Выявление популяции клеток купфера в печени крысы с использованием моноклональных и поликлональных антител к микроглиальному маркеру Iba-1

Обложка


Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Обоснование. Использование современных методов иммуногистохимии — необходимый атрибут любого исследования, касающегося клеточной биологии различных структурных компонентов органов пищеварительного тракта. Одним из наиболее трудновизуализируемых объектов среди них являются клетки Купфера — резидентные макрофаги печени, что определяет высокую актуальность разработки надежных методов их выявления.

Цель — разработать протокол иммуногистохимического исследования клеток Купфера в печени крысы с использованием двух первичных антител против Iba-1 (поликлональных козьих и моноклональных кроличьих) и проанализировать преимущества и недостатки используемого метода с учетом применения цинк-этанол-формальдегида в качестве фиксатора.

Материалы и методы. Исследование проводили в образцах печени половозрелых крыс (n = 5). Поликлональные козьи антитела к Iba-1 в разведении 1 : 1000 (ab5076, Abcam, Великобритания) и моноклональные кроличьи антитела к Iba-1 в разведении 1 : 800 (ET1705-78, HuaBio, Китай) использовали для светооптического исследования резидентных макрофагов печени.

Результаты. Протокол с использованием поликлональных козьих антител и специфических блокаторов позволил обнаружить клетки Купфера в исследованных образцах, но также давал неспецифическое фоновое окрашивание. Протокол с использованием моноклональных кроличьих антител позволил выявить клетки Купфера в образцах печени крысы с большой специфичностью и минимальным фоновым окрашиванием тканей печени. При использовании протокола с применением моноклональных кроличьих антител было выявлено больше Iba-1-иммунопозитивных структур (большее количество клеток на единицу площади при исследовании одного и того же участка печени для каждого случая), чем при использовании протокола с поликлональными козьими антителами. Фиксация с использованием цинк-этанол-формальдегида позволила выявить Iba-1-иммунопозитивные клетки во всех образцах печени крыс.

Заключение. На основании полученных данных был сделан вывод, что фиксация цинк-этанол-формальдегидом сохраняет антигенные свойства тканей, позволяя эффективно использовать различные антитела. Из рассмотренных протоколов иммуногистохимического окрашивания наиболее оптимальным является протокол с использованием моноклональных кроличьих антител.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Инга Александровна Никитина

Институт экспериментальной медицины

Email: inga06819@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории экспериментальной гистологии и конфокальной микроскопии отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Валерия Алексеевна Разенкова

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: valeriya.raz@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-3997-2232
SPIN-код: 8877-8902
Scopus Author ID: 57219609984
ResearcherId: AAH-1333-2021

аспирант, младший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Ольга Викторовна Кирик

Институт экспериментальной медицины

Email: olga_kirik@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6113-3948
SPIN-код: 5725-8742
Scopus Author ID: 27171304100
ResearcherId: A-8710-2012

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Эдуардович Коржевский

Институт экспериментальной медицины

Email: DEK2@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2456-8165
SPIN-код: 3252-3029
Scopus Author ID: 12770589000
ResearcherId: C-2206-2012

д-р мед. наук, профессор РАН, заведующий лабораторией функциональной морфологии центральной и периферической нервной системы отдела общей и частной морфологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Baeck C., Wei X., Bartneck M. et al. Pharmacological inhibition of the chemokine C-C motif chemokine ligand 2 (monocyte chemoattractant protein 1) accelerates liver fibrosis regression by suppressing Ly-6C+ macrophage infiltration in mice // Hepatology. 2014. Vol. 59, No. 3. P. 1060–1072. doi: 10.1002/hep.26783
  2. Tsuji Y., Kuramochi M., Golbar H.M. et al. Acetaminophen-induced rat hepatotoxicity based on M1/M2-macrophage polarization, in possible relation to damage-associated molecular patterns and autophagy // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21, No. 23. P. 8998. doi: 10.3390/ijms21238998
  3. Purhonen J., Rajendran J., Mörgelin M. et al. Ketogenic diet attenuates hepatopathy in mouse model of respiratory chain complex III deficiency caused by a Bcs1l mutation // Sci. Rep. 2017. Vol. 7. P. 1–16. doi: 10.1038/s41598-017-01109-4
  4. Mossanen J.C., Krenkel O., Ergen C. et al. Chemokine (C-C motif) receptor 2–positive monocytes aggravate the early phase of acetaminophen-induced acute liver injury // Hepatology. 2016. Vol. 64, No. 5. P. 1667–1682. doi: 10.1002/hep.28682
  5. Zhao Q., Sheng M.F., Wang Y.Y. et al. LncRNA Gm26917 regulates inflammatory response in macrophages by enhancing Annexin A1 ubiquitination in LPS-induced acute liver injury // Front. Pharmacol. 2022. Vol. 13. P. 975250. doi: 10.3389/fphar.2022.975250
  6. Nuovo G. False-positive results in diagnostic immunohistochemistry are related to horseradish peroxidase conjugates in commercially available assays // Ann. Diagn. Pathol. 2016. Vol. 25. P. 54–59. doi: 10.1016/j.anndiagpath.2016.09.010
  7. Hammond M.E.H., Hayes D.F., Dowsett M. et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Guideline Recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version) // Arch. Pathol. Lab. Med. 2010. Vol. 134, No. 7. P. e48–e72. doi: 10.5858/134.7.e48
  8. Bordeaux J., Welsh A., Agarwal S. et al. Antibody validation // BioTechniques. 2010. Vol. 48, No. 3. P. 197–209. doi: 10.2144/000113382
  9. Коржевский Д.Э., Отеллин В.А., Григорьев И.П. и др. Иммуноцитохимическое выявления нейрональной NO-синтазы в клетках головного мозга крысы // Морфология. 2007. Т. 132, № 4. С. 77–80.
  10. Jiang Y., Tang Y., Hoover C. et al. Kupffer cell receptor CLEC4F is important for the destruction of desialylated platelets in mice // Cell Death Differ. 2021. Vol. 28, No. 11. P. 3009–3021. doi: 10.1038/s41418-021-00797-w
  11. Chen B., Li R., Kubota A. et al. Identification of macrophages in normal and injured mouse tissues using reporter lines and antibodies // Sci. Rep. 2022. Vol. 12, No. 1. P. 4542. doi: 10.1038/s41598-022-08278-x
  12. Ait Ahmed Y., Fu Y., Rodrigues R.M. et al. Kupffer cell restoration after partial hepatectomy is mainly driven by local cell proliferation in IL-6-dependent autocrine and paracrine manners // Cell. Mol. Immunol. 2021. Vol. 18, No. 9. P. 2165–2176. doi: 10.1038/s41423-021-00731-7
  13. Miyagawa S., Miwa S., Soeda J. et al. Morphometric analysis of liver macrophages in patients with colorectal liver metastasis // Clin. Exp. Metastasis. 2002. Vol. 19, No. 2. P. 119–125. doi: 10.1023/a:1014571013978
  14. Nishikawa K., Iwaya K., Kinoshita M. et al. Resveratrol increases CD68+ Kupffer cells colocalized with adipose differentiation-related protein and ameliorates high-fat-diet-induced fatty liver in mice // Mol. Nutr. Food Res. 2015. Vol. 59, No. 6. P. 1155–1170. doi: 10.1002/mnfr.201400564
  15. Ananiev J., Penkova M., Tchernev G. et al. Macrophages and dendritic cells in the development of liver injury leading to liver failure // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 2014. Vol. 28, No. 4. P. 789–794.
  16. Guillot A., Buch C., Jourdan T. Kupffer Cell and monocyte-derived macrophage identification by immunofluorescence on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) mouse liver sections // Methods Mol. Biol. 2020. Vol. 2164. P. 45–53. doi: 10.1007/978-1-0716-0704-6_6
  17. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Сырцова М.А. Микроглия черного вещества головного мозга человека // Медицинский академический журнал. 2014. Т. 14, № 4. С. 68–72.
  18. Hopperton K.E., Mohammad D., Trépanier M.O. et al. Markers of microglia in post-mortem brain samples from patients with Alzheimer’s disease: a systematic review // Mol. Psychiatry. 2018. Vol. 23, No. 2. P. 177–198. doi: 10.1038/mp.2017.246
  19. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Алексеева О.С., и др. Внутриядерное накопление белка IBA-1 в микроглиоцитах головного мозга человека // Морфология. 2016. Т. 149, № 2. С. 73–76.
  20. Saper C.B. A guide to the perplexed on the specificity of antibodies // J. Histochem. Cytochem. 2009. Vol. 57, No. 1. P. 1–5. doi: 10.1369/jhc.2008.952770
  21. Sasaki Y., Ohsawa K., Kanazawa H. et al. Iba1 is an actin-cross-linking protein in macrophages/microglia // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 286, No. 2. P. 292–297. doi: 10.1006/bbrc.2001.5388
  22. Nguyen T.T.H., Lee J.S., Shim H. Construction of rabbit immune antibody libraries // Methods Mol. Biol. 2018. Vol. 1701. P. 133–146. doi: 10.1007/978-1-4939-7447-4_7
  23. Rashidian J., Lloyd J. Single B Cell cloning and production of rabbit monoclonal antibodies // Methods Mol. Biol. 2020. Vol. 2070. P. 423–441. doi: 10.1007/978-1-4939-9853-1_23
  24. Григорьев И.П., Коржевский Д.Э. Современные технологии фиксации биологического материала, применяемые при проведении иммуногистохимических исследований (обзор) // Современные технологии в медицине. 2018. Т. 10, № 2. С. 156. doi: 10.17691/stm2018.10.2.19
  25. Патент RU2719163C1/ 17.04.2020. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Алексеева О.С. Способ демаскирования антигенов при проведении иммуноцитохимических реакций.
  26. Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E. et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis // Nat. Methods. 2012. Vol. 9, No. 7. P. 676–682. doi: 10.1038/nmeth.2019
  27. Pervin M., Hasan I., Kobir M.A. et al. Immunophenotypic analysis of the distribution of hepatic macrophages, lymphocytes and hepatic stellate cells in the adult rat liver // Anat. Histol. Embryol. 2021. Vol. 50, No. 4. P. 736–745. doi: 10.1111/ahe.12718
  28. Lefkowitch J.H., Haythe J.H., Regent N. Kupffer Cell aggregation and perivenular distribution in steatohepatitis // Mod. Pathol. 2002. Vol. 15, No. 7. P. 699–704. doi: 10.1097/01.MP.0000019579.30842.96
  29. Lee W.B., Erm S.K., Kim K.Y., Becker R.P. Emperipolesis of erythroblasts within Kupffer cells during hepatic hemopoiesis in human fetus // Anat. Rec. 1999. Vol. 256, No. 2. P. 158–164. doi: 10.1002/(SICI)1097-0185(19991001)256:2<158::AID-AR6>3.0.CO;2-0
  30. Urushihara N., Iwagaki H., Yagi T. et al. Elevation of serum interleukin-18 levels and activation of Kupffer cells in biliary atresia // J. Pediatr. Surg. 2000. Vol. 35, No. 3. P. 446–449. doi: 10.1016/s0022-3468(00)90211-2
  31. Brown K.E., Brunt E.M., Heinecke J.W. Immunohistochemical detection of myeloperoxidase and its oxidation products in Kupffer cells of human liver // Am. J. Pathol. 2001. Vol. 159, No. 6. P. 2081–2088. doi: 10.1016/S0002-9440(10)63059-3
  32. Domínguez-Soto A., Aragoneses-Fenoll L., Gómez-Aguado F. et al. The pathogen receptor liver and lymph node sinusoidal endotelial cell C-type lectin is expressed in human Kupffer cells and regulated by PU.1 // Hepatology. 2009. Vol. 49, No. 1. P. 287–296. doi: 10.1002/hep.22678
  33. Abdel Hafez S.M.N., Rifaai R.A., Bayoumi A.M.A. Impact of renal ischemia/reperfusion injury on the rat Kupffer cell as a remote cell: A biochemical, histological, immunohistochemical, and electron microscopic study // Acta Histochem. 2019. Vol. 121, No. 5. P. 575–583. doi: 10.1016/j.acthis.2019.04.008
  34. Haralanova-Ilieva B., Ramadori G., Armbrust T. Expression of osteoactivin in rat and human liver and isolated rat liver cells // J. Hepatol. 2005. Vol. 42, No. 4. P. 565–572. doi: 10.1016/j.jhep.2004.12.021
  35. Monnier J., Piquet-Pellorce C., Feige J.J. et al. Prokineticin 2/Bv8 is expressed in Kupffer cells in liver and is down regulated in human hepatocellular carcinoma // World J. Gastroenterol. 2008. Vol. 14, No. 8. P. 1182–1191. doi: 10.3748/wjg.14.1182
  36. Dong W., Lu A., Zhao J. et al. An efficient and simple co-culture method for isolating primary human hepatic cells: Potential application for tumor microenvironment research // Oncol. Rep. 2016. Vol. 36, No. 4. P. 2126–2134. doi: 10.3892/or.2016.4979

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Iba-1-иммунопозитивные клетки в препаратах печени крысы: a, с — с использованием поликлональных козьих антител; b, d — с использованием моноклональных кроличьих антител; а, b — с подкраской ядер гепатоцитов квасцовым гематоксилином, увеличение микроскопа ×40; c, d — увеличение микроскопа ×10. Звездочка — центральная вена

Скачать (530KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Результат цифрового преобразования изображений с демонстрацией кластеризации Iba-1-иммунопозитивных клеток в препаратах печени крысы. Алгоритм DBSCAN, значение параметров ε = 50, minDensity = 5 объектов: a — с использованием поликлональных козьих антител; b — с использованием моноклональных кроличьих антителозаглавлен

Скачать (439KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Площадь, занимаемая Iba-1-положительными структурами: a — попарное сравнение общей площади окрашивания Iba-1-иммунопозитивных клеток при использовании поликлональных козьих и моноклональных кроличьих антител; * р < 0,05; b — результат статистического сравнения площади окрашивания Iba-1-иммунопозитивных клеток для всех пар случаев (n = 5; N1–N5) для поликлональных козьих и моноклональных кроличьих антител. На оси Y слева на каждом графике расположена масштабно-инвариантная проекция шкалы оси Y справа (мкм2) на участок от [0, 1]; * р < 0,05, ** р < 0,01

Скачать (168KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2023


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 74760 от 29.12.2018 г.


Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах