An occurrence of the bacteriophage genes among Streptococcus pyogenes strains of M49 serotype

Abstract


In this study an occurrence of bacteriophage genes among S. pyogenes strains of M49 serotype was studied by two methods, PCR and DNA-DNA hybridization. It was found, that the presence of the phage genes and/or prophages was associated with geographic region of the strain isolation. Potential correlation between the presence of the phage integrase genes and the genes encoding virulence factors was revealed.

Streptococcus pyogenes - патогенные для человека бактерии, вызывающие многочисленные формы инфекции, такие как скарлатина, отиты, тонзилофарин- гиты, стрептодермия, а также их инвалидизирующие осложнения (ревматическая лихорадка, гломерулонефрит). В последние десятилетия зарегистрированы новые клинические формы (синдром токсического шока, некротический фасцит и миозит), в 25-30% случаев приводящие к летальному исходу. Развитие подобных инвазивных форм инфекции и осложнений зачастую ассоциировано с определенными серотипами S. pyogenes. Так, со штаммами серотипов Ml и М3 связывают развитие таких инвазивных форм инфекции, как фасциты и миозиты, а со штаммами серотипа М49 - развитие гломерулонефрита. Являясь облигатными паразитами человека, бактерии вида S. pyogenes экспрессируют ряд биологически активных веществ, таких как стрептолизины типов S и О, пирогенные токсины типов А, В и С, гиалуронидазу, ДНКазы и др. Значительная часть из перечисленных веществ относится к факторам патогенности 5. pyogenes, кодируемым генами, входящими в состав фаговых ДНК [7]. Геном S. pyogenes может содержать от 2 до 6 профаговых ДНК [2]. При этом было показано, что различия в количестве и последовательностях профаговых ДНК обуславливают основные генетические отличия между штаммами S. pyogenes [4, 6, 12, 14]. И это неудивительно, учитывая тот факт, что тран- сдукция является единственным известным на сегодняшний день процессом генетического обмена для данного вида бактерий в естественных условиях. На рис. 1 представлена общая схема строения фагового генома, который всегда содержит один ген, кодирующий интегразу бактериофага, и один или несколько генов, кодирующих факторы патогенности (например, токсины). В настоящее время в научной литературе распространена гипотеза, согласно которой вирулентность штамма 5. pyogenes в существенной степени зависит от набора профаговых генов, в том числе Рис. I. Схематическое изображение строения профага цикла генов токсинов [15]. Так, например, возникновение высоковирулентного клона 5. pyogenes серотипа М3, ассоциированного с синдромом токсического шока, связывают с включением в геном бактерии нескольких фагов, несущих определенные гены вирулентности (speA, speK, sla и ssa) [4]. Предположительно, горизонтальный перенос таких генов способствовал приобретению бактерией новых свойств и, как следствие, мог привести к формированию эпидемически значимых штаммов. Таким образом, генетический анализ штаммов 5. pyogenes открывает не только новые возможности в изучении эпидемиологии стрептококковой инфекции, но и вносит существенный вклад в понимание механизмов «быстрой» эволюции бактериальных геномов. Цель данного исследования - генетическая характеристика штаммов S. pyogenes серотипа М49 по наличию в составе бактериального генома генов бактериофагов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследования явились 2 коллекции клинических изолятов S. pyogenes серотипа М49. Коллекция А содержала 1 б штаммов, выделенных в разных географических регионах от людей с различными стрептококковыми заболеваниями, такими как фарингит, скарлатина и острый гломерулонефрит (табл. 1). Коллекция Б включала в себя 22 штамма, выделенных в США от пациентов с тяжелыми инвазивными процессами (сепсис, некротический фас- цит) (табл. 2). Культивирование штаммов проводили в течение ночи при 37 °С в бульоне Todd-Hewitt («Difco», США). Большинство генно-инженерных процедур осуществляли в соответствии с руководством [11]. Хромосомную ДНК выделяли фенолхлорофор- мной экстракцией. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации фрагментов ДНК фаговых генов (табл. 3) проводили с использованием праймеров, описанных ранее [16]. Таблица 1 Описание штаммов коллекции А № штамма Характеристика Регион Заболевание 2А Новая Зеландия Острый гломерулонефрит ЗА Новая Зеландия Острый гломерулонефрит 4А Новая Зеландия Скарлатина 5А Новая Зеландия Скарлатина 8А Великобритания Скарлатина 9А Великобритания Скарлатина 10А Великобритания Скарлатина 1 ІА Новая Зеландия Скарлатина 12А Новая Зеландия Скарлатина 13А Новая Зеландия Скарлатина 14А Новая Зеландия Фарингит 15А Новая Зеландия Скарлатина 20А Дания Фарингит 23А Япония Фарингит 24А СССР Скарлатина ' 25А Таиланд Фарингит ПЦР фрагменты выделяли из агарозы с использованием набора «QIAGEN» (США). Для проведения «макроаррей» гибридизации на нитроцеллюлозную мембрану фирмы «Roche» (Германия) наносили каждый из ПЦР фрагментов в концентрации 1 мкг/мл, после чего «отжигали» мембрану в УФ кросслинкере («Віо-Rad», США) для фиксации ПЦР продукта на фильтре. Хромосомные ДНК фрагментировали с использованием вакуумного распылителя («Nebulizer»), отбирали фракцию размером 1 т.п.н. и метили дигоксигенином с использованием набора фирмы «Roche» (Германия). ДНК-ДНК-гибридизацию проводили по руководству «DNA Labeling and Detection Kit» («Roche», Германия). Таблица 3 Номера штаммов Гены 1-5 6 7 8 9-12 13 14 15 їв 17-22 speA + 4- + - 4- - 4- - -l 4spel 4- - 4- - 4- - 4- 4- - + smeZ - - - - - + - - - speG + 4- + 4- 4- - 4- 4- + 4speH - - + + 4- - 4- 4- - + majorH, majorT - - - - - - - 4* - hyl + - + 4- 4- + 4- -f. - 4inti, Ш2, int3, inl4, int8 - - - - - - - - - sla, sda, speKL, speCJ, speC, ssa - - - - - - - - - - Ш5 4- - + 4- 4- - + 4- - 4in/6 - - - 4- - + - 4’ 4- inti -j- 4* + - + - 4- - + 4- Таблица 2 Описание штаммов коллекции Б № штамма Характеристика № штамма Характеристика Регион Заболевание Регион Заболевание 1Б Калифорния Сепсис 12Б Калифорния Сепсис 2Б Калифорния Сепсис 13Б Миннесота Сепсис ЗБ Калифорния Сепсис 14Б Калифорния Сепсис 4Б Калифорния Сепсис 15Б Орегон Сепсис 5Б Калифорния Сепсис 16Б Миннесота Сепсис 6Б Миннесота Сепсис 17Б Калифорния Сепсис 7Б Калифорния Сепсис 18Б Калифорния Сепсис 8Б Калифорния Сепсис 19Б Калифорния Сепсис 9Б Калифорния Сепсис 20Б Калифорния Сепсис 10Б Калифорния Сепсис 21Б Калифорния Сепсис 11Б Калифорния Сепсис 22Б Калифорния Сепсис РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Стрептококки группы А относятся к группе патогенных для человека микроорганизмов, в физиологии которых существенную роль играют бактериофаги. В первую очередь исследователи связывают эту роль со способностью влиять на вирулентные свойства микроорганизма за счет привнесения в его геном дополнительных факторов патогенности. При этом известно, что если общая схема генетической организации различных участков бактериофагов S. pyogenes является неизменной, то участки фаговых геномов, ответственные за интеграцию, а также за перенос генов токсигенности, характеризуются высокой степенью гетерогенности (рис. I). Известно, что бактериофаги S. pyogenes могут переносить до двух различных генов токсинов, а интеграция в геном стрептококков может быть обусловлена как минимум 9 различными интегралами с различными сайтами интеграции [3]. Однако молекулярно-эпидемиологических исследований, позволяющих установить взаимосвязи между набором генов бактериофагов у штаммов S. pyogenes и особенностями вызываемых ими патологических процессов, проведено крайне мало. При этом в большинстве случаев исследователи ограничивались в работе лишь одним методом детекции генов: либо ПЦР, либо гибридизацией, что снижает общую достоверность полученных результатов. В настоящей работе сделана попытка осуществить сравнительный анализ штаммов S. pyogenes одного из наиболее распространенных серотипов (М49), отличающихся как по географическому региону выделения штаммов, так и по тяжести инфекционных процессов, вызванных этими штаммами. Анализ геномов штаммов S. pyogenes на наличие генов бактериофагов проводили с использованием sdn majorH in(4 speG majorT in(5 Рис. 2. Результаты гибридизации для штамма 9 А на гены sdn, majorH, int4, speG, majorT и int5 методов ДНК-ДНК-гибридизации (рис. 2) и ПЦР. При сопоставлении результатов, полученных этими методами, была обнаружена высокая степень корреляции. Однако выявлен и ряд несоответствий, таких как присутствие в геноме одного из штаммов гена speA (согласно данным гибридизации) и отсутствие гена speA в геноме этого штамма (согласно данным ПЦР). Данный факт можно объяснить, например, точечными мутациями в последовательности гена speA, соответствующей З’-концу праймера, которые привели к невозможности отжига праймера, использованного для ПЦР. В результате проведенного исследования была изучена распространенность фаговых генов среди штаммов S. pyogenes серотипа М49. Среди штаммов обеих коллекций (А и Б) наиболее часто встречались штаммы, содержащие гены speA (56% и 86% соответственно), speG (100% и 95%), speH (50% и 64%) и hyl (69% и 91 %), а также гены, кодирующие фаговые интегразы: into (63% и 82%) и Ш7 (81% и 87%). Наименее распространены среди штаммов обеих коллекций были гены sla (13% и 0%), sdn (0% и 5%), sda (0% и 0%), speKL (6% и 0%), majorT (0% и 5%) и ssa (9% и 0%), а также гены int2 (13% и 0%) и int8 (0% и 9%), кодирующие интегразы бактериофагов (рис. 3). Следует отметить, что штаммы из коллекции А характеризовались существенно более выраженным разнообразием фаговых генов (частота встречаемости этих генов составила 35-65%), в то время как среди штаммов коллекции Б частота встречаемости большинства исследованных генов принимала крайние значения (менее 18% или более 82%). Подобные отличия можно объяснить тем, что в коллекцию А вошли штаммы, полученные из разных стран от людей с различными стрептококковыми заболеваниями, а коллекция Б включала в себя штаммы, полученные из США от пациентов только с септическими поражениями. Среди 16 штаммов коллекции А было выявлено 15 различных наборов фаговых генов, в то время как среди 22 штаммов коллекции Б было выявлено 7 наборов фаговых генов. Это свидетельствует о более близкой степени генетического родства штаммов коллекции Б по сравнению со штаммами коллекции А. У штаммов коллекции Б, содержащих в своем геноме ген int7, кодирующий фаговую интегразу, присутствовал также и ген speA, кодирующий пирогенный токсин А (табл. 3). В то же время штаммы, не содержащие в своем геноме ген іп(7, не имели гена speA. Данный факт свидетельствует о возможном нахождении генов Ш7 и speA в составе ДНК одного и того же бактериофага. Эти результаты соответствуют данным, полученным ранее при анализе штаммов - - А 1 1 ■_ 1 П 1 t Т I .1 1 лі и В 1111 ПІ „у- „<£■ dd лѵ & сЗ> So ^ 6 6 А Л А «б Л чЬ Г* ^ г ^ ^ ^ ^ ^ ^ гены ш коллекция А □ коллекция Б Рис. 3. Распространенность фаговых генов среди штаммов S', pyogenes S. pyogenes типов Ml и Ml2, выделенных в г. Пекине [1, 13]. Анализ недавно опубликованной полно- геномной последовательности штамма S. pyogenes MGAS5005 показал, что эти гены действительно находятся в составе одного профага, что подтверждает наше предположение [16]. Большинство исследованных в данной работе штаммов содержали гены двух фаговых интеграз, что указывает на наличие в геномах этих штаммов как минимум двух профагов. Исключение составляют два штамма (6Б и 13Б) коллекции, у которых было обнаружено по одному гену, кодирующему фаговую интегразу (int7 и іпіб соответственно). Данный факт представляет определенный интерес, так как в настоящее время считается, что штаммы 5. pyogenes содержат как минимум два профага [3]. Возможно, геномы штаммов 6Б и 13Б содержат гены ранее не охарактеризованных интеграз. Следует отметить, что в настоящее время в литературе содержится мало информации о распространенности фаговых генов среди штаммов S. pyogenes серотипа М49. По данным Yu С. и Ferretti J., ген spe/i широко распространен среди штаммов серотипа М49, вызывающих скарлатину [19]. Кроме того, согласно исследованию, проведенному в Японии, ген speA был обнаружен у 4 из 5 штаммов серотипа М49, а ген speC не встречался ни у одного штамма, что отличается от наших данных [9]. При сравнении полученных нами данных по распространенности фаговых генов среди штаммов 5. pyogenes серотипа М49 с таковыми среди штаммов других серотипов [1, 4, 8, 5, 18] было обнаружено, что некоторые фаговые гены в меньшей степени характерны для штаммов серотипа М49. Так, ген speA был более широко представлен среди штаммов серотипа Ml (81-100%) [1, 10, 5, 17, 19], в то время как в данной работе его распространенность среди штаммов серотипа М49 составила только 50% и 86% (коллекции №1 и №2 соответственно). Сходные данные наблюдались и в отношении гена spel, частота встречаемости которого по результатам данного исследования составила 31 % и 82% (коллекции № 1 и №2 соответственно), а по результатам исследований штаммов серотипа Ml - 6,5% и 0,9% [4]. Кроме того, ген speC оказался менее распространен среди штаммов серотипа М49 (20-60%) по сравнению со штаммами типов М28 (80-84%), етпА (90% и 95%) и <?ш/«89 (80%) [5, 8, 18]. Учитывая широкую распространенность генов speA и speC среди штаммов различных серотипов можно предположить, что бактериофаги, содержащие эти гены, придают штаммам определенные эволюционные преимущества. В целом в настоящей работе обнаружена значительная генетическая гетерогенность штаммов У pyogenes серотипа М49, обусловленная различиями в наличии профаговых генов и количеством профагов. Сравнительный анализ распространенности генов фаговых токсинов, проведенный двумя методами (гибридизация и ПЦР), показал, что гены токсинов A, J и Н наиболее широко представлены среди штаммов коллекции Б, характеризующихся тяжелой формой стрептококковой патологии (сепсис), в отличие от штаммов коллекции А. Выявлено, что сходство штаммов по набору профаговых генов в значительной мере обусловлено их географическим происхождением, что подтверждает роль трансдукции в эволюции стрептококков.

E M Polyakova

Research Institute of Experimental Medicine NWB RAMS, St. Petersburg

Email: ekaterinapolvakova@rambler.ru

J J Ferretti

A V Dmitriev

Research Institute of Experimental Medicine NWB RAMS, St. Petersburg

A A Totolian

Research Institute of Experimental Medicine NWB RAMS, St. Petersburg

A N Suvorov

Research Institute of Experimental Medicine NWB RAMS, St. Petersburg

  1. Полякова Е., Гао В., Янг Я., Суворов., Тотолян А. Молекулярно-генетическое сравнение штаммов Streptococcus pyogenes типов етті и етт12 по набору профаговых генов // ЖМЭИ. 2001. № 2. С. 18-24.
  2. Beres S.B., Sylva G.L., Barbian K.D. et al. Genome sequence of a serotype М3 strain of group A Streptococcus: phage-encoded toxins, the high-virulence phenotype, and clone emergence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. № 15. P. 10078-10083.
  3. Beres S.B., Musser J.M. Contribution of exogenous genetic elements to the group A Streptococcus metagenome // PLoS ONE. 2007. Vol. 2. № 8. e800.
  4. Brussovv H., Canchaya C., and Hardt W.D. Phages and the evolution of bacterial pathogens: from genomic rearrangements to lysogenic conversion // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. Vol. 68. № 3. P. 560-602.
  5. Ekelund K., Skinhoj P., Madsen J. et al. Reemergence of emml and a changed superantigen profile for group A streptococci causing invasive infections: results from a nationwide study // J. Clin. Microbiol. 2005. Vol. 43. №4. P. 1789-1796.
  6. Feuetti J.J., McShan W.M., Ajdic D. et al. Complete Genome Sequence of an Ml Strain of Streptococcus pyogenes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. Vol. 98. P. 4658^1663.
  7. Goshom S.C., Schlievert P.M. Bacteriophage association of streptococcal pyrogenic exotoxin type C // J. Bacteriol. 1989. Vol. 171. № 8. P. 3068-3073.
  8. Green N.M., Beres S.B., Graviss E.A. et al. Genetic diversity among type emm28 group A Streptococcus strains causing invasive infections and pharyngitis // J. Clin. Microbiol. 2005. Vol. 43. № 8. P. 4083-4091.
  9. Ikcbe T., Endo M., Ueda Y. et al. The genetic properties of Streptococcus pyogenes emm49 genotype strains recently emerged among severe invasive infections in Japan // Jpn. J. Inf. Dis. 2004. Vol. 57. № 4. P. 187- 188.
  10. Jing H., Ning В., Hao H. et al. Epidemiological analysis of group A streptococci recovered from patients in China//Med. Microbiol. 2006. Vol. 55. № 8. P. 1101 - 1107.
  11. Maniatis T., Fritsch E.F. and Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor. Labor. Press. NY., 1982.
  12. Nakagawa I., Kurokawa К., Yamashita A. et al. Genome sequence of an М3 strain of Streptococcus pyogenes reveals a large-scale genomic rearrangement in invasive strains and new insights into phage evolution // Genome Res. 2003. Vol. 13. № 6A. P. 1042-1055.
  13. Polyakova E., Suvorov A., Gao W., Yang H., Feretti J. GAS strain from various sources have specific and different phage genes profiles //Article ofXVII LISSSD. 2008. P 248.
  14. Smoot J.C., Barbian K.D., Gompel J.J. et al. Genome sequence and comparative microarray analysis of serotype M18 group A Streptococcus strains associated with acute rheumatic fever outbreaks // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. № 7. P 4668^1673.
  15. Sumby P, Porceila S.F., Madrigal A.G. et al. Evolutionary origin and emergence of a highly successful clone of serotype Ml group a Streptococcus involved multiple horizontal gene transfer events // J. Infect. Dis. 2005. Vol. 192. № 5. P. 771-782.
  16. Suvorov A.N., Polyakova E.M., McShan W.M. Bacteriophage content of M49 strains of Streptococcus pyogenes // FEMS Microbiol. Lett. 2009. Vol. 294. № 1. P. 9-15.
  17. Vlaminckx B.J., Schuren F.H., Montijn R.C. et al. Determination of the relationship between group A streptococcal genome content, M type, and toxic shock syndrome by a mixed genome microarray // Infect. Immunol. 2007. Vol. 75. № 5. P. 2603-2611.
  18. Wahl R.U., Liitticken R., Stanzel S. et al. Epidemiology of invasive Streptococcus pyogenes infections in Germany, 1996-2002: results from a voluntary laboratory surveillance system // Clin. Microbiol. Infect. 2007. Vol. 13. № 12. P. 1173-1178.
  19. Yu C., Ferretti J. Molecular epidemiologic analysis of the type A streptococcal exotoxin (erythrogenic toxin) gene (speA) in clinical Streptococcus pyogenes strains // Infect. Immunol. 1989. Vol. 57. № 12. P. 3715-3719.

Views

Abstract - 49

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2011 Polyakova E.M., Ferretti J.J., Dmitriev A.V., Totolian A.A., Suvorov A.N.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies