Получение рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 и его действие на клетки нейробластомы in vitro
- Авторы: Ищук С.А.1, Богомолова Е.Г.1,2, Добровольская О.А.1, Ахметшина А.О.2, Краснощек Д.С.3, Луковенко А.А.2, Федорова ЕА1, Кляус АМ4, Колмаков Н.Н.1, Жеребцова Ю.В.1, Духовлинов И.В.1, Климов Н.А.1, Симбирцев А.С.1
-
Учреждения:
- ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
- ООО «Биохимический агент»
- ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова»
- ООО «Инффарм Консалтинг»
- Выпуск: Том 18, № 4 (2018)
- Страницы: 34-41
- Раздел: Статьи
- Статья опубликована: 15.12.2018
- URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/11683
- DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ18434-41
- ID: 11683
Цитировать
Полный текст
Доступ предоставлен
Доступ платный или только для подписчиков
Аннотация
Цели настоящего исследования — разработка метода получения рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 человека на основе прокариотической системы экспрессии и характеристика полученного высокоочищенного белка.
Для достижения цели исследования были использованы следующие методы: автоматизированный химический синтез ДНК, конструирование экспрессионной плазмиды, получение клеток Escherichia coli — продуцента рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 человека, культивирование полученных клеток-продуцентов с индукцией синтеза рекомбинантного белка изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом и лактозой, очистка полученного рекомбинантного белка с применением методов аффинной и катионообменной хроматографии, а также изучение биологической активности полученного белка инсулиноподобного фактора роста-1 на культуре клеток нейробластомы Neuro 2a.
Показано, что при индукции экспрессии в клетках Escherichia coli BL21, содержащих плазмиду pET28-IGF-1, синтезируется рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста-1 человека, который образует тельца включения. Был получен препарат очищенного рекомбинантного белка с чистотой 98 % с использованием методов аффинной и катионообменной хроматографии. Выход белка составил 6 мг рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 человека с 1 г сырой биомассы штамма-продуцента. Полученный белок обладает способностью к защите клеток нейробластомы Neuro 2a от гибели, вызванной депривацией сыворотки в культуральной среде, и стимулирует дифференцировку клеток в нейроны.
Таким образом, получен высокоочищенный рекомбинантный инсулиноподобный фактор роста-1 человека, обладающий биологической активностью, пригодный для проведения доклинических исследований.
Полный текст
Об авторах
Сергей Александрович Ищук
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Автор, ответственный за переписку.
Email: s.ischuk.spb@gmail.com
аспирант отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии
Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12Елена Григорьевна Богомолова
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»; ООО «Биохимический агент»
Email: bogomolovaele@inbox.ru
аспирант отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии ; заместитель директора по науке
Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12; Санкт-ПетербургОльга Андреевна Добровольская
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: dobrovolskaya-oly@yandex.ru
научный сотрудник отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии
Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12Алёна Олеговна Ахметшина
ООО «Биохимический агент»
Email: akhmetshinaalena@gmail.com
научный сотрудник
Россия, Санкт-ПетербургДарья Сергеевна Краснощек
ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова»
Email: dkrasnoshchek@list.ru
студент 6-го курса
Россия, 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6-8Анна Алексеевна Луковенко
ООО «Биохимический агент»
Email: a.lukovenko@yahoo.com
младший научный сотрудник
Россия, Санкт-ПетербургЕ А Федорова
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: science.eaf@yandex.ru
научный сотрудник отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии
Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12А М Кляус
ООО «Инффарм Консалтинг»
Email: Inffarmcon@gmail.com
генеральный директор
Россия, Санкт-ПетербургНиколай Николаевич Колмаков
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: ashvin.nick@gmail.com
научный сотрудник отдела молекулярной генетики
Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12Юлия Владиславовна Жеребцова
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: juliazh@yandex.ru
младший научный сотрудник отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии
Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12Илья Владимирович Духовлинов
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: dukhovlinov@gmail.com
канд. биол. наук, заведующий лабораторией генной инженерии белков отдела медицинской биотехнологии и иммунофармакологии
Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12Николай Анатольевич Климов
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: nklimov@mail.ru
канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной биотехнологии и иммунофармакологии
Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12Андрей Семенович Симбирцев
ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины»
Email: simbas@mail.ru
д-р биол. наук, член-корр. РАН, заведующий отделом медицинской биотехнологии и иммунофармакологии
Россия, 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12Список литературы
- Laviola L, Natalicchio A, Perrini S, Giorgino F. Abnormalities of IGF-I signaling in the pathogenesis of diseases of the bone, brain, and fetoplacental unit in humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2008;295(5):E991-999. https://doi.org/10.1152/ajpendo.90452.2008.
- Dyer AH, Vahdatpour C, Sanfeliu A, Tropea D. The role of Insulin-Like Growth Factor 1 (IGF-1) in brain development, maturation and neuroplasticity. Neuroscience. 2016;325:89-99. https://doi.org/10.1016/ j.neuroscience.2016.03.056.
- O’Kusky J, Ye P. Neurodevelopmental effects of insulin-like growth factor signaling. Front Neuroendocrinol. 2012;33(3):230-251. https://doi.org/10.1016/j.yfrne.2012.06.002.
- Yamada M, Tanabe K, Wada K, et al. Differences in survival-promoting effects and intracellular signaling properties of BDNF and IGF-1 in cultured cerebral cortical neurons. J Neurochem. 2001;78(5):940-951. https://doi.org/10.1046/j.1471-4159.2001.00497.x.
- Lindholm D, Carroll P, Tzimagiorgis G, Thoenen H. Autocrine-paracrine Regulation of Hippocampal Neuron Survival by IGF-1 and the Neurotrophins BDNF, NT-3 and NT-4. Eur J Neurosci. 1996;8(7):1452-1460. https://doi.org/10.1111/j.1460-9568.1996.tb01607.x.
- Fernandez M, Sanchez-Franco F, Palacios N, et al. IGF-I inhibits apoptosis through the activation of the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in pituitary cells. J Mol Endocrinol. 2004:155-163. https://doi.org/10.1677/jme.0.0330155.
- Reinhardt RR. Insulin-like growth factors cross the blood-brain barrier. Endocrinology. 1994;135(5):1753-1761. https://doi.org/10.1210/endo.135.5.7525251.
- Nishijima T, Piriz J, Duflot S, et al. Neuronal activity drives localized blood-brain-barrier transport of serum insulin-like growth factor-I into the CNS. Neuron. 2010;67(5):834-846. https://doi.org/10.1016/ j.neuron.2010.08.007.
- Thorne RG, Pronk GJ, Padmanabhan V, Frey WH, 2nd. Delivery of insulin-like growth factor-I to the rat brain and spinal cord along olfactory and trigeminal pathways following intranasal administration. Neuroscience. 2004;127(2):481-496. https://doi.org/10.1016/j.neuroscience.2004.05.029.
- Expasy.org [Internet]. ExPASy. Bioinformatics Resource Portal [cited 2018 Feb 17]. Avaliable from: https://www.expasy.org/.
- Bake S, Selvamani A, Cherry J, Sohrabji F. Blood brain barrier and neuroinflammation are critical targets of IGF-1-mediated neuroprotection in stroke for middle-aged female rats. PLoS One. 2014;9(3):e91427. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091427.
- Kooijman R, Sarre S, Michotte Y, De Keyser J. Insulin-like growth factor I: a potential neuroprotective compound for the treatment of acute ischemic stroke? Stroke. 2009;40(4):e83-88. https://doi.org/10.1161/STROKEAHA.108.528356.
- Liu X-F, Fawcett JR, Thorne RG, Frey Ii WH. Non-invasive intranasal insulin-like growth factor-I reduces infarct volume and improves neurologic function in rats following middle cerebral artery occlusion. Neurosci Lett. 2001;308(2):91-94. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(01)01982-6.
- Majumder K. Ligation-free gene synthesis by PCR: synthesis and mutagenesis at multiple loci of a chimeric gene encoding OmpA signal peptide and hirudin. Gene. 1992;110(1):89-94. https://doi.org/10.1016/0378-1119(92)90448-x.
- Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. - М.: Мир, 1984. [Maniatis T, Fritsch E, Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Moscow: Mir; 1984. (In Russ.)]
- Studier FW. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 2014;1091:17-32. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-691-7_2.
- Shunyan J, Shuqin L, Chunjiang Z, Changxin W. Developing Protocols of Tricine-SDS-PAGE for Separation of Polypeptides in the Mass Range 1-30 kDa with Minigel Electrophoresis System. Int J Electrochem Sci. 2016;11:640-649.
- Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193(1):265-275.
- Rotwein P. Two insulin-like growth factor I messenger RNAs are expressed in human liver. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1986;83(1):77-81. https://doi.org/10.1073/pnas.83.1.77.
- Codon usage database. URL: http://www.kazusa.or.jp/codon.
- Vincent AM, Mobley BC, Hiller A, Feldman EL. IGF-I prevents glutamate-induced motor neuron programmed cell death. Neurobiol Dis. 2004;16(2):407-416. https://doi.org/10.1016/j.nbd.2004.03.001.
- Tang Y, Zhang W, Tang H, Li P. Protective effects of IGF-1 on neurons under condition of hypoxia and the role of PI3K signal pathway. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2011;36(1):21-26. https://doi.org/10.3969/j.issn.1672-7347.2011.01.004.
- Духовлинов И.В., Богомолова Е.Г., Добровольская О.А., и др. Продукция in vivo инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1), кодируемого плазмидной ДНК // Медицинский академический журнал. - 2017. - Т. 17. - № 3. - С. 47-52. [Dukhovlinov IV, Bogomolova EG, Dobrovolskaya OV, et al. In vivo production of insulin-like growth factor coded by plasmid DNA. Med Akad Z. 2017;17(3):47-52. (In Russ.)]
- Han IK, Kim MY, Byun HM, et al. Enhanced brain targeting efficiency of intranasally administered plasmid DNA: an alternative route for brain gene therapy. J Mol Med (Berl). 2007;85(1):75-83. https://doi.org/10.1007/s00109-006-0114-9.
- Lin S, Fan LW, Rhodes PG, Cai Z. Intranasal administration of IGF-1 attenuates hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats. Exp Neurol. 2009;217(2):361-370. https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2009.03.021.