Effects of high doses of ouabain on cardiac, respiratory, and motor activity at newborn rats

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

В серии уже проведенных исследований мы установили, что на ранних стадиях постнатального развития повышение уровня холинергической активации, вызванное стимуляцией центральных Н-холинергических структур или путем ингибирования ацетилхолинэстеразы фосфаколом или эзерином, приводит к возникновению атипичного сердечного ритма. Этот ритм представляет собой чередование периодов нормального или слабого брадикардического ритма с периодами выраженной брадикардии, а в определенных случаях и полной асистолии. Период следования таких комплексов может варьировать от полутора десятков секунд до 1–2 мин [1–5].

Мы предположили, что в генерации атипичного сердечного ритма могут принимать участие флуктуации кальциевых токов через специфические ионные каналы кардиомиоцитов. Известно, что нарушения ритма часто связаны с нарушениями работы рианодиновых рецепторов (RyR). Мы провели исследования и установили, что наблюдаемый нами при различных фармакологических воздействиях атипичный сердечный ритм не связан с нарушениями работы медленных кальциевых каналов L-типа или рианидин-зависимых кальциевых каналов. Кроме того, предварительная активация или ингибирование указанных ионных каналов не препятствует появлению патологического сердечного ритма после инъекции животным ингибиторов холинэстеразы [6, 7].

Известно, что ингибирование Na⁺-K⁺-АТФазы сердечными гликозидами может вызывать серьезные аритмии. Уабаин является кардиотоническим гликозидом, выделяемым надпочечниками и гипоталамусом. Связывание уабаина с его рецептором, Na⁺/K⁺-АТФазой, ингибирует АТФазную активность и инициирует несколько клеточных сигнальных путей [8]. В субтоксических и токсических дозах уабаин стимулирует образование гетеротропных импульсов вследствие снижения порога возбудимости и понижает частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Цель настоящего исследования — выяснить, может ли введение токсических доз уабаина спровоцировать возникновение атипичного сердечного ритма у новорожденных крысят.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на 105 крысятах линии Вистар 3- и 16-дневного возраста (Р3 и Р16). В каждой экспериментальной группе было по 16–19 животных. Исследования проводили в острых опытах в соответствии с правилами, рекомендованными Физиологической секцией Российского национального комитета по биологической этике.

Все эксперименты были выполнены в соответствии с правилами, указанными в Директиве Европейского сообщества (2010/63/ЕС), Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным (редакция 2000 г.), Женевской конвенцией «International Guiding Principals for Biomedical Involving Animals» (Geneva, 1990) и с одобрения комитета по этике Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова.

Животных помещали в экранированную камеру с температурой 26 ± 0,5 °C. Температуру контролировали с помощью цифрового термометра RST-02100 (RST, Швеция). Физиологические показатели регистрировали на ненаркотизированных крысятах в условиях мягкой фиксации животных. Исследование начинали через 15 мин после адаптации крысенка к окружающей среде. Исследовали электрокардиограмму (ЭКГ), показатели внешнего дыхания, электромиографию (ЭМГ) мышц задней лапы (икроножной мышцы). В целях снижения уровня артефактов, при регистрации ЭКГ у 3-дневных крысят применяли нестандартное отведение от теменной части головы и крестцовой области, у 16-дневных — II стандартное отведение. Расчет коэффициента сердечной аритмии (К_a) осуществляли по формуле: К_a = (RR_max – RR_min) / RR_mean. Для анализа частоты дыхания регистрировали экскурсии грудной клетки с использованием пьезоэлектрического датчика VP-102 (RTF, Германия). В экспериментах использовали усилители биопотенциалов ИУ-40 (ЭПМ НИИЭМ РАМН). Частоту дыхательных движений регистрировали при полосе пропускания усилителя от 0,15 до 30 Гц, ЭКГ — от 5 до 50 Гц, ЭМГ — от 5 до 150 Гц. Для ввода аналоговых сигналов в компьютер использовали аналогово-цифровой преобразователь E14-440 (L-card, Россия) с периодом дискретизации 1 мс. Общее время исследования каждого животного составляло от 45 до 120 мин в зависимости от состояния животного. Анализ регистрируемых сигналов проводили в программе PowerGraph 3.3.9 (ООО «ДИСофт», Россия) и Origin 2019 (OriginLab Corporation, США). Для анализа моторной активности (МА) проводили ЭМГ икроножной мышцы. Используя специально разработанный оригинальный алгоритм, в программе PowerGraph 3.3.9 рассчитывали количество вспышек моторного возбуждения и среднюю длительность цикла МА (суммарное время периода покоя и моторной вспышки).

У интактных крысят после 15-минутного периода адаптации в течение 30 мин регистрировали МА, сердечный и дыхательный ритм. После регистрации физиологических показателей внутрибрюшинно вводили ингибитор Na⁺-K⁺-АТФазы уабаин (77647 SERVA Electrophoresis GmbH, Германия) в дозах, соответствующих 3/4 среднесмертельной (ЛД₅₀), с учетом сезонных колебаний, равных 2,8 и 3,4 мг/кг для 3-дневных и 11,3 мг/кг — для 16-дневных крысят.

Статистическую обработку данных осуществляли в программе Origin 2019. Использовали парный тест Стьюдента с поправками Уолша. Статистически обработанные данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. Все изменения рассматривали по отношению к фоновым показателям до введения препарата. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Расчеты показателей ЧCC и частоты дыхательных движений осуществляли в периоды, предшествующие наступлению у крысят терминальной стадии отравления с медленным атипичным ритмом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В предварительной серии экспериментов для крысят была установлена ЛД₅₀ при внутрибрюшинном введении уабаина. С учетом сезонных колебаний она составила 3,75–4,5 и 15 мг/кг внутрибрюшинно для 3- и 16-дневных животных соответственно. Гибель животных наступала через 60–90 мин из-за остановки дыхания, при этом сердечный ритм с частотой около 20–40 в минуту сохранялся еще длительное время. В качестве рабочей дозы уабаина, используемой при проведении исследований, нами была взята доза, равная 3/4 ЛД₅₀. Следует отметить, что количество погибших животных после инъекции рабочей дозы препарата несколько превысило расчетное значение. При введении уабаина в дозах, меньших 3/4 ЛД₅₀, значимых нарушений сердечного и дыхательного ритма не наблюдалось.

У части крысят (26 % — Р3, 37 % — Р16) после инъекции уабаина признаков нарушения дыхания и сердечного ритма не наблюдалось, однако в ряде случаев через 5–7 мин после введения препарата у животных возникали преходящие короткие периоды незначительной брадикардии, сменявшиеся восстановлением нормального синусового ритма.

Патологические нарушения сердечного ритма и дыхания, вызванные введением животным уабаина в рабочей дозе, могут развиваться по трем основным сценариям:

1. При первом варианте развития патологического процесса у 5 % 3-дневных и 25 % 16-дневных крысят через 15–30 мин возникает незначительная брадикардия, на фоне которой появляются короткие периоды асистолии. Это преходящая стадия, которая длится в среднем около 5 мин, после чего сердечный ритм нормализуется. Однако у 50 % 16-дневных крысят восстановления синусового ритма не произошло, и животные погибли.
2. При втором варианте у 32 % 3-дневных и 19 % 16-дневных крысят происходит развитие брадикардии, начинающееся через 10–30 мин после инъекции и длящееся от 5 до 10 мин. Затем наблюдается или одновременная остановка сердца и дыхания, или остановка дыхания с сохранением медленного ритма сердца. При этом погибает 17 % крысят на Р3 и 100 % — на Р16.
3. При самой тяжелой форме нарушений, вызванных инъекцией препарата, первые признаки аритмии наблюдаются к 5–30-й минуте в виде периодов урежения сердечных сокращений, чередующихся с периодами нормального ритма. Такие фазные периоды нормо/брадикардии имеют длительность примерно 10–20 с и продолжаются 5–20 мин. Затем ЧСС у крысят снижается до 30–40 в минуту сразу после остановки дыхания или восстанавливается до уровня, близкого к фоновому. Патологические нарушения сердечного ритма, выражающиеся в возникновении периодов нормо/брадикардии, возникают у 37 % 3-дневных крысят и у 19 % 16-дневных. При описанном типе нарушения сердечного ритма погибает 43 % крысят на Р3 и 37 % — на Р16.

Разные типы патологических реакций схематично показаны на рис. 1.

 

Рис. 1. Представленность разных типов патологических реакций у 3- (а) и 16-дневных (b) крысят после инъекции уабаина. 1 — без нарушений; 2 — сочетанное возникновение брадикардии и асистолии; 3 — брадикардия; 4 — периоды нормо/брадикардии

 

Снижение ЧСС и дыхания, наблюдаемое в нетерминальных случаях у крысят после инъекции уабаина, сопоставимо у животных обеих возрастных групп. При этом коэффициент аритмии, рассчитанный в период нормального синусового ритма сердца (К_a1), после инъекции уабаина возрастает у 16-дневных крысят в 1,7 раза больше, чем у 3-дневных. В случае возникновения выраженных аритмий (К_a2) это соотношение увеличивается до 2 раз (табл. 1).

 

Таблица 1. Изменение физиологических показателей у крысят в фоне и после инъекции уабаина в дозе 3/4 LD₅₀

Показатель	3-дневные крысята			16-дневные крысята
	фон	уабаин	% к фону	фон	уабаин	% к фону
Частота сердечных сокращений, в мин	257,1 ± 10,9	229,3 ± 7,9*	90	423,3 ± 16,2	392,9 ± 11,5*	93
Частота дыхательных движений, в мин	72,7 ± 3,3	60,3 ± 3,2	82	98,6 ± 6,4	84,9 ± 8,7	86
Кa1, у. е.	0,29 ± 0,05	0,99 ± 0,11	346	0,12 ± 0,02	0,76 ± 0,13	600
Кa2, у. е.	0,29 ± 0,05	2,96 ± 0,67	1036	0,12 ± 0,02	2,51 ± 0,91	2059

* р ≤ 0,05 — достоверность различий между фоном и препаратом.

Примечание. К_a1 — непрерывный синусовый ритм, К_a2 — сердечный ритм, с периодами аритмий включительно.

 

Как мы уже указывали выше, нарушение дыхательного ритма (замедление ритма, появление периодов поверхностного дыхания, чередующихся с высокоамплитудными судорожными вздохами) в большинстве случаев предшествует нарушениям сердечного ритма (рис. 2). Феноменологически такая картина «развала» дыхания напоминает последствия отравления Н-холиномиметиками или ингибиторами ацетилхолинэстеразы, где остановка дыхания также являлась причиной гибели животных [2, 4, 5].

 

Рис. 2. Электрокардиограмма и пьезограмма дыхания 3-дневного крысенка (а). b — фрагмент записи (а) с 20-й по 60-ю секунду. Нарушение ритма дыхания (2) через 23 мин после инъекции уабаина при сохранении синусового ритма сердца (1)

 

Инъекция уабаина сопровождается усилением МА и изменением ее паттерна. После введения препарата у крысят младшего возраста наблюдается тенденция к сокращению периодов моторного возбуждения в около- и многоминутном диапазоне, у крысят старшего возраста, наоборот, медленноволновая периодика моторных комплексов усиливается (рис. 3). Коэффициент вариации длительности циклов моторного возбуждения уменьшается на 12 % у 3-дневных крысят и увеличивается на 35 % у 16-дневных (табл. 2).

 

Рис. 3. Распределение длительности циклов моторной активности у 3- (а) и 16-дневных (b) крысят в фоне (1) и после инъекции уабаина (2)

 

Таблица 2. Показатели цикла моторной активности у крысят в фоне и после инъекции уабаина в дозе 3/4 ЛД₅₀

Показатель	3-дневные крысята		16-дневные крысята
	фон	уабаин	фон	уабаин
Средний период цикла, с	20,5 ± 1,7	18,2 ± 0,9	11,2 ± 0,3	15,4 ± 0,5*
Дисперсия	27,4	21,4	7,5	14,0
Коэффициент вариации	1,33	1,18	0,67	0,91
Среднее число циклов моторной активности у одного животного	30	71	112	138

* р ≤ 0,05 — достоверность различий между фоном и препаратом.

 

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные в нашем исследовании значения среднесмертельной дозы уабаина сопоставимы с полученными другими авторами. Ранее было проведено исследование токсичности уабаина для крыс разного возраста и показано, что LD₅₀ уабаина составляет приблизительно 3,5 мг/кг у 3-дневных, 4 мг/кг у 7-дневных и 125 мг/кг у взрослых крыс. Наблюдается постепенное увеличение LD₅₀ с 3 до 33 сут, после чего значения LD₅₀ остаются относительно постоянными. Авторами исследования был сделан вывод, что многие органы новорожденной крысы не обладают способностью взрослой крысы концентрировать уабаин в тканях внутренних органов до концентрации, превышающей его концентрацию в плазме, что приводит к более высокой токсичности уабаина в раннем онтогенезе [9]. Значительно более низкая LD₅₀ (14,28 мг/кг) была указана в работе A. Small и соавт. [10] при внутривенном введении уабаина взрослым крысам.

В опытах на изолированных полосках миокарда крыс показано, что в раннем постнатальном онтогенезе положительное инотропное действие уабаина изменяется двухфазным образом. Эффект, незначительный сразу после рождения, заметно усиливается в течение первых двух недель после рождения. В течение третьей недели положительный инотропный эффект резко снижается до нулевого уровня и в дальнейшем сменяется на отрицательный в сердце взрослой крысы. Авторы исследования полагают, что положительный инотропный эффект уабаина реализуется пулом ионов кальция саркоплазматического ретикулума, опосредуемым RyR. Было высказано предположение, что сократительная способность желудочков сердца взрослой крысы зависит в основном от внутриклеточных запасов ионов кальция, в то время как клетки сердца новорожденной крысы могут получать кальций непосредственно из внеклеточного пространства [11].

Терапевтическое использование сердечных гликозидов, используемых в лечении сердечной недостаточности, ограничено их аритмической токсичностью. Побочные эффекты гликозидов обычно связывают с чрезмерным накоплением внутриклеточного Са²⁺, возникающим в результате ингибирования Na⁺/K⁺-АТФазой ионного транспорта. Так, авторы работы [12] предложили новый механизм гликозид-зависимого аритмогенеза, результаты которого не исключают и потенциальной роли классических механизмов развития аритмий. Было высказано предположение, что аритмогенные побочные эффекты сердечных гликозидов могут включать в себя и изменения в функции RyR2, вызванные окислительными изменениями в структуре каналов. Появление аритмии является побочным эффектом, вызванным перегрузкой Са²⁺-депо саркоплазматического ретикулума и спонтанного освобождения ионов Са²⁺ через рианодиновые рецепторы [12].

В экспериментах на 3-, 16- и 30-дневных крысятах нами было показано, что блокада RyR дантроленом оказывает отрицательное хронотропное действие, выраженность которого снижается с возрастом, снижает частоту дыхания у крысят на Р3 и практически не меняет у животных старшего возраста. У подавляющего большинства крысят на Р3 происходит увеличение представленности длительной асинхронной активности и снижение доли более коротких ритмических вспышек моторного возбуждения, следующих в декасекундном ритме. На Р16 наблюдается уменьшение как квантованных, так и асинхронных форм МА. У крысят месячного возраста реакция на блокаду RyR сходна с наблюдаемой у 16-дневных животных с той лишь разницей, что амплитуда коротких вспышек возбуждения значительно возрастает по сравнению с фоновым уровнем [7]. Сдвиги показателей МА, зарегистрированные у крысят после инъекции уабаина и описанные нами выше, могут иметь тесную связь и с колебаниями холинергических влияний на соматическую мышечную активность. Известно, что физиологичеcкая pоль α2-изофоpмы Na, K-АТФазы в cкелетной мышце заключаетcя в xолинеpгичеcкой pегуляции мышечного электpогенеза за счет функциональной и молекулярной связи c никотиновым xолинорецептоpом, а также в регуляции мышечного cокpащения циpкулиpующими эндогенными дигиталиcоподобными ингибитоpами Na, K-АТФазы [13].

Обнаруженный в настоящем исследовании отрицательный хронотропный эффект уабаина (табл. 1) не противоречит полученными ранее данным [7, 11] о возможном участии RyR в опосредовании эффектов уабаина. Однако имеется целый ряд отличий, касающихся как изменения паттерна МА, так и возникновения «эзериноподобных» сердечных аритмий, которые отсутствовали при активации и торможении RyR у крысят, что свидетельствует о наличии и других точек приложения уабаина.

Возникновение периодов атипичного сердечного ритма мы неоднократно наблюдали ранее при введении крысятам ингибиторов ацетилхолинэстеразы [4, 5] и Н-холиномиметиков [1]. Появление периодов нормо/брадикардии после инъекции уабаина позволяет полагать, что часть эффектов препарата может быть реализована при участии холинореактивных структур организма. Ацетилхолин, как и многие другие медиаторы и гормоны, способен регулировать Na, K-АТФазу [14, 15]. В пользу участия холинергической системы в опосредовании эффектов уабаина могут свидетельствовать результаты исследований, проведенных как в условиях in vitro, так и in vivo. Так, в работе Вулфсона и Постона было показано, что уабаин предотвращает зависящую от времени и концентрации релаксацию, вызванную ацетилхолином в ряде сосудов у различных животных [16].

В опытах in vitro, проведенных на клетках водителя ритма синоаурикулярного (СА) узла мыши, уабаин (10 мкМ) приводит к замедлению частоты генерации потенциалов действия (ПД) на 14 %. У клеток СА узла морской свинки и кролика уабаин вызывает положительный хронотропный эффект, а на 10–15-й минутах экспозиции — аритмии и прекращение электрической активности. Установлено, что клетки СА узла мыши более чувствительны к повышению внутриклеточной концентрации ионов натрия при ингибировании Na⁺/K⁺-АТФазы, чем клетки СА узла морской свинки и кролика [17]. В опытах in vivo на 4-дневном курином эмбрионе при постепенном увеличении концентрации вводимого уабаина с 10^–6 до 10^–4 М наблюдалось дозозависимое первоначальное увеличение ЧСС, сменяющееся резким снижением частоты сердцебиений и развитием сердечной аритмии, сопровождающейся рассогласованием сокращений предсердия и желудочка. Дальнейшее увеличение концентрации уабаина до 10^–3 М вызывало снижение ЧСС и остановку сердца зародыша. Эффекты уабаина были сходными в опытах in vitro и in vivo. На фоне снижения частоты ритма наблюдалось рассогласование активности желудочка и предсердия. Результаты опытов in vitro демонстрируют, что в основе этого эффекта лежит различная чувствительность к уабаину у предсердия и желудочка сердца [18]. Таким образом, можно полагать, что способность уабаина избирательно угнетать активность возбудимых структур сердца незрелых животных может провоцировать у них развитие сердечных аритмий, в генезе которых лежат различные молекулярные механизмы регуляции сердечного ритма.

ВЫВОДЫ

С увеличением возраста животного блокада Na⁺/K⁺-АТФазы приводит к более выраженным изменениям регулярности сердечного ритма и паттерна моторной активности.

Инъекция уабаина новорожденным крысятам может вызывать нарушения сердечного ритма, в определенной степени напоминающие патологический сердечный ритм, наблюдаемый у животных на фоне чрезмерной активации холинореактивных структур. Вместе с тем нерегулярность возникновения и слабая выраженность брадикардических комплексов, возникающих после блокады Na⁺/K⁺-АТФазы, не позволяет считать участие натрий-калиевой помпы основополагающим в развитии данного вида сердечной аритмии.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке государственного бюджетного финансирования (госзадание № АААА-А18-118012290373-7 «Механизмы формирования физиологических функций в фило- и онтогенезе и влияние на них эндогенных и экзогенных факторов»).

About the authors

Sergey V. Kuznetsov

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: ksv@iephb.ru
ORCID iD: 0000-0003-2614-2632
SPIN-code: 6663-0070

Dr. Biol. Sci. (Physiology), Chief Researcher

Russian Federation, 44, Toreza str., 194223, Saint Petersburg

Nalalia N. Kuznetsova

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry Russian Academy of Sciences

Email: ksv@iephb.ru
ORCID iD: 0000-0002-0753-1707
SPIN-code: 1379-8208

Cand. Sci. Biol. (Pharmacology), Senior Researcher

Russian Federation, 44, Toreza str., 194223, Saint Petersburg

References