Влияние амфотерицина в на чувствительность к гриппозной инфекции клеток WI-38 VA-13 с нокаутом гена IFITM3

Полный текст

Обоснование

Белок IFITM3 входит в семейство трансмембранных интерферон-индуцируемых белков. Как было показано ранее, от 50 до 80 % защитных свойств интерферона обеспечивает именно IFITM3, блокируя слияние вирусных частиц и ограничивая таким образом вирусную инфекцию [1]. В свою очередь антимикотический препарат амфотерицин В понижает IFITM3-опосредованную рестрикцию, тем самым увеличивая вирусную репликацию [2]. На основе клеточной культуры эмбриональных фибробластов WI-38 VA-13 были получены линии клеток, дефектные по гену IFITM3, с помощью метода CRISPR-Cas9, как описано ранее [3]. При транскриптомном анализе клонов было выявлено, что клон F3 характеризовался сниженной экспрессией IFITM3, в то же время у клона E12 нокаут также затронул ген IFITM1. В предыдущих исследованиях было показано, что клоны E12 и F3 более чувствительны к инфекции вирусом гриппа по сравнению с исходными клетками (неопубликованные данные). С учетом того что амфотерицин В подавляет защитные механизмы IFITM3, его добавление в культуральную среду может быть маркером связи нокаута гена IFITM3 и пермиссивности к вирусу гриппа.

Цель данной работы — оценить влияние амфотерицина В на чувствительность клеток с нокаутом генов IFITM к инфекции вирусом гриппа А.

Материалы и методы

Клетки WI-38 VA-13 и мутантные клоны E12 (нокаут IFITM1, IFITM3) и F3 (нокаут IFITM3) культивировали в базовой среде DMEM/F-12 (1 : 1) c добавлением 1 % NEAA (Gibco), 1 % Sodium pyruvate (Gibco), 1 % GlutaMax (Gibco), 1 % антибиотика Pen/Strep (Gibco) и 10 % сыворотки FBS (Gibco) в инкубаторе при 37 °C, 5 % CO₂. Для заражения клеток использовали вирус A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (A/PR8) в дозе 2 ТИД₅₀/клетку (ТИД₅₀ — 50 % тканевой инфекционной дозы). В среду для заражения добавляли (или не добавляли) амфотерицин В в концентрации 0,25 мкг/мл. Через 48 ч после внесения вируса собирали аликвоты культуральной жидкости, в которых вычисляли количество вирусных частиц методом титрования с определением инфекционной активности в клеточной культуре MDCK или гемагглютинирующей активности с 0,5 % суспензией куриных эритроцитов. Зараженные клетки собирали, фиксировали, пермеабилизировали (BD Cytofix/Cytoperm) и окрашивали флуоресцентно меченными антителами к белку NP вируса гриппа А (ООО «ППДП»). В качестве контроля для окрашивания использовали незараженные клетки. Относительное количество зараженных клеток подсчитывали на проточном цитометре Cytoflex (Beckman Coulter).

Результаты и обсуждение

В данном исследовании мы оценили влияние амфотерицина В на чувствительность клеток с нокаутом одного или нескольких генов семейства IFITM к инфекции, вызванной вирусом гриппа А. Клетки WI-38 VA-13 (исходные и мутантные с нокаутом) заражали вирусом гриппа А/PR8 в присутствии и отсутствие амфотерицина В. На рис. 1 показан результат определения титра вируса, накопленного в клетках в различных условиях.

 

Рис. 1. Количество вируса A/PR8, накапливающегося в культуральной среде, при заражении исходных клеток WI-38 VA-13 и мутантных клонов E12 и F3: а — инфекционная активность вируса; b — гемагглютинирующая активность. AmpB — амфотерицин В

Fig. 1. The yield of the A/PR8 virus in the infected original WI-38 VA-13 cells and mutant clones E12 and F3: а — viral infectious activity; b — viral hemagglutinating activity. AmpB — amphotericin B

 

Согласно полученным данным в исходных клетках с полноценным белком IFITM3 вирус гриппа А накапливался в большем титре при добавлении амфотерицина В, чем без добавления (разница в 10 раз). В клетках F3 и E12 амфотерицин В практически не влиял на титры выделяющегося вируса.

На рис. 2 представлена разница в заражаемости клеток WI-38 VA-13с нокаутом IFITM3 и без него. Мутантные E12 и F3 не характеризовались значительным изменением количества зараженных клеток в зависимости от наличия амфотерицина В в среде. В свою очередь, число зараженных клеток без нокаута IFITM3 при добавлении амфотерицина В возрастало почти на 30 %.

 

Рис. 2. Количество инфицированных мутантных и исходных клеток через 48 ч после заражения вирусом гриппа A/PR8 по результатам окрашивания на вирусный нуклеопротеин. AmpB — амфотерицин В

Fig. 2. The number of infected mutant and original cells 48 hours after infection with A/PR8 virus as determined by staining for viral nucleoprotein. AmpB — amphotericin B

 

Исходя из полученных результатов можно заключить, что повышенная чувствительность клонов F3 и E12 к гриппозной инфекции объясняется главным образом нокаутом гена IFITM3, а не случайными эффектами офф-таргет. Мутантные клетки с нокаутом одного или нескольких генов семейства IFITM были одинаково чувствительны к гриппозной инфекции вне зависимости от добавления амфотерицина В, что подтверждает решающее значение дефекта в белке IFITM3 в повышении пермиссивности клеток к вирусу гриппа А. Можно отметить, что амфотерицин В повышает восприимчивость клеток к вирусу гриппа за счет воздействия на механизм рН-опосредованного эндоцитоза, и, возможно, данный эффект будет проявляться и для других вирусов, использующих указанный механизм для проникновения в клетки.

Заключение

Таким образом, полученные результаты могут иметь значение для применения антимикотика Амфотерицин B и подобных ему препаратов при терапии вирусных инфекций.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда № 18-75-10069.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарность. Авторы выражают благодарность научному сотруднику НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева канд. биол. наук К.А. Васильеву за анализ образцов на проточном цитометре.

Об авторах

Кира Сергеевна Корябина

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России; Санкт-Петербургский государственный технологический институт (Технический университет)

Автор, ответственный за переписку.
Email: kira336@yandex.ru

студент

Россия, Санкт-Петербург

Мария Валерьевна Сергеева

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России; Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: mari.v.sergeeva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0411-9896
SPIN-код: 9720-5812

канд. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории векторных вакцин

Россия, Санкт-Петербург; Новосибирск

Андрей Борисович Комиссаров

Научно-исследовательский институт гриппа им. А.А. Смородинцева Минздрава России; Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: a.b.komissarov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1733-1255
SPIN-код: 3792-8290

канд. биол. наук, заведующий лабораторией молекулярной вирусологии

Россия, Санкт-Петербург; Новосибирск

Наталья Вячеславовна Ещенко

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: eschenko96@gmail.com

младший научный сотрудник лаборатории геномного редактирования

Россия, Новосибирск

Григорий Александрович Степанов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: stepanovga@niboch.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-3393-3192
SPIN-код: 8587-2044

канд. хим. наук, старший научный сотрудник, заведующий лабораторией геномного редактирования

Россия, Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы