Amphotericin b effect on the sensitivity to influenza infection of WI-38 VA-13 cells with IFITM3 gene knockout
- Authors: Koryabina K.S.1,2, Sergeeva M.V.1,3, Komissarov A.B.1,3, Eshchenko N.V.3, Stepanov G.A.3
-
Affiliations:
- Smorodintsev Research Institute of Influenza
- St. Petersburg State Institute of Technology
- Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of SB RAS
- Issue: Vol 21, No 3 (2021)
- Pages: 109-112
- Section: Conference proceedings
- Published: 06.12.2021
- URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/76106
- DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ76106
- ID: 76106
Cite item
Abstract
BACKGROUND: The application of CRISPR/Cas9 is one of the most rapidly developing areas in biotechnology. This method was used to obtain clones of а human origin cell line with knockout of one or more genes of the IFITM family, representing host restriction factors for influenza infection. Amphotericin B has previously been shown to promote influenza infection by blocking IFITM3 function.
AIM: The aim of this study was to evaluate the effect of amphotericin B on the sensitivity of IFITM knockout cells to influenza A virus infection.
MATERIALS AND METHODS: WI-38 VA-13 cells and mutant clones with IFITM3 knockout (F3 clone) or IFITM1, IFITM3 knockout (clone E12) were infected with influenza virus A/PR/8/34 (H1N1) in the presence or absence of amphotericin B. Forty-four hours after infection, the culture medium was taken to determine the infectious activity of the virus by titration in the MDCK cell culture, as well as the hemagglutinating activity of the virus. The infected cells were stained with fluorescently labeled antibodies against the viral NP protein, and the number of NP-positive cells was determined by flow cytometry.
RESULTS: The addition of amphotericin B increased the hemagglutinating and infectious activity of the virus in WI-38 VA-13cells, while the difference was insignificant for clones with IFITM gene knockout. A similar dependency was obtained for the percent of infected cells.
CONCLUSIONS: Mutant cells with a knockout of one or several genes of the IFITM family were equally susceptible to influenza infection regardless of the addition of amphotericin B, which confirms the crucial importance of a defect in the IFITM3 protein in increasing the permissiveness of cells to influenza A virus.
Full Text
Обоснование
Белок IFITM3 входит в семейство трансмембранных интерферон-индуцируемых белков. Как было показано ранее, от 50 до 80 % защитных свойств интерферона обеспечивает именно IFITM3, блокируя слияние вирусных частиц и ограничивая таким образом вирусную инфекцию [1]. В свою очередь антимикотический препарат амфотерицин В понижает IFITM3-опосредованную рестрикцию, тем самым увеличивая вирусную репликацию [2]. На основе клеточной культуры эмбриональных фибробластов WI-38 VA-13 были получены линии клеток, дефектные по гену IFITM3, с помощью метода CRISPR-Cas9, как описано ранее [3]. При транскриптомном анализе клонов было выявлено, что клон F3 характеризовался сниженной экспрессией IFITM3, в то же время у клона E12 нокаут также затронул ген IFITM1. В предыдущих исследованиях было показано, что клоны E12 и F3 более чувствительны к инфекции вирусом гриппа по сравнению с исходными клетками (неопубликованные данные). С учетом того что амфотерицин В подавляет защитные механизмы IFITM3, его добавление в культуральную среду может быть маркером связи нокаута гена IFITM3 и пермиссивности к вирусу гриппа.
Цель данной работы — оценить влияние амфотерицина В на чувствительность клеток с нокаутом генов IFITM к инфекции вирусом гриппа А.
Материалы и методы
Клетки WI-38 VA-13 и мутантные клоны E12 (нокаут IFITM1, IFITM3) и F3 (нокаут IFITM3) культивировали в базовой среде DMEM/F-12 (1 : 1) c добавлением 1 % NEAA (Gibco), 1 % Sodium pyruvate (Gibco), 1 % GlutaMax (Gibco), 1 % антибиотика Pen/Strep (Gibco) и 10 % сыворотки FBS (Gibco) в инкубаторе при 37 °C, 5 % CO2. Для заражения клеток использовали вирус A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (A/PR8) в дозе 2 ТИД50/клетку (ТИД50 — 50 % тканевой инфекционной дозы). В среду для заражения добавляли (или не добавляли) амфотерицин В в концентрации 0,25 мкг/мл. Через 48 ч после внесения вируса собирали аликвоты культуральной жидкости, в которых вычисляли количество вирусных частиц методом титрования с определением инфекционной активности в клеточной культуре MDCK или гемагглютинирующей активности с 0,5 % суспензией куриных эритроцитов. Зараженные клетки собирали, фиксировали, пермеабилизировали (BD Cytofix/Cytoperm) и окрашивали флуоресцентно меченными антителами к белку NP вируса гриппа А (ООО «ППДП»). В качестве контроля для окрашивания использовали незараженные клетки. Относительное количество зараженных клеток подсчитывали на проточном цитометре Cytoflex (Beckman Coulter).
Результаты и обсуждение
В данном исследовании мы оценили влияние амфотерицина В на чувствительность клеток с нокаутом одного или нескольких генов семейства IFITM к инфекции, вызванной вирусом гриппа А. Клетки WI-38 VA-13 (исходные и мутантные с нокаутом) заражали вирусом гриппа А/PR8 в присутствии и отсутствие амфотерицина В. На рис. 1 показан результат определения титра вируса, накопленного в клетках в различных условиях.
Рис. 1. Количество вируса A/PR8, накапливающегося в культуральной среде, при заражении исходных клеток WI-38 VA-13 и мутантных клонов E12 и F3: а — инфекционная активность вируса; b — гемагглютинирующая активность. AmpB — амфотерицин В
Fig. 1. The yield of the A/PR8 virus in the infected original WI-38 VA-13 cells and mutant clones E12 and F3: а — viral infectious activity; b — viral hemagglutinating activity. AmpB — amphotericin B
Согласно полученным данным в исходных клетках с полноценным белком IFITM3 вирус гриппа А накапливался в большем титре при добавлении амфотерицина В, чем без добавления (разница в 10 раз). В клетках F3 и E12 амфотерицин В практически не влиял на титры выделяющегося вируса.
На рис. 2 представлена разница в заражаемости клеток WI-38 VA-13с нокаутом IFITM3 и без него. Мутантные E12 и F3 не характеризовались значительным изменением количества зараженных клеток в зависимости от наличия амфотерицина В в среде. В свою очередь, число зараженных клеток без нокаута IFITM3 при добавлении амфотерицина В возрастало почти на 30 %.
Рис. 2. Количество инфицированных мутантных и исходных клеток через 48 ч после заражения вирусом гриппа A/PR8 по результатам окрашивания на вирусный нуклеопротеин. AmpB — амфотерицин В
Fig. 2. The number of infected mutant and original cells 48 hours after infection with A/PR8 virus as determined by staining for viral nucleoprotein. AmpB — amphotericin B
Исходя из полученных результатов можно заключить, что повышенная чувствительность клонов F3 и E12 к гриппозной инфекции объясняется главным образом нокаутом гена IFITM3, а не случайными эффектами офф-таргет. Мутантные клетки с нокаутом одного или нескольких генов семейства IFITM были одинаково чувствительны к гриппозной инфекции вне зависимости от добавления амфотерицина В, что подтверждает решающее значение дефекта в белке IFITM3 в повышении пермиссивности клеток к вирусу гриппа А. Можно отметить, что амфотерицин В повышает восприимчивость клеток к вирусу гриппа за счет воздействия на механизм рН-опосредованного эндоцитоза, и, возможно, данный эффект будет проявляться и для других вирусов, использующих указанный механизм для проникновения в клетки.
Заключение
Таким образом, полученные результаты могут иметь значение для применения антимикотика Амфотерицин B и подобных ему препаратов при терапии вирусных инфекций.
Дополнительная информация
Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда № 18-75-10069.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарность. Авторы выражают благодарность научному сотруднику НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева канд. биол. наук К.А. Васильеву за анализ образцов на проточном цитометре.
About the authors
Kira S. Koryabina
Smorodintsev Research Institute of Influenza; St. Petersburg State Institute of Technology
Author for correspondence.
Email: kira336@yandex.ru
student
Russian Federation, Saint PetersburgMariya V. Sergeeva
Smorodintsev Research Institute of Influenza; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of SB RAS
Email: mari.v.sergeeva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0411-9896
SPIN-code: 9720-5812
PhD (Biol.), Leading Researcher at the Laboratory of Vector Vaccines
Russian Federation, Saint Petersburg; NovosibirskAndrey B. Komissarov
Smorodintsev Research Institute of Influenza; Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of SB RAS
Email: a.b.komissarov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1733-1255
SPIN-code: 3792-8290
PhD (Biol.), Head of the Laboratory of Molecular Virology
Russian Federation, Saint Petersburg; NovosibirskNataliya V. Eshchenko
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of SB RAS
Email: eschenko96@gmail.com
Researcher at the Laboratory of Genomic Editing
Russian Federation, NovosibirskGrigoriy A. Stepanov
Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of SB RAS
Email: stepanovga@niboch.nsc.ru
ORCID iD: 0000-0003-3393-3192
SPIN-code: 8587-2044
PhD (Chem.), Senior Researcher, Head of the Laboratory of Genomic Editing
Russian Federation, NovosibirskReferences
- Feeley EM, Sims JS, John SP, et al. IFITM3 inhibits influenza A virus infection by preventing cytosolic entry. PLoS Pathog. 2011;7(10):e1002337. doi: 10.1371/journal.ppat.1002337
- Lin TYu, Chin CR, Everitt AR, et al. Amphotericin B increases influenza A virus infection by preventing IFITM3-mediated restriction. Cell Rep. 2013;5(4):895–908. doi: 10.1016/j.celrep.2013.10.033
- Stepanov GA, Sergeeva MV, Mozhaeva AE, et al. Sozdanie i izuchenie kletochnykh linii s CRISPR/Cas9-napravlennym nokautom individual’nykh genov dlya povyshennoi produktsii virusa grippa. Proceedings of The Vserossiiskaya mul’tikonferentsiya s mezhdunarodnym uchastiem “Biotekhnologiya – meditsine budushchego”; 2019 2 June – 2 July; Novosibirsk. Novosibirsk; 2019. P. 215. (In Russ.)