белевич Е.И. и др. Активность ферментов антиоксидантной защиты эритроцитов и гликемия у недоношенных новорожденных // Мат. VI съезда анестезиологов-реаниматологов Новые технологии в анестезиологии и интенсивной терапии. — Минск, 2008. — С. 151—152.
  16. Сапотницкий А.В., Гармаза Ю.М., Белевич Е.И. Изменение структурно-функционального состояния мембран эритроцитов у новорожденных с задержкой внутриутробного развития // Известия НАН Беларуси. Приложение. — 2010. — Ч. 5. — С. 426-429.
  17. LeBel C.P., Ischiropoulos H., Bondy S.C. Evaluation of the probe 2,7-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress // Chem. Res. Toxicol. — 1992. — Vol. 5. — P.227—231.
  18. Hempel S.L., Buettner G.R., O'Malley Y.Q. et al. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: comparison with 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123 // Free Radic. Biol. Med. — 1999. — Vol. 27, № 1-2. — P. 146-159.
  19. Козлова Н.М., Касько Л.П., Кутько А.Г. и др. Активность ферментов антиоксидантной защиты и окисление мембранных белков эритроцитов при некоторых патологиях беременности // Известия НАН Беларуси, серия мед. наук. — 2010. — № 3. — С. 97—101.
  20. Luxton R. Clinical Biochemistry. — 2nd ed. — Scion Publishing Ltd, 2008. — 253 p.
  21. Vinod Chandran, Anitha M., Avinash S.S. et al. Protein oxidation: A potential cause of hypoalbuminemia in oral cancer // Biomedical Research. — 2012. — Vol. 23, № 2. — P. 227-230.
  22. Lovasova E., Sesztakova E. Total antioxidant status — a possible marker of environmental influences on animal organisms // Slovak J. Anim. Sci. — 2009. — Vol. 42, Suppl. 1. — P. 42-45.
  23. Yu B.P. Cellular defenses against damage from reactive oxygen species // Physiol. Rev. — 1994. — Vol. 74, № 1. — P. 139—162.
  24. Kambayashi Y., Binh N.T., W Asakura H. et al. Efficient Assay for Total Antioxidant Capacity in Human Plasma Using a 96-Well Microplate // J. Clin. Biochem. Nutr. — 2009. — Vol. 44, № 1. — P. 46-51.

Views

Abstract - 41

PDF (Russian) - 0

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2013 Harmaza Y.M., Kozlova N.M., Artsiusheuskaya M.V., Petrovich V.A., Sapotnitski A.V., Shyshko G.A., Slobozhanina E.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies