Impact of amino acid substitution T203I in hemagglutinin on growth characteristics in vitro and hemagglutinin thermostability of A/H3N2 influenza viruses

Ekaterina A. Bazhenova; Баженова Екатерина Андреевна; Ekaterina A. Stepanova; Степанова Екатерина Алексеевна; Tatiana S. Kotomina; Котомина Татьяна Сергеевна; Nataliya V. Larionova; Ларионова Наталья Валентиновна; Irina V. Kiseleva; Киселева Ирина Васильевна; Larisa G. Rudenko; Руденко Лариса Георгиевна

doi:10.17816/MAJ77767

Влияние аминокислотной замены T203I в гемагглютинине на биологические свойства вирусов гриппа A/H3N2

Авторы: Баженова Е.А.¹, Степанова Е.А.¹, Котомина Т.С.¹, Ларионова Н.В.¹, Киселева И.В.¹, Руденко Л.Г.¹
Учреждения:
1. Институт экспериментальной медицины
Выпуск: Том 21, № 3 (2021)
Страницы: 85-90
Раздел: Материалы конференции
Статья опубликована: 06.12.2021
URL: https://journals.eco-vector.com/MAJ/article/view/77767
DOI: https://doi.org/10.17816/MAJ77767
ID: 77767

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Обоснование. Современная живая гриппозная вакцина содержит вакцинные штаммы на основе актуальных эпидемических вирусов гриппа подтипов А/H1N1, A/H3N2 и B. Вирусы гриппа A/H3N2 наиболее сильно подвержены дрейфовым антигенным изменениям, в связи чем данный компонент живой гриппозной вакцины необходимо постоянно обновлять. Вакцинные штаммы живой гриппозной вакцины получают методом классической реассортации донора аттенуации и эпидемического вируса в развивающихся куриных эмбрионах. В процессе подготовки вакцинных штаммов живой гриппозной вакцины отдельные реассортанты могут приобрести различные яично-адаптационные аминокислотные замены в гемагглютинине и нейраминидазе, что может повлиять на биологические свойства вакцинного штамма и тем самым снизить его эффективность в составе живой гриппозной вакцины.

Цель — изучение влияние аминокислотной замены T203I в гемагглютинине на термостабильность гемагглютинина и ростовые характеристики штаммов A/H3N2.

Материалы и методы. Для исследования были подготовлены три пары вакцинных реассортантов сероподтипа A/H3N2, различающиеся по аминокислотной позиции 203 (Thr/Ile) в гемагглютинине. Ростовые свойства вакцинных штаммов исследовали путем культивирования реассортантов в развивающихся куриных эмбрионах при температурах 26–40 °С и в культуре клеток MDCK при 33 °С. Термостабильность гемагглютинина исследуемых вирусов гриппа оценивали путем определения их способности к агглютинации 1 % куриных эритроцитов после воздействия повышенных температур в диапазоне 37–70 °С.

Результаты. Приобретенная в процессе подготовки вакцинных штаммов аминокислотная замена T203I в гемагглютинине не влияет на температурочувствительность вирусов, увеличивает способность штаммов к росту при пониженных температурах. Кроме того, такие штаммы обладают более высокой репродуктивной активностью в культуре клеток MDCK по сравнению со штаммами без данной мутации. Выявлено, что гемагглютинин реассортантов с Ile в позиции 203 значительно более термостабилен, чем с Thr 203.

Заключение. Полученные нами данные свидетельствуют, что аминокислотная замена T203I в гемагглютинине у современных вирусов гриппа A/H3N2 улучшает ростовые характеристики in ovo и в культуре клеток MDCK, а также повышает термостабильность гемагглютинина вирусов.

Ключевые слова

вирус гриппа, живая гриппозная вакцина, реассортация, обратная генетика, биологические свойства, аминокислотная замена T203I

Полный текст

Обоснование

Грипп — острое вирусное респираторное заболевание, характеризуемое высокой заболеваемостью и смертностью среди населения, что определяет его высокую социально-экономическую значимость для здравоохранения. Ежегодно вирусы гриппа вызывают эпидемии, а раз в 10–40 лет — пандемии, что связано с высокой антигенной изменчивостью вируса. Наиболее эффективным средством защиты против гриппа является вакцинопрофилактика инактивированными и живыми вакцинами. Ежегодно Всемирная организация здравоохранения дает рекомендации по составу гриппозных вакцин на Южное и Северное полушарие. Наиболее часто модифицируемый компонент гриппозных вакцин — компонент А/H3N2, это связано с его очень высокой антигенной изменчивостью. В последние годы замечено, что достаточно часто у вакцинных штаммов, принадлежащих серотипу А/H3N2, в процессе подготовки реассортантов появляется аминокислотная замена в позиции 203.

Цель нашей работы — изучение влияния данной аминокислотной замены на такие важные для вакцинных штаммов характеристики, как их ростовые свойства и степень термостабильности гемагглютинина.

Материалы и методы

Штаммы вируса гриппа

В работе были использованы три штамма сезонных вирусов гриппа А/Н3N2 (A/Brisbane/190/2017, A/Switzerland/8060/2017, A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016) и шесть реассортантов на основе донора аттенуации живой гриппозной вакцины (ЖГВ) А/Ленинград/17/134/57 и данных вирусов (табл. 1). Реассортанты отличались между собой аминокислотной позицией 203 в гемагглютинине (Thr/Ile). Два из них вошли в состав ЖГВ на 2015/2016, 2016/2017, 2017/2018 эпидемические по гриппу сезоны.

Таблица 1 / Table 1

Реассортанты вирусов гриппа А/Н3N2 и А/Ленинград/17/134/57, использованные в исследовании

Reassortants obtained on the basis of influenza viruses A/H3N2 and A/Leningrad/17/134/57 used in the study

Вирус-родитель	Реассортант	203	Метод получения
A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016	Sing/3571	Ile	КР
A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016	Sing/12	Thr	ОГ
A/Brisbane/190/2017	Br/7178	Ile	КР
A/Brisbane/190/2017	Br/825	Thr	ОГ
A/Switzerland/8060/2017	Swit/51203	Ile	КР
A/Switzerland/8060/2017	Swit/51	Thr	КР

Примечание. КР — классическая реассортация; ОГ — обратная генетика.

Вирусы культивировали в 10–11-дневных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Реассортанты получали методом классической реассортации в РКЭ по стандартной методике [1]. Реассортанты с вакцинной формулой генома отбирали методами ПЦР и последующего секвенирования генов. Реассортанты методом обратной генетики получали по протоколу, описанному в работе И.Н. Исаковой-Сивак и соавт. [2]. Гены гемагглютинина и нейраминидазы из материала эпидемических вирусов клонировали в вектор для обратной генетики вируса гриппа (pCIPolISapIT) по сайтам рестрикции SapI, затем проводили сборку вирусов гриппа по методике [2] методом электропорации клеток Vero набором из 8 плазмид, кодирующих гены вирусов гриппа. Генетическую последовательность подтверждали с помощью секвенирования по методу Сэнгера [3] с использованием автоматического капиллярного ДНК-секвенатора 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя.

Активность репродукции вирусов гриппа в РКЭ при разных температурах оценивали по результатам их титрования в РКЭ при пермиссивной (33 °С), повышенной (40 °С, ts-фенотип) и пониженной (26 °С, сa-фенотип) температуре инкубации. Ростовые характеристики вакцинных вирусов гриппа оценивали в культуре клеток MDCK при температуре 33 °С в атмосфере 5 % CO₂ в течение 3 сут. Инфекционную активность рассчитывали по методу Рида и Менча [4] и выражали в lg ЭИД₅₀/мл (ЭИД₅₀ — средняя эмбриональная инфекционная доза) либо в lg ТЦИД₅₀/мл (ТЦИД₅₀ — доза, ингибирующая репродукцию вируса на 50 %).

Степень термостабильности гемагглютинина определяли по потере гемагглютинирующей активности после воздействия неоптимальных температур. Методика аналогична описанной С. Scholtissek [5]. Вируссодержащий материал для проведения реакции предварительно был разведен фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,4) в соотношении 1 : 5 и прогрет в течение 20 мин при температуре 37–70 °С. Далее определяли титр вируса в реакции гемагглютинации с 1 % куриными эритроцитами.

Статистический анализ данных производили с использованием GraphPad Prism v.7.

Результаты исследования

Оценка ростовых и фенотипических свойств реассортантов

Инфекционный титр всех исследованных вирусов в РКЭ при оптимальной температуре (33 °С) был выше 7,5 lg ЭИД₅₀/мл. Все исследованные реассортанты обладали ts- и ca-фенотипами в РКЭ. Таким образом, независимо от аминокислоты в 203-й позиции, ростовые и фенотипические свойства всех реассортантов соответствовали требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам. Статистически достоверных отличий между титрами вирусов, содержащих и не содержащих замену T203I в гемагглютинине, обнаружено не было (непараметрический критерий Вилкоксона для парных сравнений, р = 0,50 для титров при 33 °С, p = 0,25 для титров при 26 °С, p = 0,25 для титров в культуре клеток MDCK). Тем не менее можно отметить тенденцию к большей выраженности холодоадаптированных свойств у реассортантов с аминокислотной заменой T203I в гемагглютинине, а также несколько более высокую репродуктивную активность в культуре клеток MDCK (табл. 2).

Таблица 2 / Table 2

Оценка фенотипических свойств изученных реассортантов в развивающихся куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK

Assessment of the phenotypic properties of the studied reassortants in egg and MDCK cell culture

Название вируса	Титр в РКЭ, lg ЭИД₅₀/мл			RCT в РКЭ, lg ЭИД₅₀/мл		Фенотип	Титр в MDCK, lg ТЦИД₅₀/ мл
Название вируса	33 °С	40 °С	26 °С	40 °С	26 °С	Фенотип	Титр в MDCK, lg ТЦИД₅₀/ мл
Br/7178 (203I)	8,4	≤1,2	5,7	≥7,2	2,7	ts, ca	6,0
Br/825 (203T)	7,7	≤1,2	4,2	≥6,5	3,5	ts, ca	3,1
Swit/51203 (203I)	8,2	≤1,2	5,7	≥7,0	2,5	ts, ca	6,8
Swit/51 (203T)	8,5	≤1,2	5,0	≥7,3	3,5	ts, ca	5,6
Sing/3571 (203I)	8,5	≤1,2	6,0	≥7,3	2,5	ts, ca	6,4
Sing/12 (203T)	7,9	≤1,2	4,7	≥6,7	3,2	ts, ca	4,9

Примечание. RCT — разность репродуктивной активности при оптимальной температуре и при пониженной до 26 °С либо повышенной до 40 °C температуре инкубации; РКЭ — развивающиеся куриные эмбрионы; ЭИД₅₀ — средняя эмбриональная инфекционная доза; ТЦИД₅₀ — доза, ингибирующая репродукцию вируса на 50 %.

Оценка термостабильности гемагглютинина

Реассортанты, у которых аминокислотная последовательность гемагглютинина полностью совпадала с таковой эпидемического родителя (203T), наследовали ту же степень термостабильности, что и вирус, на основе которого они были получены. Как видно из табл. 3, вирусы гриппа A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 и А/Switzerland/8060/2017, а также реассортанты Sing/12 и Swit/51, полученные на их основе, в гемагглютинине которых не было яично-адаптационной замены T203I, характеризовались низкой степенью термостабильности и теряли агглютинирующую активность уже при 54 и 50 °С соответственно. Реассортанты же Sing/3571 и Swit/51203, в гемагглютинине которых была аминокислотная замена T203I, обладали значительно более высоким уровнем термостабильности; они теряли агглютинирующую активность только при 60 и 58 °С соответственно. Вирус гриппа А/Brisbane/190/2017, популяция которого исходно уже содержала яично-адаптационную замену T203I, и реассортант Br/7178, полученный на его основе, характеризовались высокой степенью термостабильности и теряли агглютинирующую активность при 58 °С. Реассортант Br/825 (203T) обладал достаточно низким уровнем термостабильности и терял агглютинирующую активность уже при 50 °С.

Таблица 3 / Table 3

Анализ термостабильности эпидемических вирусов гриппа А/H3N2 и реассортантов, полученных на их основе, отличающихся между собой аминокислотной заменой T203I в гемагглютинине

Analysis of the thermostability of epidemic influenza A/H3N2 viruses and reassortants obtained on their basis, differing in amino acid substitution T203I in hemagglutinin

Название вируса	Титр в реакции гемагглютинации
Название вируса	37 °С	50 °С	54 °С	56 °С	58 °С	60 °С	65 °С	70 °С
A/Br/190/2017* (203I)	640	640	640	640	320	<5	<5	<5
Br/7178 (203I)	640	640	1280	1280	160	<5	<5	<5
Br/825^#(203T)	160	160	<5	<5	<5	<5	<5	<5
A/Swit/8060/2017 (203T)	320	320	<5	<5	<5	<5	<5	<5
Swit/51 (203T)	320	320	<5	<5	<5	<5	<5	<5
Swit/51203 (203I)	640	640	640	640	80	<5	<5	<5
A/Sing/INFIMH-16-009/2016 (203T)	1280	640	160	<5	<5	<5	<5	<5
Sing/3571 (203I)	640	640	640	640	640	40	<5	<5
Sing/12 (203T)	320	320	160	<5	<5	<5	<5	<5

* Данный пассаж дикого вируса содержал аминокислотную замену T203I в гемагглютинине. ^# Данный реассортант получен на основе дикого вируса A/Br/190/2017, пассаж которого не содержал аминокислотную замену T203I в гемагглютинине.

Обсуждение

Вирусы гриппа H3N2 — наиболее часто заменяемый компонент противогриппозных вакцин, при этом за счет высокой специфичности к рецепторам Siaá2-6Gal вирусы данного подтипа часто приобретают яично-адаптационные замены. Мы установили, что несколько сезонов подряд в процессе подготовки вакцинных штаммов на основе современных вирусов гриппа A/H3N2 реассортанты приобретали в процессе пассирования в РКЭ аминокислотную замену T203I в гемагглютинине. Данных о влиянии этой замены на отдельные биологические свойства современных вирусов гриппа A/H3N2 в литературе представлено мало. Поскольку любая аминокислотная замена в гемагглютинине может негативно отразиться на эффективности вакцины, необходимо детальное изучение свойств штаммов в экспериментальных условиях.

Мы исследовали ростовые характеристики штаммов, отличающихся одной позицией в гемагглютинине, в РКЭ (основной субстрат для подготовки ЖГВ) и культуре клеток млекопитающих. Кроме того, мы тестировали термостабильность гемагглютинина этих штаммов, поскольку данная характеристика является специфическим маркером, коррелирующим с трансмиссивностью, вирулентностью и рецепторной специфичностью штаммов, их иммуногенностью и стабильностью вакцинного препарата [5–7].

Полученные нами данные о репродукции штаммов вируса гриппа в РКЭ свидетельствуют, что все исследуемые реассортанты обладали фенотипическими свойствами, необходимыми вакцинному штамму, то есть имели ts- и ca-фенотип. Однако у реассортантов с аминокислотной заменой T203I были более выражены холодоадаптированные свойства, что очень важно для репродукции вируса во входных воротах инфекции. Таким образом, при выборе вакцинного кандидата они выглядят предпочтительнее. Кроме того, замена T203I не приводила к снижению способности к репликации в культуре клеток млекопитающих, что также является важным свойством для ЖГВ.

Термостабильность штаммов гемагглютинина с Ile в позиции 203 также была выше. В работе F. Wen и соавт. [8] замена, увеличивающая термостабильность, приводила и к более высокой иммуногенности. Исходя из полученных нами результатов исследования термостабильности штаммов гемагглютинина можно ожидать, что реассортанты 203I будут более иммуногенны по сравнению со штаммами 203T, поскольку проявляют более выраженные термостабильные эффекты.

Выводы

Полученные нами данные свидетельствуют, что аминокислотная замена T203I в гемагглютинине у современных вирусов гриппа A/H3N2 не оказывает негативного влияния на ростовые характеристики в РКЭ и культуре клеток MDCK, а наоборот, увеличивает способность штаммов к росту при пониженной температуре и термостабильность гемагглютинина вирусов. В связи с этим при отборе вакцинных кандидатов предпочтительнее реассортанты с яично-адаптационной заменой T203I в гемагглютинине.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках плановой темы НИР отдела вирусологии ФГБНУ «ИЭМ».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.