Chitin/chitosan: bioresources, applications field, production technologies

Full Text

ГЛОССАРИЙ

Биомукоадгезивность – физико-химическое сродство к мукополисахаридам соединительной ткани.

Клеточная стенка – твердая полупроницаемая оболочка клетки растений и грибов, образованная полисахаридными микрофибриллами, погруженными в аморфный белковый/глюкановый матрикс.

Микрокапсулы – капсулы размером от 1 мкм до 2 мм шарообразной или неправильной формы, состоящие из тонкой оболочки из полимерного или другого материала и содержащие твердые или жидкие активные действующие вещества с добавлением или без добавления вспомогательных веществ.

Надмембранные образования – протективные структуры, образующиеся над клеточной мембраной растений, грибов, протистов (гликокаликс, лорика, клеточная стенка).

Нанокапсулы – наночастицы размером до 1 мкм, состоящие из полимерной, липидной или другой оболочки, окружающей их внутреннюю полость или содержимое.

Остеокондуктивность – способность материала к адгезии и связыванию остеогенных клеток, поддержанию процессов их пролиферации и дифференцировки. Происходит образование непосредственной связи с костной тканью и постепенное ее замещение новообразующейся.

Пролонгированные лекарственные формы – лекарственные формы с модифицированным высвобождением, обеспечивающие увеличение продолжительности действия лекарственного вещества путем замедления его высвобождения.

Скаффолды – клеточные матрицы, вводимые в организм с целью регенерации костей.

Таргетная доставка лекарств – направленный транспорт лекарственного вещества в заданную область организма, органа или клетки.

Экзоскелет – совокупность плотных участков (склеритов) кутикулы членистоногих. Соединены между собой эластичными мембранами, обеспечивающими взаимную подвижность склеритов. Выполняют защитную функцию, предохраняя от механических повреждений, и служат скелетными элементами, к которым крепятся мышцы. Обычно каждый свободный сегмент тела членистоногого покрывают 4 склерита: тергит (спинная сторона тела), стернит (брюшная) и два плейрита (боковые стороны).

SAR – супергруппа эукариот, объединяющая Stramenopila, Alveolata, Rhizaria.

ВВЕДЕНИЕ

Хитозан – уникальный линейный полисахарид, содержащий остатки D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина и обладающий ценными биологическими свойствами. Он является продуктом деацетилирования хитина – одного из наиболее распространенных природных полисахаридов после целлюлозы. Хитин и хитозан играют ключевую роль в поддержании структурной целостности и защиты организмов, в которых они присутствуют. Благодаря таким качествам как биосовместимость, биоразлагаемость, нетоксичность, а также антибактериальная, противогрибковая и антиоксидантная активность, хитозан рассматривается как перспективный материал для применения в биомедицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях [1].

Традиционно хитозан получают из хитина, присутствующего в панцире ракообразных [2], хотя грибы – как низшие (Chytridiomycota) [3], так и высшие (Ascomycota, Basidiomycota) являются перспективным сырьем для его получения, поскольку как хитин, так и непосредственно хитозан, являются компонентами их клеточной стенки – последний образуется в результате частичного деацетилирования хитина ферментами хитин-деацетилазами, продуцируемыми грибами в процессе роста и развития [4, 5].

Членистоногие, такие как панцирные ракообразные, насекомые и паукообразные, содержат в экзоскелете значительные количества хитина. Этот компонент, наряду с белками и минеральными солями, придает экзоскелету прочность, жесткость и гибкость, защищая организм от механических повреждений и неблагоприятных условий [6]. Кроме того, хитин участвует в процессах линьки, роста и развития членистоногих. Широкое распространение хитина и хитозана в природе, а также уникальные физико-химические и биологические свойства хитозана являются причиной возрастающего интереса к использованию последнего в целом ряде отраслей фармацевтической промышленности [7].

Хитозан обладает гемостатическими, антимикробными и ранозаживляющими свойствами, что делает его перспективным компонентом для разработки раневых покрытий и перевязочных материалов [8]. Исследования показали, что пленки, гидрогели и губки на основе хитозана ускоряют заживление ран различной этиологии, в том числе ожоговых, диабетических и хронических язв. Более того, хитозан может быть модифицирован для усиления антимикробной активности и управления высвобождением лекарственных средств.

Обладая выраженной биомукоадгезивностью и способностью к контролируемому высвобождению, хитозан широко используются в качестве носителя для доставки различных терапевтических агентов, таких как противоопухолевые препараты, антибиотики, протеины, нуклеиновые кислоты и др. Хитозановые наночастицы, микро- и нанокапсулы, а также гидрогели могут быть разработаны для таргетной доставки лекарств в специфические органы и ткани [9].

Хитозан проявляет высокую биосовместимость и способность стимулировать пролиферацию клеток, что делает его привлекательным биоматериалом для применения в тканевой инженерии и регенеративной медицине, в частности, для создания скаффолдов для восстановления костной, хрящевой, кожной и других тканей [10]. Биоактивные молекулы, такие как факторы роста, могут быть инкорпорированы в хитозановые матрицы для управления клеточным ответом и ускорения процессов регенерации [11].

Хитозан обладает выраженными противомикробными свойствами в отношении широкого спектра патогенных бактерий, вирусов и грибов. Механизмы его антимикробного действия включают нарушение клеточных мембран, ингибирование ферментативной активности и связывание с генетическим материалом [12]. Кроме того, хитозан способен модулировать иммунный ответ организма, проявляя противовоспалительные свойства [13].

Таким образом, актуальной задачей биотехнологии является поиск способов удешевления производства хитина/хитозана и биотехнологическое тестирование альтернативных биоресурсов.

Целью настоящего обзора является привлечение внимания биотехнологов к хитину/хитозану как биополимерам, перспективным в биомедицинских разработках, оценка потенциала его практического использования и обобщение информации по традиционным и инновационным технологиям их получения и очистки.

ХИМИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ХИТИНА И ХИТОЗАНА

Хитин и хитозан (рис. 1) являются структурно родственными полисахаридами, различающимися сте пенью ацетилирования цепи. Хитин представляет собой линейный полимер β-(1→4)-связанных N-ацетилглюкозаминовых остатков, в то время как хитозан состоит из N-ацетилглюкозаминовых и глюкозаминовых звеньев, полученных в результате частичного или полного деацетилирования хитина [15, 16].

 

Рис. 1. Структура мономера хитина (сверху) и хитозана (снизу)

 

Хитин – один из наиболее распространенных природных полимеров после целлюлозы. Он является структурным компонентом клеточных стенок грибов и экзоскелетов членистоногих, таких как ракообразные и насекомые [17, 18]. Хитин обладает высокой химической и биологической стабильностью, устойчивостью к нагреванию, кислотам и щелочам. Однако из-за своей инертности и нерастворимости в воде и большинстве органических растворителей, хитин имеет ограниченные возможности практического применения [19].

В отличие от хитина, хитозан является более функциональным биополимером. Хитозан растворим в разбавленных кислотах благодаря наличию аминогрупп в глюкозаминовых звеньях, обуславливающих его катионные свойства [20, 21]. Степень деацетилирования хитина, определяющая содержание ацетильных групп, является важнейшей характеристикой хитозана, напрямую влияющей на его физико-химические и биологические свойства. Хитозан обладает такими ценными свойствами, как биосовместимость, биодеградируемость, адгезивность, антибактериальная активность. Благодаря этому он находит широкое применение в различных областях, включая медицину, фармацевтику, пищевую промышленность [22, 23].

Для практического использования хитозан является предпочтительным по сравнению с хитином биополимером, поскольку обладает более высокой химической активностью и разнообразными функциональными возможностями. Дальнейшее изучение и модификация структуры и свойств хитозана способствует расширению его применения в различных сферах.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ХИТИНА И ХИТОЗАНА

В медицине и фармацевтике хитин и хитозан используются для создания биоматериалов, систем доставки лекарств, антимикробных и регенеративных средств. В пищевой промышленности они выступают в качестве пищевых добавок, упаковочных материалов и адсорбентов для очистки продуктов.

Применение хитозана в медицине

Заживление ран и регенерация тканей. Хитозан обладает гемостатическими свойствами и способствует ускоренному заживлению ран за счет стимуляции пролиферации клеток и ангиогенеза [24, 25]. Хитозановые гидрогели, губки и повязки используются для лечения различных типов ран, в том числе хронических и инфицированных [26, 27]. Кроме того, хитозан применяется в качестве биополимерной основы для создания искусственных кожных покровов [28, 29].

Система доставки лекарственных средств. Хитозановые наночастицы и микрочастицы используются для создания пролонгированных и таргетных лекарственных форм [30, 31]. Благодаря своим мукоадгезивным свойствам, хитозан способствует повышению биодоступности различных лекарственных препаратов, в том числе белков, пептидов и нуклеиновых кислот [32, 33]. Кроме того, хитозан проявляет адъювантные свойства, что позволяет использовать его в составе вакцин для усиления иммунного ответа [34, 35].

Замещение костной ткани. Композиты на основе хитина/хитозана применяются в качестве биоматериалов для костной пластики благодаря их схожести с природным костным матриксом и остеокондуктивности, способности стимулировать остеогенез [36]. Такие материалы используются для заполнения костных дефектов, восстановления кости после травм и в ортопедической хирургии [37, 38].

Контроль инфекций. Хитин и хитозан проявляют антибактериальную, противогрибковую и противовирусную активность, что определяет их применение в качестве антимикробных агентов [39, 40]. Механизм действия этих биополимеров включает нарушение целостности клеточных мембран, хелатирование ионов и другие эффекты [41].

Фармацевтические препараты на основе хитина/хитозана

Вспомогательные вещества в лекарственных формах. Хитозан применяется в качестве связующего вещества, разрыхлителя, суспендирующего агента, разбухающего наполнителя и т. д. в составе таблеток, капсул, гранул, суспензий и других фармацевтических препаратов [42]. Использование хитозана в лекарственных средствах позволяет улучшить их биодоступность, стабильность и высвобождение активных ингредиентов.

Носители для доставки биологически активных соединений. Хитозановые микро- и наноструктуры используются для транспортировки лекарств, вакцин, пептидов и нуклеиновых кислот [43]. Данные биополимерные системы обеспечивают защиту доставляемых веществ от преждевременной деградации, целевую доставку в ткани-мишени и контролируемое высвобождение. Например, хитозановые наночастицы успешно применяются для доставки противоопухолевых препаратов, инсулина, антигенов и малых интерферирующих РНК [44, 45].

Активные фармацевтические ингредиенты. Хитозан проявляет противовоспалительные, антиоксидантные, гипохолестеринемические, антидиабетические и другие полезные фармакологические эффекты [46]. Благодаря этому хитозан и его производные могут использоваться в качестве биологически активных компонентов различных лекарственных препаратов, в том числе для лечения сердечно-сосудистых, обменных и других заболеваний.

Применение хитина/хитозана в пищевой промышленности

Пищевые добавки и ингредиенты. Хитозан применяется в качестве загустителя, стабилизатора, эмульгатора, связующего, влагоудерживающего агента и других функциональных пищевых ингредиентов [47]. Использование хитозана в составе пищевых продуктов позволяет улучшить их реологические, органолептические и технологические свойства. Кроме того, хитозан обладает гипохолестеринемическими, антиоксидантными и другими полезными для здоровья человека свойствами [48, 49].

Упаковочные материалы. Хитозановые пленки и покрытия используются для создания съедобной и биоразлагаемой упаковки пищевых продуктов [48, 49]. Такие материалы обеспечивают защиту от микробной порчи, снижение газопроницаемости, повышение влагоустойчивости и продление сроков хранения продуктов [50, 51].

Адсорбенты для очистки пищевых продуктов. Хитин и хитозан способны связывать тяжелые металлы, микотоксины, пестициды и другие загрязнители, что позволяет использовать их для очистки и детоксикации пищевых продуктов [52, 53]. Кроме того, антибактериальные свойства этих биополимеров делают их эффективными для обеззараживания пищевого сырья и готовой продукции [54, 55].

Как видно из представленного анализа, хитозан и композиты, условно именуемые «хитин/хитозан», находят широкое применение в медицине, фармацевтической и пищевой промышленности благодаря своим уникальным физико-химическим и биологическим свойствам. Данные биополимеры используются в качестве биоматериалов, систем доставки лекарств, пищевых добавок, упаковочных материалов и адсорбентов. Дальнейшее изучение и разработка новых применений хитина и хитозана является перспективным направлением современных исследований.

ИСТОРИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИЗУЧЕНИЯ ХИТИНА И ХИТОЗАНА

Традиционно хитин и хитозан получают из панцирей ракообразных. История изучения хитина восходит к концу XVIII в., а именно работе английского химика Чарльза Хэтчетта, который на основе своих экспериментов на панцирях морских животных сообщил в 1799 г. о наличии в кутикуле «материала, особенно устойчивого к обычному химическому воздействию» [56]. В 1811 г. французский химик А. Браконно после экстракции мицелиальной массы грибов водой, спиртом и разбавленной щелочью получил нерастворимый остаток, названный им фунгином (fungine) [57, 58]. Примечательно, что оба открытия произошли примерно за 30 лет до открытия растительной целлюлозы и при этом остались практически незамеченными научным сообществом. Термин «хитин» был предложен в 1823 г. французским биологом А. Одье, исследовавшим наружный скелет насекомых. Термин отсылает к греческому слову «хитон», означающему определенный тип античного одеяния [59].

История хитозана, основного производного хитина, восходит к 1859 г., а именно к работе Ш. Руже, который сообщил, что обработка хитина концентрированным раствором едкого кали под обратным холодильником дала новый «модифицированный хитин», растворимый в органических кислотах. Однако само название «хитозан» было введено в 1894 г. Ф. Гоппе-Зейлером для кислоторастворимого производного хитина, полученного после обработки панциря крабов, скорпионов и пауков [60].

На протяжении XX в. ученые активно исследовали физико-химические свойства этих биополимеров, их химическую структуру и возможности практического применения. Первоначально хитин и хитозан находили ограниченное использование в медицине и косметологии. Однако в последующие десятилетия спектр их применения значительно расширился, охватив такие отрасли, как фармацевтическая и пищевая промышленность, сельское хозяйство и технологии очистки воды.

Сегодня хитин и хитозан рассматриваются как перспективные биоматериалы, имеющие большой биотехнологический потенциал. Ведутся исследования по поиску альтернативных источников этих биополимеров, а также по совершенствованию технологии их выделения, очистки и модификации. Накопленные за столетие знания позволяют прогнозировать все более широкое внедрение хитина/хитозана в различные отрасли промышленности и сферы человеческой деятельности.

В начале 1900-х гг. М. Хофер провел фундаментальные исследования по химии хитина из панцирей крабов и креветок. Он установил его структурную формулу [61]. В 1934 г. польский биохимик А. Мальчевский выделил из хитиновых образцов первый кристаллический образец хитозана [62].

В 1950-х гг. японские исследователи организовали промышленное производство хитина и хитозана из панцирей крабов и креветок в коммерческих масштабах [63].

Несмотря на то, что биополимер, известный сегодня как хитин, был довольно рано открыт у грибов, его отождествление с хитином членистоногих состоялась только в первой половине XX столетия.

В 1904 г. французский микробиолог А. С. Перрен [64] сообщил об обнаружении вещества, похожего на хитин, в клеточных стенках красного мухомора (Amanita muscaria). В 1926 г. бельгийский ботаник Ф. Карнуа [65] описал присутствие хитиноподобного полимера у различных видов грибов. Обширная статья Карнуа была опубликована в бельгийском научном журнале «La Cellule» на французском языке. На стр. 88–90 данной работы Карнуа ссылается на более раннее открытие А. С. Перрена 1904 года [66] и упоминает его исследование «хитиноподобного» вещества мухомора.

В 1931 г. немецкий химик А. Шмук [67] проанализировал состав клеточных стенок базидиомицетов и определил в них хитин и хитозан. Это была статья в авторитетном немецком научном журнале «Zeitschrift für physiologische Chemie».

В 1975 г. японские ученые [68] опубликовали статью, посвященную выделению и характеристике хитин-деацетилазы из плесневого гриба Mucor rouxii. Этот фермент катализирует реакцию деацетилирования хитина с образованием хитозана.

В России первые исследования, связанные с изучением свойств хитина, были проведены под руководством известного химика-органика П. П. Шорыгина в 1934–1935 гг. и включали реакции ацетилирования, нитрования и метилирования этого биополимера, хорошо изученные к тому времени на целлюлозе. Эти исследования показали, что хитин обладает очень низкой реакционной способностью: например, для получения монометилхитина требовалось провести 15 обработок. Работы в этих областях не были завершены и не привели к ясности относительно причин низкой реакционной способности хитина [69].

Процитированная и множество других работ послужили отправной точкой для многочисленных последующих исследований, посвященных разработке эффективных методов извлечения хитина/хитозана из ракообразных грибов, оптимизации параметров этих процессов, поиску нового перспективного сырья.

ОСНОВНЫЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ ХИТИНА/ХИТОЗАНА ИЗ ЧЛЕНИСТОНОГИХ

Основные методы очистки хитина

Изначально внимание биотехнологов было сосредоточено на животном хитине и базовые методы извлечения и очистки этого биополимера оформились именно на этом этапе.

Организация хитина в кутикуле членистоногих показана на рис. 2. Несмотря на сложность организации самой кутикулы, хитин в ней не связан ковалентно с другими линейными биополимерами и организован в нанофибриллы, образующие достаточно гомогенный матрикс. Лишь у морских ракообразных матрикс значительно обызвествлен.

 

Рис. 2. Обобщенная схема организации кутикулы членистоногих. Хитиновые нанофибриллы погружены в аморфный матрикс, образованный кутикулярными белками и иногда гранулами извести (по: [70])

 

Депротеинизация. Депротеинизация – удаление белковых веществ, присутствующих в хитиновом материале, обычно с помощью обработки щелочами (гидроксид натрия, гидроксид калия) и/или ферментативного гидролиза с помощью протеаз. Депротеинизация является важнейшим этапом экстракции и очистки хитина/хитозана [71, 72].

Для депротеинизации могут быть использованы различные методы, наиболее распространенными из которых являются щелочная обработка и ферментативный гидролиз. Щелочная депротеинизация обычно включает использование гидроксида натрия (NaOH) или гидроксида калия (KOH) для растворения и удаления белковых загрязнений [73]. Хитиновый материал подвергается воздействию среды с высоким уровнем рН, что разрушает белковые структуры и облегчает их отделение от хитина.

Альтернативный путь ферментативной депротеинизации предполагает использование протеазных ферментов для избирательного гидролиза белковых компонентов, оставляя структуру хитина незатронутой [74]. Такой подход может быть признан более щадящим по отношению к хитину и часто приводит к более высокому уровню чистоты продукта, но может занять больше времени и потребовать тщательной оптимизации условий.

Выбор метода депротеинизации, а также конкретные параметры (например, концентрация щелочи, продолжительность обработки, выбор фермента и время реакции) могут существенно повлиять на свойства и качество конечного продукта. Тщательный контроль этих факторов необходим для обеспечения эффективного удаления белков при минимизации любой потенциальной деградации или структурных изменений хитина [75].

Используя методы депротеинизации, исследователи и промышленные предприятия могут получать образцы хитина высокой чистоты, которые подходят для широкого спектра применения [76, 77].

Деминерализация. Удаление из хитинсодержащего материала минеральных солей является важным этапом в извлечении и очистке хитина. Это достигается, как правило, с помощью обработки сырья разбавленными растворами кислот, например, соляной (HCl) или уксусной (CH₃COOH) [78]. Минеральные соли, присутствующие в исходном сырье, в основном представлены карбонатами и фосфатами кальция. Обработка кислотными растворами способствует растворению и последующему удалению этих минеральных компонентов, оставляя хитиновую структуру относительно неповрежденной. Более поздние исследования показывают, что оптимизация условий деминерализации, таких как концентрация кислоты, температура и время обработки, имеет решающее значение для эффективного удаления минеральных солей при сохранении целостности базовой структуры хитина [79, 80]. Некоторые авторы также предлагают альтернативные методы деминерализации с использованием ионообменных смол или электрохимических процессов для достижения более мягких условий обработки [81, 82]. Выбор кислоты, ее концентрация и продолжительность обработки являются важными параметрами, которые влияют на эффективность деминерализации и сохранность хитина. Чрезмерно агрессивные условия могут привести к нежелательному гидролизу и деградации хитиновой цепи [83].

Таким образом, деминерализация с использованием разбавленных кислотных растворов представляет собой ключевой этап в выделении и очистке высококачественного хитина из природных источников, предшествующий другим стадиям, таким как деацетилирование и получение хитозана [84, 85].

Деацетилирование. Процесс частичного удаления ацетильных групп посредством обработки концентрированными (40–50%-ми) растворами щелочей при высоких температурах ведет к превращению хитина в хитозан. Деацетилирование хитина продолжает оставаться важным этапом в производстве хитозана [86–89].

Последние исследования фокусируются на оптимизации и совершенствовании условий деацетилирования для получения хитозана с желаемыми физико-химическими характеристиками и степенью деацетилирования [90, 91]. Некоторые авторы также предлагают альтернативные методы, такие как ферментативное деацетилирование или использование ионных жидкостей для достижения более мягких условий процесса [92–94].

Таким образом, деацетилирование по-прежнему является ключевым этапом в производстве хитозана и исследования в этой области направлены на оптимизацию и совершенствование данного процесса для получения материалов с улучшенными свойствами.

Очистка хитозана включает в себя удаление остаточных минеральных и белковых примесей, а также избытка щелочей фильтрацией, диализом или репреципитацией.

Основные методы очистки хитозана

Фильтрация. После деацетилирования хитина полученный хитозан растворяют в слабой кислоте (уксус ная, соляная). Далее раствор фильтруют для удаления нерастворимых примесей. Фильтрат может быть дополнительно очищен путем диализа или ультрафильтрации [95, 96].

Диализ. Этот процесс позволяет удалить низкомолекулярные примеси (минеральные соли, олигомеры). Раствор хитозана помещают в диализный мешок или трубку. Диализ проводят с использованием дистиллированной воды или слабого раствора кислоты [97].

Репреципитация. Раствор хитозана осаждают путем добавления щелочи до достижения pH 8–9. Полученный осадок отделяют фильтрацией или центрифугированием. Для удаления остатков щелочи осадок промывают дистиллированной водой [98, 99].

Для характеристики степени деацетилирования и чистоты хитозана на разных стадиях очистки применяли ИК-спектроскопию [100]. В некоторых случаях необходима модификация хитозана для получения водорастворимых производных [101].

Степень очистки хитозана влияет на его дальнейшее применение. Высокая степень очистки требуется для использования в фармацевтической промышленности, медицине, пищевой промышленности. Для технических применений допустим более низкий уровень очистки. В целом комбинация различных методов очистки (фильтрация, диализ, репреципитация) позволяет получить хитозан с высокой степенью чистоты и минимальным содержанием примесей.

Сушка хитозана. Этот процесс может проводиться различными способами, такими как лиофилизация (сублимационная сушка), распылительная сушка или сушка в сушильном шкафу. Степень деацетилирования и молекулярная масса получаемого хитозана зависят от условий процессов деминерализации, деацетилирования (температура, время, концентрация щелочи) и очистки.

ОСНОВНЫЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ ХИТИНА И ХИТОЗАНА ИЗ ГРИБОВ

Увеличение объемов производства культивируемых грибов сопровождается ростом побочных продуктов и отходов, доля которых составляет от 5 до 20% объема производства самих грибов [102]. Например, только производство шампиньонов (Agaricus bisporus) ежегодно приводит к образованию около 50 000 т отходов [103].

Эти отходы являются легко портящимся продуктом с высокой активностью собственных ферментов, включая тирозиназу, и представляют одну из экологических проблем для перерабатывающих предприятий [104], но в то же время являются потенциальным сырьем для получения биологически активных полисахаридов. Таким образом, ежегодный прирост объема грибных отходов подчеркивает необходимость разработки эффективных технологий выделения и очистки хитина и хитозана и их дальнейшего целевого использования [105].

Хитин составляет основу клеточной стенки грибов, в которой организован в форме микрофибрилл, связанных с молекулами β-глюканов (рис. 3).

 

Рис. 3. Первичная – четвертичная структура хитина в клеточной стенке грибов (по: [106])

 

Как видим, в грибной клетке хитин более плотно упакован в микрофибрилы в виде антипараллельных цепочек и, кроме того, хитиновые микрофибриллы связаны водородными, а иногда и ковалентными связями с разветвленными молекулами β-глюканов, образующих аморфный матрикс клеточной стенки. Соответственно извлечение чистого хитина/хитозана из клеточной стенки грибов по себестоимости дороже, чем из кутикулы членистоногих.

С другой стороны, грибной мицелий является более доступным источником хитина, поскольку его производство не ограничено сезонностью или узкими ареалами видов-продуцентов, как в случае панцирных ракообразных. Кроме того, грибной мицелий содержит более низкие уровни неорганических солей, что отчасти упрощает процесс, не требует агрессивных кислотных растворителей и приводит к меньшей стоимости утилизации отходов.

Физико-химические свойства хитина, полученного из различных источников, могут отличаться, что влияет на их практическое применение. Например, индукция иммунного ответа растений может быть более эффективной при использовании хитина, полученного из грибного мицелия.

В целом грибной мицелий представляет собой перспективный источник хитина с точки зрения доступности сырья, хотя извлекается в форме хитин-глюкановых комплексов, из которых далее извлечь чистый продукт без ухудшения его качества до сих пор проблематично. Так или иначе, методический арсенал извлечения хитина/хитозана из грибного сырья унаследовал базовые методы извлечения животного хитина, но также обогатился методами «зеленой химии» и промышленно-микробиологическими методами.

Традиционные химические методы

Химические методы извлечения хитина и хитозана из грибной биомассы сохраняют наиболее широкое распространение. Они включают те же стандартные стадии: 1) обработку сырья гидроокисью натрия или гидроокисью калия для удаления белков и органических кислот и солей; 2) деминерализацию с использованием разбавленных растворов соляной, азотной или уксусной кислоты для растворения неорганических веществ; 3) деацетилирование хитина концентрированными растворами щелочей при нагревании для получения хитозана.

Преимуществами химических методов являются высокий выход и степень чистоты конечного продукта. Однако они требуют применения агрессивных химических реагентов, длительного времени обработки, большого количества воды и энергозатрат [107].

Методы «зеленой химии»

Использование ферментов для получения хитозана считается более экологичным подходом. Обычно применяются ферменты для деполимеризации хитина, удаления белков (протеазы) и деминерализации (хитин-связывающие белки). Затем хитин обрабатывается химическими реагентами для деацетилирования.

Преимуществами являются мягкие условия реакции, более высокая степень чистоты продукта. Однако выход хитозана ниже, процесс более длительный и требующий использования дорогостоящих ферментных препаратов [108].

Промышленно-микробиологические методы

Данные методы основаны на использовании грибов или бактерий, способных продуцировать хитин/хитозан или хитинолитические ферменты. Наиболее изучены грибы родов Mucor, Rhizopus, Cunninghamella (Mucoromycota). Процесс включает культивирование этих микроорганизмов с накоплением хитиновых полимеров в биомассе и последующей химической или ферментативной обработкой.

Преимуществами этой группы методов являются отсутствие необходимости в деминерализации сырья, низкие энергозатраты, возможность получения олигомеров хитозана. Однако требуется оптимизация условий культивирования, выделения и очистки полимера [109].

Комбинированные методы

Для достижения более высокого выхода и степени очистки целевого продукта нередко сочетают традиционные химические и биологические методы наработки и извлечения хитина/хитозана. Например, предварительную биологическую ферментацию грибов с накоплением хитинсодержащей биомассы комбинируют с последующей химической обработкой растворами щелочей [110].

Каждый подход имеет свои достоинства и недостатки. Выбор метода зависит от цели применения хитозана, доступности сырья и оборудования, экономических и экологических факторов.

Хитин и хитозан, выделенные из грибного сырья, могут отличаться по молекулярной массе, степени ацетилирования и распределению заряженных групп по сравнению с аналогичными соединениями, полученными из ракообразных. Эти структурные различия могут влиять на функциональные свойства и биологическую активность грибных хитина и хитозана.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наличие хитина среди эукариот ограничивается в основном супергруппой Opisthokonta (животные, грибы), хотя отдельные представители Amoebozoa (энтамеба), Archaeplastida (красные водоросли) и SAR (оомицеты, охрофиты, динофлагелляты, церкозои, инфузории) содержат хитин как минорный компонент в своих надмембранных образованиях (111–113). Этот азотсодержащий биополимер более свойственен гетеротрофам, клетки которых пытаются различными способами избавиться от избытка азота.

Еще в начале XX в. основной компонент клеточной стенки грибов неохотно отождествляли с хитином, называя его на первых порах «хитиноподобным веществом». Соответственно, технология выделения хитина и хитозана отработана на животном сырье и, прежде всего, панцирях морских ракообразных.

В настоящее время себестоимость производства 1 кг хитозана из раковин креветок и крабов составляет около 50–120 $. В то же время, выделение сопоставимого количества хитозана из грибной биомассы оценивается в 100–150 $. С другой стороны, культивирование многих видов съедобных грибов является технологически более простым и экономически эффективным. Так, содержание хитина в ножках вешенки устричной (Pleurotus ostreatus) может достигать 19% (в пересчете на сухую массу) в процессе послеуборочного хранения. С учетом объемов грибных отходов, ежегодно накапливаемых производителями, существует потенциал для производства около 1000 тонн сырого грибного хитина в год в условиях США. Сырье вешенки представляет собой комплекс хитина и глюканов, который может быть использован в качестве биопестицида, регулятора роста растений и ценной кормовой добавки [114, 115]. Хитин-глюкановый комплекс не требует очистки и для производства БАДов иммуномодулирующего действия.

Это является основанием для оценки, согласно которой рентабельность производства хитина/хитозана из ракообразных и съедобных грибов находятся примерно на одном уровне. Себестоимость продукции из грибов может быть снижена за счет использования отходов сельскохозяйственного или лесного производства в качестве питательных субстратов. Это делает перспективным использование грибов в качестве источников хитина/хитозана в лесных регионах.

About the authors

Vladimir V. Perelygin

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: vladimir.pereligin@pharminnotech.com

Dr. Med. Sci., Professor, Head of the Industrial Ecology Department

Russian Federation, Saint Petersburg

Tatyana A. Nekrasova

MEDPROF Limited Liability Company

Email: Nekrasova555@mail.ru

PhD in Pharmacy

Russian Federation, Saint Petersburg

Mikhail V. Zharikov

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Email: zharikov.mihail@pharminnotech.com

Senior laboratory assistant at the Department of Industrial Ecology

Russian Federation, Saint Petersburg

Anna O. Werner

Saint Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University

Author for correspondence.
Email: verner.anna@spcpu.ru

Undergraduate Student, the Industrial Ecology Department

Russian Federation, Saint Petersburg

Ivan V. Zmitrovich

Komarov Botanical Institute of the Russian Academy of Sciences

Email: iv_zmitrovich@mail.ru

D.Sc. in Biology, Leading Researcher, Laboratory of Systematics and Geography of the Fungi

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files