Eryptosis (quasi-apoptosis) the human red blood cells. Its role in medicinal therapy

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Одним из интенсивно изучаемых физиологических процессов в современной биологии и медицине является апоптоз, процесс, который в широком смысле понимают как запрограммированную гибель ядросодержащих клеток. Прежде всего апоптоз характеризуется переносом фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой; выходом цитохрома С из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму [4], образованием апоптосомы c последующей активацией каспаз (цистеиновых протеаз) и активных форм кислорода (АФК); сморщиванием цитоплазматической мембраны и уменьшением объема клетки; разрывом нитей ДНК в межнуклеосомных участках; конденсацией хроматина по периферии ядра; распадом ядра на части; фрагментацией клеток на апоптозные тельца-везикулы с внутриклеточным содержимым. В зависимости от типа клеток и вида стимула апоптоз может осуществляться по трем сигнальным путям: внутреннему митохондриальному, внешнему немитохондриальному и внешнему митохондриальному [3]. Внешние немитохондриальный и митохондриальный пути часто объединяют в единый внешний путь апоптоза. При митохондриальном апоптозе происходит пермеабилизация наружной мембраны митохондрий, которая сопровождается выбросом апоптогенных факторов (преимущественно цитохрома С) из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму, образованием апоптосомы с последующей активацией эффекторных каспаз, которые затем осуществляют деструкцию клетки. В случае развития апоптоза по внешнему немитохондриальному пути эффекторные каспазы активируются напрямую каспазами-инициаторами. Активация каспаз-инициаторов происходит в результате связывания внеклеточных лигандов, так называемых «лигандов смерти», с поверхностными рецепторами — «рецепторами смерти» [5].

Долгое время считалось, что развитие процесса апоптоза возможно только в ядросодержащих клетках. Однако исследования последних 20 лет, проведенные на эритроцитах человека и других млекопитающих, показали, что ряд событий, характерных для апоптоза, можно обнаружить в тромбоцитах и эритроцитах — клетках, лишенных ядра [9]. Известно, что эритроциты — один из наиболее многочисленных видов клеток организма, составляют почти 10 % всего объема клеток взрослого человека [184, 245]. Зрелые эритроциты постепенно стареют с последующим удалением старых клеток из циркуляции. Продолжительность жизни эритроцитов человека составляет от 100 до 120 дней. Старение эритроцитов — это естественный процесс, изучению которого посвящено много исследований, последние достижения в этой области отражены в ряде обзорных работ [1, 56, 179, 241].

Однако до наступления физиологического старения эритроциты могут подвергаться повреждениям, которые нарушают их целостность и, таким образом, запускают их программированную гибель — эриптоз. Термин был введен в 2005 г. для обозначения апоптоза эритроцитов [188]. Давно известно, что после завершения эритропоэза в эритроцитах отсутствуют ядра и митохондрии, весьма важные органеллы для механизма, реализующего классический апоптоз. Отметим, что, с одной стороны, в эритроцитах отсутствует и ряд других особенностей апоптоза, присущих ядросодержащим клеткам, включая деполяризацию митохондрий и конденсацию ядра. С другой стороны, при эриптозе проявляются некоторые другие важные черты апоптоза, такие как ускоренное уменьшение объема клетки, везикуляция и скрамблирование клеточной мембраны, ведущие к перемещению фосфатидилсерина из внутреннего слоя мембраны на поверхность клетки [186].

По нашему мнению, правильнее было бы называть процесс программированной смерти эритроцитов «квазиапоптоз». Аналогичного мнения придерживаются и другие исследователи [130]. Поскольку при эриптозе эритроциты проявляют только часть признаков апоптоза, связанных прежде всего с клеточной мембраной, такой квазиапоптоз можно охарактеризовать, по мнению М.Н. Стародубцевой [12], как мембраносвязанный апоптоз (табл. 1).

 

Таблица 1. Признаки функциональных различий видов гибели клеток

Признак	Апоптоз	Некроз	Эриптоз (мембраносвязанный апоптоз)
Функциональная значимость	Необратимое прекращение жизнедеятельности клетки, завершающееся ее поглощением макрофагами или соседними клетками без воспалительной реакции. Наблюдается в индивидуальных клетках в от на физиологические стимулы (факторы роста, гормоны и др.)	Необратимое прекращение жизнедеятельности клетки. Омертвение и гибель клеток и тканей в живом организме	Необратимое прекращение жизнедеятельности эритроцитов, завершающееся их поглощением макрофагами без воспалительной реакции. Наблюдается в индивидуальных эритроцитах при окислительном стрессе, осмотическом шоке, энергетическом истощении и воздействии повышенных концентраций Ca2+
Распространенность	Одиночная клетка	Группа клеток, ткань	Одиночная клетка
Индукция	Активируется физиологическими или патологическими стимулами	Различная в зависимости от повреждающего фактора	Различная в зависимости от повреждающего фактора
Генный контроль	Да	Нет	Нет
Морфологические параметры	Потеря микроворсинок и межклеточных контактов. Агрегация хроматина при ядерной мембране, конденсация ядра и цитоплазмы. Уменьшение объема клетки. Вспучивание мембраны без потери ее целостности. Фрагментация клетки на везикулы из плазматической мембраны, фрагменты клетки и апоптозные тельца. Образование пор в мембране митохондрий	Нет аналога Нет аналога Набухание и лизис клеток	Нет аналога Нет аналога Уменьшение объема клетки. Кренирование клеток, везикулизация мембраны
Целостность клеточной мембраны	Появление фосфатидилхолина на внешней поверхности плазматической мембраны	Нарушена. Диффузная локализация в некротизированной клетке	Изменение в асимметрии мембран (появление фосфатидилсерина на внешней поверхности плазматической мембраны)
Биохимические изменения	Строго регулируемый энергозависимый процесс. Моно- и олигонуклеосомная фрагментация ДНК до лизиса клетки. Выделение различных регулирующих факторов (AIR, цитохром С) митохондриями в цитоплазму клетки.	Энергозависимый процесс Нарушение или прекращение ионного обмена. Из лизосом высвобождаются ферменты. Нет аналога	Энергозависимый процесс. Нет аналога. Нарушение ионного обмена. Активация некоторых каспаз. В основном казпазoнезависимый механизм
Структурные изменения	Изменения в структуре цитоскелета. Появление рецепторов на поверхности клетки, аккумулирование церамидов. Активация катионных каналов		Изменения в структуре мембранного скелета. Появление рецепторов на поверхности клетки, образование церамидов. Активация катионных каналов
Удаление погибших клеток	Поглощение (фагоцитоз) соседними клетками	Поглощение (фагоцитоз) нейтрофилами и макрофагами	Поглощение (фагоцитоз) нейтрофилами и макрофагами
Воспалительный процесс	Нет	Обычно есть	Нет

 

В обзорной статье обсуждаются современные представления о молекулярных механизмах эриптоза (мембраносвязанного апоптоза) в эритроцитах человека в норме и при патологии.

Структурные и биофизические характеристики эритроцитов

При физиологических условиях количество эритроцитов в циркулирующей крови приблизительно равно 4 ∙ 10¹²/л, что составляет почти половину полного объема крови. Эритроциты происходят из эритробластов, клеток-предшественников миелоидной линии cтволовой клетки, и теряют ядра прежде, чем войти в стадию ретикулоцита. Эритропоэз — динамичный процесс, который жестко регулирует количество эритроцитов в кровообращении, причем примерно 10¹¹ эритроцитов производятся и удаляются из кровообращения каждый день [184, 295, 310]. Морфологически нормальные эритроциты имеют двояковогнутую форму, благодаря чему обладают выраженной способностью подвергаться мембранной деформации и удлиняться, поскольку им приходится проходить через узкие капилляры [201]. Самая важная и известная функция эритроцитов — транспортировка кислорода из легких к тканям [51].

Мембранам присуща такая особенность, как вертикальная (трансмембранная) асимметрия. Это означает, что у каждой мембраны, имеющей внутреннюю и внешнюю поверхности, существует различие по липидному и белковому спектрам. Из-за того, что липиды с более объемными полярными «головками» стремятся попасть в наружный слой вследствие большей площади поверхности, возникает липидная асимметрия [33, 202, 260].

С химической точки зрения фосфолипиды состоят из четырех частей: глицерина, двух жирных кислот с длинной углеводородной цепью, фосфорной кислоты и особой для каждого фосфолипида группы, которую называют характеристической [231].

Фосфолипиды различаются как составом жирных кислот, так и структурой характеристической группы. В фосфатидилэтаноламине такой группой является остаток этаноламина, в других фосфолипидах ею могут быть остаток холина, серина и другие полярные молекулы [6, 7, 14, 16].

В состав липидного слоя мембран входят также холестерин и сфингомиелины [17]. Последние по химическому строению и физическим свойствам близки к фосфолипидам [11]. Самые распространенные фосфоглицериды — фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол. Полярная «головка» фосфатидилсерина содержит остаток аминокислоты серина, а фосфатидилинизитола — остаток циклического спирта [13]. При значениях pH, близких к 7,0, спиртовые группы «головок» могут нести один или несколько электрических зарядов. Фосфатидилсерин активирует мембранные АТФазы, следовательно, участвует в поддержании градиента концентрации ионов по обе стороны мембраны эритроцитов, а также в регуляции энергообеспечения клетки. Второй важный класс мембранных липидов — сфинголипиды, они тоже имеют полярную «головку» и два неполярных «хвоста», только у них отсутствует глицерол [8]. Сфинголипиды построены из одного остатка жирной кислоты, одного остатка длинноцепочечного аминоспирта — сфингозина (или его производного) — и одного остатка спирта полярной головы [17, 259, 305].

Распределение липидов в эритроцитарной мембране асимметрично: на ее внешней стороне концентрируются сфингомиелин (26 % от всех липидов) и фосфатидилхолин (28 %), на внутренней — фосфатидилсерин (13 %) и фосфатидилэтаноламин (27 %) [18] (рис. 1).

 

Рис. 1. Схема взаимосвязи основных элементов мембраны эритроцитов

 

Асимметричное расположение липидов в мембране поддерживается за счет ряда ферментов [82]. К ним относятся Mg-АТФ-зависимая амино-фосфолипидтранслоказа (АТФаза II типа, или флиппаза) и скрамблаза, которые отвечают за локализацию фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина во внутреннем монослое [11]. Важная функция Mg-АТФ-зависимой фосфолипидтранслоказы — перенос в процессе эриптоза фосфолипидов из внутреннего монослоя во внешний. В нормальных условиях такое движение липидов протекает намного медленнее, чем осуществляемое флиппазой. Нарушение асимметрии фосфолипидов может произойти за счет активации скрамблазы, которая не активна при физиологических условиях. Активация возможна при условии высокой концентрации ионов Ca²⁺, что приводит к перемещению фосфолипидов в обоих направлениях [18].

Процесс «флип-флопа» (то есть вертикальное перемещение липидов) сфинголипидов и фосфоглицеридов в мембране протекает с затруднением в связи с невозможностью полярных «головок» проходить через гидрофобный слой. Поэтому липиды, находящиеся на внутренней стороне мембраны, имеют относительно высокую скорость трансмембранной миграции, по сравнению с липидами наружной стороны мембраны, мигрирующими медленнее или вообще не совершающими «флип-флоп»-перескоки без участия флиппазы и скрамблазы [33].

По причине того, что молекулы фосфолипидов перемещаются с одной стороны мембраны на другую, происходит изменение свойств и функциональной активности эритроцитов [198]. Обстоятельными исследованиями установлено, что если фосфатидилсерин появляется в наружном слое мембраны, это приводит к усилению способности эритроцитов активировать функцию макрофагов по захвату старых и поврежденных клеток [145, 153, 239]. Наличие холестерина в мембране уменьшает подвижность жирных кислот, снижает латеральное смещение липидов и белков, изменяя тем самым функцию последних [95, 196, 198, 229].

Физиологическая значимость асимметрии фосфолипидов в мембране эритроцитов многообразна. Во-первых, текучесть внутреннего монослоя несколько больше, чем внешнего, за счет того, что «хвосты» жирных кислот, входящих в состав фосфатидилхолина и сфингомиелина, более насыщенны. Это делает слой менее текучим по сравнению с теми, которые находятся в составе фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина внутренней поверхности. Во-вторых, отрицательно заряженный фосфатидилсерин, взаимодействующий с регуляторными и структурными белками, при нарушении асимметрии приводит к экспонированию фосфатидилсерина на наружной поверхности, что является сигналом к эриптозу [49, 50, 82, 254], а также к изменению соотношения зарядов на внутренней и внешней сторонах бислоя мембраны эритроцита. Таким образом, aссимметрия фосфолипидов определяет текучесть мембраны (fragility) и вносит важный вклад в поддержание механических свойств мембраны [95, 236].

Метаболические особенности эритроцита человека

Эритроцит является метаболически активной клеткой и содержит более 40 различных ферментов. Энергетическое обеспечение эритроцита осуществляется за счет утилизации глюкозы в реакциях анаэробного гликолиза. Эффективность гликолиза характеризуется образованием двух молекул АТФ на одну молекулу глюкозы, однако даже это небольшое количество энергии дает возможность эритроциту выполнять все его функции. Основная доля энергии АТФ расходуется в эритроцитах на транспорт ионов, функционирование АТФазных систем и поддержание электролитного баланса клетки. Макроэргические фосфатные связи АТФ необходимы также и для инициации реакций гликолиза и пентозофосфатного цикла [34].

Наиболее важные реакции гликолиза протекают с участием ферментов гексокиназы, фосфофруктокиназы и пируваткиназы. Отличительная особенность гликолиза в эритроцитах по сравнению с другими клетками — выработка значительного количества 2,3-дифосфоглицериновой кислоты, регулирующей кислородосвязывающую функцию гемоглобина.

Главная функциональная группа глутатиона — сульфгидрильная, ее водород обеспечивает нейтрализацию органических и неорганических окислителей, действующих на мембрану эритроцита, и защищает липиды мембраны от свободнорадикального окисления.

В условиях врожденной или приобретенной недостаточности энергообеспечения эритроцитов при нарушении активности гликолитических ферментов и ферментов пентозофосфатного окисления глюкозы возникает дестабилизация эритроцитарной мембраны, изменение формы эритроцита, гемолиз и выход гемоглобина в кровеносное русло.

Поскольку в эритроцитах отсутствуют митохондрии, система цитохрома, рибосомальный аппарат, соответственно, отсутствует цикл трикарбоновых кислот. Поэтому эритроцит не воспроизводит de novo нуклеиновые кислоты и липиды. Основным источником энергии для нормального функционирования эритроцитов является глюкоза, метаболизирующаяся по двум основным путям: это путь Эмбдена – Мейергофа и гексозомонофосфатный путь.

Цикл гликолиза Эмбдена – Мейергофа. Метаболизм глюкозы в цикле заканчивается образованием пирувата или лактата. Проникновение глюкозы в эритроцит происходит довольно быстро с помощью транспортера GLUCO-1, расположенного в мембране клеток.

Эффективность гликолиза характеризуется образованием двух молекул АТФ на одну молекулу глюкозы, однако это небольшое количество энергии обеспечивает эритроциту выполнение всех его функций. Основная доля энергии АТФ расходуется в эритроцитах на транспорт ионов, функционирование АТФазных систем и поддержание электролитного баланса клетки. Макроэргические фосфатные связи АТФ необходимы и для инициации реакций гликолиза и пентозофосфатного цикла.

Дефицит гексокиназы может быть одной из причин наследственной гемолитической анемии. Продукт гексокиназной реакции (глюкозо-6-фосфат) трасформирется в глюкозо-1-фосфат при участии фосфоглюкомутазы, а также находится в равновесии с фруктозо-6-фосфатом вследствие глюкозофосфатизомеразной реакции (ГФИ), имеющей большое метаболическое значение.

Дефицит глюкозофосфатизомеразы становится причиной достаточно часто возникающей наследственной несфероцитарной гемолитической анемии. Третья стадия цикла Эмбдена – Мейергофа включает фосфорилирование при участии фосфофруктокиназы фруктозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-дифосфата (Ф-1,6-ДФ). Дефицит фермента Ф-1,6-ДФ является одной из причин нарушения накопления гликогена и развития наследственной гемолитической анемии. Далее в эритроците Ф-1,6-ДФ распадается на две триозы — глицеральдегидтрифосфат (ГАФ) и диоксиацетонфосфат (ДАФ). Глицеральдегидтрифосфат непрерывно превращается в 1,3-ДФГ (дифосфоглицераль), который затем трансформируется в 2,3-ДФГ и 3-ФГ. Последний дефосфорилируется в 2-ФГ, который находится в равновесии с фосфоенолпируватом (ФЕП). В свою очередь ФЕП служит донором фосфата для участия АДФ на второй стадии синтеза АТФ в реакциях гликолиза в эритроцитах (рис. 2).

 

Рис. 2. Cхема взаимосвязи метаболических путей эритроцита человека

 

Вышеизложенное подтверждает большую значимость для поддержания стабильности эритроцитарной мембраны, обеспечивающее образование АТФ, интенсивность гликолитических реакций, и, соответственно, полноценное функционирование АТФазных систем и трансмембранного переноса ионов, а также состояние пентозного цикла окисления глюкозы и образование достаточного количества НАДФН₂ (никотинадениндинуклеотид восстановленный).

Кроме гликолиза в эритроцитах происходит прямое окисление глюкозы в пентозофосфатном цикле, на его долю приходится 10–11 % всего энергетического метаболизма клетки. Ключевыми ферментами пентозофосфатного цикла являются глюкозо-6-фосфатдегидротеназа, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа. В процессе пентозофосфатного окисления глюкозы образуется восстановленная форма кофермента НАДФ, использующаяся для восстановления глутатиона — основного компонента защитной антиоксидантной системы эритроцита.

Гексозомонофосфатный путь. Образующийся в гексокиназной реакции глюкозо-6-фосфат далее участвует в трех направлениях метаболизма в эритроцитах с участием ферментов фосфоглюкокиназы, глюкозофосфоизомеразы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. В результате фосфоглюконатдегидрогеназной реакции в эритроцитах образуется рибулозо-5-фосфат, который находится в равновесии с рибозо-5-фосфатом и ксилулозо-5-фосфатом.

В физиологических условиях энергетические потребности эритроцитов покрываются в результате утилизации глюкозы в пути Эмбдена — Мейергофа и гексозомонофостфатном пути. Кроме того, эритроциты обладают способностью метаболизировать фруктозу, лактозу, галактозу и нуклеотиды, в частности инозин.

Наряду с этим в эритроцитах происходят реакции восстановления метгемоглобина. Как известно, в процессе диссоциации оксигемоглобина железо гемоглобина приобретает двухвалентное ферросостояние. В ряде случаев кислород отрывается в виде супероксиданионрадикала, забирает один электрон у железа и превращает гемоглобин в метгемоглобин. В присутствии восстановленного глютатиона и аскорбиновой кислоты метгемоглобин восстанавливается до гемоглобина.

Увеличение образования 2,3-ДФГ снижает сродство гемоглобина к О₂, что приводит к сдвигу кривой диссоциации оксигемоглобина вправо и усиленному поступлению О₂ в ткани. Сдвиг кривой вправо возникает также при увеличении температуры тела, возрастании уровня СО₂ или на фоне развития метаболического ацидоза.

Таким образом, лишенный глюкозы эритроцит постепенно деградирует, переходя в эхиноцит, сфероцит и затем подвергается эриптозу, поскольку теряет способность поддерживать градиент натрия и калия и накапливает окисленный глутатион и метгемоглобин в условиях окислительного стресса.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПРОЦЕССА ЭРИПТОЗА

Многочисленными исследованиями установлено, что эриптоз запускается прежде всего повышением внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция, а также рядом веществ эндогенного и экзогенного происхождения: металлами и их соединениями, лекарственными препаратами и ксенобиотиками [26, 27, 51, 90, 91, 267, 268]. Воздействие этих веществ либо запускает механизмы, связанные с повышением внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция и усилением выработки эндогенного церамида, либо активирует дополнительные механизмы, такие как энергетическое истощение по АТФ, окислительный стресс и/или активация каспазы 3. Доказано, что одновременно могут запускаться несколько механизмов [2, 172, 192, 241, 289, 290].

1. Накопление внутриклеточных ионов Са²⁺ — основа механизма эриптоза

В работах исследовательской группы профессора Ф. Ланга (ФРГ) установлено, что ключевой механизм, запускающий эриптоз, обусловлен повышением внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция [183, 186, 187]. Показано, что увеличение концентрации свободных ионов кальция в цитозоле эритроцитов может происходить в результате активации неселективных катионных каналов. До настоящего времени белки, выполняющие функцию катионных каналов, не идентифицированы, хотя предполагается участие TRPC6-канала (англ. transient receptor potential channel 6) [179]. Осмотический шок, окислительный стресс и удаление ионов хлора из среды инкубации также приводят к активации катионных каналов в эритроцитах человека. При гиперосмотическом шоке эритроцитов происходит стимулирование активности фермента циклооксигеназы, что приводит к образованию простагландина Е ₂ (рис. 3), который в конечном итоге активирует неселективные катионные каналы [183]. Следует подчеркнуть, что по-прежнему существуют противоречивые данные о наличии в эритроцитах двух известных изоформ циклооксигеназы, имеющихся в других клетках. Например, циклооксигеназа-1 присутствует в эндоплазматическом ретикулуме всех клеток за исключением эритроцитов, а циклооксигеназа-2 обнаружена в эндоплазматическом ретикулуме клеток головного мозга, почек, костей и женской репродуктивной системы [195].

 

Рис. 3. Схема центральной роли действий ионов Са2+ в механизме эриптоза

 

Установлено, что после повышения внутриклеточной концентрации свободных ионов кальция события в эритроцитах могут развиваться в двух направлениях. С одной стороны, свободные ионы кальция стимулируют «скрамблинг» всех классов фосфолипидов мембраны эритроцита с перераспределением «маркерного» фосфатидилсерина из внутреннего во внешний липидный монослой [2]. С другой стороны, повышение внутриклеточного содержания свободных ионов кальция активирует калпаин-цистеиновую эндопептидазу, представляющую собой фермент, субстратами которого являются белки цитоскелета: спектрин, актин и белок полосы 3 [17, 264], а также мембраносвязанный транспортер Са²⁺-АТФаза, то есть Са²⁺-помпа, отвечающая за транспорт ионов кальция из клетки [288]. В естественных условиях в эритроцитах человека калпаин находится в цитоплазме в неактивной форме. Однако в процессе повышения концентрации ионов кальция внутри клетки калпаин перемещается из цитоплазматического пространства в мембрану, где подвергается аутопротеолитической активации. Более того, активированный в эритроцитах калпаин может, в свою очередь, протеолитически стимулировать каспазу 3, субстратами которой наряду с другими компонентами являются спектрин и актин [206, 294]. Таким образом, комплексное развитие, описанных выше событий приводит к перемещению «маркерного» фосфатидилсерина на поверхность эритроцита, активной везикуляции эритроцита, ускоренного уменьшения объема клетки — морфологических признаков эриптоза (см. рис. 3).

2. Изменение ионного баланса в эритроцитах в процессе циркуляции

Как мы уже отметили, накопление свободного Са²⁺ в цитоплазме эритроцитов активирует Са²⁺-чувствительные К⁺-каналы (каналы Гардоша), что, в свою очередь, приводит к выходу ионов кальция из клеток параллельно с потерями осмотической воды. В эксперименте показано, что каналы Гардоша могут быть стимулированы локальной деформацией мембраны, которая напоминает быструю деформацию эритроцитов в кровеносных капиллярах [87, 151, 152]. Потеря клетками ионов калия и хлора и последующая дегидратация стареющих эритроцитов в первые несколько недель после выхода в кровеносное русло также зависит от функциональной активности K⁺-Cl-котранспортера [112]. Эти процессы играют ключевую роль в постепенном увеличении плотности стареющих эритроцитов. Они не способны проходить через узкие щели между эндотелиальными клетками синусоидов в селезенке, поэтому макрофаги ретикулоэндотелиальной системы распознают их и удаляют из циркуляции.

В настоящее время эта гипотеза старения эритроцитов в связи с новыми данными об эриптозе требует совершенствования. Например, относительно недавно в крови человека была описана небольшая субпопуляция старых эритроцитов, которые устойчивы к дегидратации после увеличения содержания внутриклеточного калия, индуцированного ионофором валиномицином, или после входа Са²⁺ в клетки, индуцированные ионофором А23187, то есть такие клетки не способны сжиматься и контролировать свой объем [63, 196, 214]. Эти эритроциты, названные авторами valres (0,031 ± 0,034 % от общего числа эритроцитов) и calres (3,2 ± 1,1 %), обычно выделяются из фракции наименьшей плотности, которая содержит в основном ретикулоциты, но имеет высокие значения гликированного гемоглобина HbA1c, что является подтверждением, что эти клетки представляют собой самые старые эритроциты в кровеносном русле, готовые к удалению из циркуляции [194, 196]. Такие эритроциты содержат низкие концентрации калия и высокие — натрия, причем отношение Na/K в них на порядок выше, чем в общей нефракционированной популяции эритроцитов. Такой процесс приводит к постепенному накоплению ионов натрия, хлора и воды. Открытие старых valres и calres эритроцитов означает, что последняя терминальная стадия их жизни может быть более сложной, по крайней мере для некоторых клеточных популяций. Исследователи сделали вывод, что часть эритроцитов в течение жизни сначала проходит длительную фазу постепенной дегидратации, за которой следует стадия регидратации перед удалением таких клеток из циркуляции. Этот феномен был назван terminal density reversal [196], позже он был подтвержден и в другой работе [197].

Постепенное снижение активности мембранного Са²⁺-насоса в стареющих эритроцитах нарушает баланс между выходом Ca²⁺ из клеток и его поступлением в клетку через Ca²⁺-каналы; это приводит к увеличению содержания в цитоплазме свободного Ca²⁺, в конечном счете превышающего пороговое значение, достаточное для активации каналов Гардоша [284, 285]. Эти события приводят к потере клетками ионов калия и хлора и осмотически необходимой воды, что ведет к увеличению плотности клеток. Исследования показали, что активность каналов Гардоша и K⁺-Cl-котранспортера [281], обеспечивающие градиент ионов калия через мембраны, постепенно снижается в процессе старения эритроцитов [112, 139, 280], однако молекулярные изменения, лежащие в основе такого снижения активности, пока не выяснены. Теоретически возможны как модификация самих молекул ион-транспортирующих систем, например их протеолиз или агрегация, так и их фосфорилирование/дефосфорилирование вследствие изменения активности протеинкиназ и протеинфосфатаз, регулирующих функционирование ионных переносчиков. В противоположность этому в последние дни жизни эритроцитов в кровеносном русле наблюдается резкое увеличение проницаемости мембраны для ионов натрия, достаточное для превышения способности Na⁺/K⁺-насоса выбрасывать ионы натрия из клетки. В эритроцитах человека, как показано, вход ионов натрия через слабоселективные катионные каналы стимулируется преимущественно увеличением содержания ионов Ca²⁺ и в меньшей степени дегидратацией [58, 261]. Кроме того, увеличение проницаемости мембраны для ионов натрия может быть следствием активации Na⁺/H⁺-обменника, поскольку показано, что внутриклеточный рН старых эритроцитов смещается в щелочную сторону [197, 260]. Предполагается, что Na⁺/H⁺-обменник также активируется повышенным уровнем ионов Ca²⁺ [228]. Активация этих ион-транспортирующих систем, позволяющая накоплению ионов натрия и хлора превысить потери ионов калия и хлора, приводит к набуханию эритроцитов низкой плотности за счет высокого содержания натрия как полагают, это является ключевым механизмом терминального обращения плотности (terminal density reversal) в самых старых эритроцитах. Нарушения ионного баланса в старых эритроцитах приводит с изменению структуры их мембран и, соответсвенно, их реологических параметров. Отметим, что в норме высокая способность к деформации помогает эритроцитам диаметром 7–8 мкм проходить через узкие кровеносные капилляры диаметром 3–5 мкм и через щели шириной 1–2 мкм между клетками эндотелия в синусоидах селезенки [76, 78]. Исследования эритроцитов фракций разной плотности показали постепенную потерю эритроцитами способности к деформации в процессе старения. Максимальный индекс деформируемости для наиболее плотных (0,8 % общей фракции) эритроцитов составляет 68 % от средней величины индекса деформируемости целой фракции, причем эта величина одинакова для эритроцитов человека, кролика и мыши [295]. При этом показано, что у старых эритроцитов замедляется скорость восстановления формы клеток после деформации [65, 222].

Однако в процессе естественного старения, так же как и до их старения, эритроциты могут получить повреждения, которые ставят под угрозу их целостность, функции и выживание [1, 183, 185]. При этих обстоятельствах эритроциты подвергаются процессу ускоренной деградации клеток (эриптозу), напоминающему апоптоз. Этот процесс запускает механизм избавления от дефектных клеток, не нарушая целостности клеточной мембраны и не производя выброс цитозольного материала во внешнюю среду [15, 243]. Эриптоз эритроцитов характеризуется расстройством асимметрии фосфолипидов клеточной мембраны, в ходе которого происходит перемещение фосфолипида клеточной мембраны фосфатидилсерина от внутреннего слоя билипидной мембраны к внешнему слою, процесс регулируется флиппазой [299, 300]. Эта трансформация мембраны похожа на апоптоз ядросодержащих клеток, где флиппаза обслуживает архитектуру фосфолипидов мембраны [96, 287]. Морфологически пораженные эриптозные эритроциты также связаны с трансформацией объема клетки и формированием выпячиваний на поверхности клетки [172, 174, 242]. В эриптозных эритроцитах может измененяться эластичность клеточной мембраны [243]. Макрофаги опознают эриптозные эритроциты, фагоцитируют и разрушают, таким образом они, подобно aпоптозным ядросодержащим клеткам, удаляются из кровообращения (см. рис. 4) [179, 183, 242].

 

Рис. 4. Обобщенная схема последовательности событий эриптоза на мембране эритроцитов [33, с изм.]: а — состояние мембранных элементов у молодых и зрелых эритроцитов; б — структурная трансформация мембраны у старых или поврежденных эритроцитов (эриптоз)

 

Выше было указано, что ключевым механизмом, запускающим эриптоз, является увеличение концентрации цитозольных ионов Ca²⁺, следующей за активацией Ca²⁺-проницаемых неспецифических катионных каналов, что приводит к поступлению внеклеточных ионов Ca²⁺ в эритроциты [186, 300]. Пока молекулярная идентичность этих каналов остается неустановленной, однако считается, что они включают переходный канал рецептора TRPC6 [103]. Установлено, что стрессорные воздействия на клетку, такие как осмотический шок, энергетическое истощение и гипертермия, также могут привести к активации этих каналов [14, 100]. Катионные каналы, необходимые для поступления ионов кальция, могут быть смодулированы эндогенными медиаторами, такими как простагландин E₂ [187] и гормональный гликопротеин эритропоэтин [216]. Экспериментально установлено, что у эритроцитов, взятых от мышей, дефектных по aннексину A7, регистрировалась увеличенная чувствительность к проэриптозным эффектам повышения концентрации ионов Ca²⁺, которая была сопоставима с увеличением концентрации простагландина Е ₂ [177]. В результате увеличения концентрации цитоплазматического Ca²⁺ происходит активация особого мембранного преобразователя скрамблазы (scramblase), что, в свою очередь, вызывает перемещение фосфатидилсерина из внутреннего слоя во внешний слой клеточной мембраны эритроцита (этот процесс именуется экспозицией фосфатидилсерина) [14, 33, 143]. Результаты недавних исследований свидетельствуют, что при физиологических условиях подавление деятельности скрамблазы, а не активности флиппазы, крайне важно для поддержания фосфатидилсерина во внутреннем слое мембраны эритроцита [34, 146, 148]. Увеличенная концентрация цитоплазматических ионов Ca²⁺ также влияет на деятельность каналов Гардоша, которые способствуют выходу ионов калия из клетки, что вызывает гиперполяризацию клеточной мембраны, клеточную дегидратацию и уменьшение объема клетки [71]. Увеличенная концентрация цитозольного Ca²⁺ трансформирует цитоскелет и активирует большое разнообразие Ca²⁺-чувствительных ферментов, таких как трансглутаминаза [30], фосфолипаза [28], калпаин [264], киназы белка и фосфатазы [80, 214].

Независимо от увеличения концентрации внутриклеточных ионов Ca²⁺, эриптоз может быть индуцирован прекращением взаимодействия цитоскелета с клеточной мембраной, вызванное разрушением сфингомиэлина и последующим формированием церамида [86, 178, 181]. Формирование церамида во время эриптоза может происходить совместно с увеличением концентрации внутриклеточных ионов Ca²⁺ [174] в результате биотрансформации сфингозина под влиянием фермента церамид синтетазы. При этом киназа сфингозина 1 катализирует формирование сфингозин-1-фосфата из сфингозина [141, 304]. Эритроциты имеют недостаток фермента сфингозин-1-фосфата и, таким образом, накапливают сфингозин-1-фосфаты [42]. Было зарегистрировано, что сфингозин, но не сфингозин-1-фосфаты, вызывает Ca²⁺-зависимый эриптоз, указывающий на важную роль метаболизма сфинголипидов в регулировании жизни и смерти эритроцита [246]. Церамид ускоренно синтезируется после воздействия на эритроциты осмотического шока [185, 189]. Осмотический шок вызывает формирование фосфолипаза A₂-зависимого тромбоцитоактивного фактора, который, в свою очередь, вызывает расстройство сфингомиэлина с последующим образованием церамида [116, 189]. Эритроциты также могут экспрессировать каспазы, участвующие, в отличие от апоптоза ядросодержащих клеток, в эриптозе при определенных условиях: это или окислительный стресс, или экспозиция поверхности клетки к цистеинил-лейкотриену C₄ [52, 104]. Показано также, что активация каспаз не требуется, если индукция эриптоза осуществляется внутриклеточными ионами Ca²⁺ [183].

3. Окислительный стресс

Эритроциты в процессе кровообращения постоянно подвергаются действию окислительного стресса, в нормальных клетках он нейтрализуется антиокислительными защитными механизмами. Они включают поглотители активной формы кислорода (АФК), в том числе глютаминил-цистеинил-глицин и ферменты: супероксиддисмутазу, каталазу, пероксиредоксин 2 и глютатион пероксидазу [129, 237]. Существенно, что неустойчивость окислительно-восстановительного потенциала эритроцита сопровождется активацией неспецифических катионных каналов, что ведет к поступлению внутрь клетки ионов Ca²⁺ и, следовательно, индуцированию эриптоза [87, 88]. Показано, что эритроциты мышей, дефектных по глутамат-цистеиновой лигазе, имеют увеличенную уязвимость для эриптоза, вызванного окислительным стрессом и гемолизом [102]. Кроме того, у таких мышей обнаружили серьезное повреждение функций почек [102]. Генетический дефект фермента глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы гексозомонофосфатного шунта вызывает сенсибилизацию эритроцитов к повреждениям от окислительного стресса, приводящим их к эриптозу [125]. Чувствительные к окислительному стрессу изменения в эритроцитах прогрессивно увеличиваются с возрастом эритроцита, то есть более старые эритроциты имеют бо́льшую склонность к эриптозу [124, 152, 300]. Этот механизм может быть задействован при повреждении эритроцитов во время хранения донорских компонентов крови [168, 247, 248, 306]. Таким образом, баланс окислительно-восстановительного потенциала эритроцита — это ключевая детерминанта, определяющая выживание эритроцитов при изменении окружающих условий.

Так же как ядросодержащие клетки, эритроциты экспрессируют большое количество других сигнальных молекул, включая киназы, которые весьма чувствительны к стрессорным условиям: осмотическому шоку, окислительному стрессу или энергетическому истощению [179, 185, 241]. В течение последних 20 лет исследовались фармакологические ингибиторы и/или активаторы различных сигнальных молекул и их воздействие на эриптоз, вызванный в результате экспонирования клетки к различным патофизиологическим стрессам [179, 185, 241]. Многие из этих фармакологических модуляторов эриптоза охватывают не только клинически используемые лекарства, но и ксенобиотики, а также микробные токсины и ионы металлов [75, 84, 94, 178, 308].

Установлено, что под действием стресса в клетках активируются киназы: p38 митогенактивированная протеинкиназа (mitogen-activated protein kinases, MAPK) и янус-киназа JAK3, которые в процессе активации подвергаются фосфорилированию [116, 134]. При осмотическом шоке [185] фармакологическое ингибирование киназы p38 МАРK приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ионов Ca²⁺ и экспонированию фосфатидилсерина с последующим уменьшением объема эритроцита [116]. Проведенная при этом дополнительная обработка эритроцитов иономицином приводит к ослаблению экспозиции фосфатидилсерина, что позволяет предположить, что активация p38 МАРK связана с активностью внутриклеточных ионов Ca²⁺ во время эриптоза [116].

4. Энергетическое истощение

Мы уже упоминали, что экспрессированная эритроцитом янус-киназа JAK3 фосфорилируется в процессе энергетического истощения [134]. В этой же работе продемонстрировано, что введение ингибиторов киназы JAK3 может восстанавливать эриптоз. Исследование повышения устойчивости эриптоза, вызванного истощением глюкозы эритроцитов, взятых от мышей, дефектных по JAK3, подтвердило, что JAK3 — решающая сигнальная молекула для эриптоза, чувствительного к энергетическому истощению [134].

Чувствительный к энергетическому истощению эриптоз обычно выявляется активацией протеинкиназы C, процесс сопровождается перемещением киназы из цитозоля к клеточной мембране [163]. Такой эриптоз нейтрализуется при помощи включения энергочувствительного фермента АМФ-киназы, который, в свою очередь, активируется истощением глюкозы [108]. В эксперименте показано, что эритроциты мышей шестинедельного возраста, дефицитных по AMФ-киназе, имели повышенный эриптоз, что сопровождалось тяжелой анемией животных, ретикулоцитозом и высокой спленомегалемией, а также возрастанием деструкции и ускоренного оборота эритроцитов при циркуляции [108]. Кроме того, протеомный анализ эритроцитов таких мышей показал ослабление регуляции p21-активированной киназы 2 (p21-ПAK2) и казеинкиназы la (КKlа), которые также участвуют в эриптозе эритроцитов [168, 306, 307]. Согласно экспериментам in vitro, фармакологическое ингибирование киназы p21-ПAK2 усиливало вызванный истощением глюкозы эриптоз эритроцитов мышей, дефектных по AMФ-киназе, по сравнению с нормальными эритроцитами простых мышей [308]. По этой причине уменьшение концентрации киназы p21-ПAK2 может способствовать усилению эриптоза при анемии, наблюдаемой у мышей, дефектных по AMФ-киназе [307]. В других экспериментах показано, что усиленная экспрессия киназы КKla является важным регулятором эриптоза эритроцита [307]. При обработке гидроперекисью трет-бутила или энергетическом истощении эритроциты, предварительно обработанные D4476 (неспецифическим ингибитором КK1а), были защищены от эриптозных изменений, включая блокирование уменьшения объема клетки, блокирование увеличения экспонирования фосфатидилсерина и активности цитоплазматического Ca²⁺. Однако обработка клеток Pyrvinium Pamoate активатором КKla усиливала эриптоз эритроцитов, вызванный окислительным стрессом или энергетическим истощением [84]. Согласно электрофизиологическим экспериментам, Pyrvinium Pamoate усиливал поток ионов кальция через неизбирательный катионный канал, который был предварительно активирован инкубацией эритроцитов в среде, свободной от хлора [169].

Эриптоз замедляется цГMФ-зависимой киназой типа 1 (цГMФ-КК1), мыши, дефектные по этой киназе, анемичны и имеют увеличенную селезенку, а их эритроциты in vivo демонстрируют сокращенную продолжительность жизни и ускоренный клиренс [101]. Установлено, что оксид азота (NO), как эндогенный медиатор и стимулятор цГMФ-зависимой киназы, является самостоятельным сильным ингибитором эриптоза [224]. Выявлено, что NO не запасается в эритроцитах, а образуется в процессе метаболизма после деоксигенации гемоглобина [128]. Известно, что при апоптозе ядросодержащих клеток NO не блокирует действие каспаз [261]. Однако в эритроцитах NO более эффективен при уменьшении эриптоза клеток, противодействуя увеличению концентрации внутриклеточных ионов Ca²⁺, которая вызывается различными стрессорами клетки и нитрозиляцией ферментов, требуемых для скрамблирования клеточной мембраны [217, 263]. Интересно, что обработка эритроцитов иономицином ослабляет S-нитрозиляцию белка, в том числе антиaпоптозный фермент тиоредоксин, который способен управлять балансом окислительно-восстановительного потенциала эритроцитов [87, 263].

Совсем недавно выяснили, что эриптоз может регулироваться митоген- и стрессактивируемой киназой МСК1/2 [172], которая осуществляет обратную регуляцию тесно связанных между собой киназ, регулируемых сигналами киназ МАСK1/2 и p38 МАРК, что крайне важно для осуществления большого количества функций клетки, включая апоптоз ядросодержащих клеток [256]. В то время как у дефицитных по MСK1/2 мышей наблюдается клинически регистрируемая анемия, в их крови определяются усиленный ретикулоцитоз и сокращенная продолжительность жизни эритроцитов [173]. При отсутствии стресса в анализе эритроцитов мышей, дефицитных по MСK1/2, не отмечены увеличенное экспонирование фосфатидилсерина или другие морфологические изменения, характерные для эриптоза. Однако в ответ на увеличение внеклеточной oсмолярности или при истощении глюкозы у эритроцитов мышей, дефицитных по MСK1/2, определяют более высокую степень восприимчивости к эриптозу; наряду с этим регистрируют увеличенную хрупкость мембраны эритроцитов в ответ на уменьшение внеклеточной oсмолярности [173]. В недавнем исследовании показано, что циклинзависимая киназа 4 (ЦЗK4) представляет собой эффективный регулятор прогрессии клеточного цикла и транскрипции в ядросодержащих клетках [169], при этом установлено, что ЦЗК4 экспрессируется и в эритроцитах человека [183]. Использование различных фармакологических ингибиторов клеточных киназ на модели эритроцита позволило выяснить, что ЦЗK4 киназа принимает участие в эриптозе, вызванном окислительным стрессом или изоосмотическим уменьшением объема эритроцита при удалении внутриклеточных ионов хлора [183].

5. Рецепторы клеточной мембраны эритроцитов как регуляторы эриптоза

Выживание эритроцита, как и контроль его программируемой гибели, модулируется различными рецепторами, выраженными на клеточной мембране. Общая схема взаимосвязи этих важных молекулярных механизмов (см. разделы 3 и 4) с участием различных рецепторов представлена на рис. 5.

 

Рис. 5. Сигнальные молекулы и факторы, регулирующие эриптозную машину

 

В подробных исследованиях выявлено, что рецепторы глутамата эффективны в регулировании апоптоза нейронов [215]. Впоследствии было показано, что такие же рецепторы экспрессируются и на мембране эритроцитов [105]. При дальнейшем изучении неспецифичных катионных каналов, вовлеченных в эриптоз, была установлена высокая чувствительность эритроцитов к эриптозу при активации рецептора GluAl [105, 255]. Другой механизм, связывающий зависимую от рецептора активацию неспецифических катионных каналов с эриптозом эритроцитов, включает модуляцию рецептора стеинил-лейкотриена CysLT1 через цистеинил-лейкотриен C₄ [44]. Активация этих рецепторов не только ведет к увеличению концентрации внутриклеточных ионов Ca²⁺, но и стимулирует активацию каспазы 3 и 8 и, таким образом, позволяет выявить дихотомический эриптоз, включаемый как по Ca²⁺-зависимому, так и по Ca²⁺-независимому механизму [104].

В исследованиях, проведенных в первое десятилетилетие XXI в., установлено, что активация клеточных эффекторов в ядросодержащих клетках может быть смодулирована G-рецепторами белков, которые активируют гетеротримерные белки путем закрепления лиганда и, таким образом, осуществляют регулирование многих функций клетки, в том числе регулирование ионных каналов, клеточную дифференцировку, пролиферацию и программируемую гибель [130, 243]. Данные экспериментов последних лет подтверждают, что рецептор Gai2, как количественно преобладающая субъединица белка G, экспрессируется в эритроцитах не только крысы, но и человека [59]. В этой же работе в опытах на мышах, дефектных по гену Gai2, был продемонстрирован фенотип приглушенного эриптоза, сопряженного с восстановлением содержания ионов Ca²⁺, и выявлено уменьшение как активности сфингомиелиназы так и формирования церамида. Показано также, что эриптоз может регулироваться эндотелин-опосредуемым рецептором, так как эритроциты и человека и крысы экспрессируют В-рецептор эндотелина [106]. В экспериментах in vitro установлено, что обработка эритроцитов эндотелином 1 противодействует эриптозу, причем у мышей, дефектных по В-рецептору эндотелина, ускоряется клиренс эритроцитов. Таким образом, наглядно продемонстрирована связь активации рецептора лиганда с физиологической функцией предотвращения эриптоза эритроцитов [106].

6. Эритрофагоцитоз как терминальная стадия эриптоза

Установлено, что старые эритроциты обычно выводятся из кровообращения экстраваскулярным гемолизом, который реализуется определенными субпопуляциями макрофагов, преимущественно расположенными в селезенке и печени [164, 209]. Точный вклад этих двух органов в эритрофагоцитоз эритроцитов людей все еще обсуждается [65, 66]. Тем не менее исследования последнего десятилетия показали, что восприимчивость макрофагов печени к захвату эритроцитов преимущественно связана со стрессом или возникает при воспалительных заболеваниях [277, 280]. Однако неясно, могут ли субпопуляции макрофагов селезеночной красной пульпы и клетки Kупфера печени быть оборудованы механизмами, способными эффективно разложить без токсического эффекта такое большое количество восстановленного гема и освободившихся ионов железа [114, 165, 166].

Конкретные причины, по которым стареющие эритроциты выводятся из кровообращения через 120 дней после их выхода из костного мозга человека, все еще не ясны. Однако удаление стареющих эритроцитов наиболее вероятно представляет собой следствие нарушения их основных функций, то есть способности подвергаться деформации и изменениям поверхности клетки, что приводит к узнаванию таких дефектных эритроцитов макрофагами [97, 164, 210]. Проникновение стареющих эритроцитов через узкие продольные щели селезеночной красной пульпы, в результате пониженной способности подвергаться деформации, все более замедляется, и макрофаги со временем могут взаимодействовать с поверхностью эритроцита, в свою очередь увеличивая вероятность, что старые или поврежденные эритроциты будут действительно узнаны и удалены из кровообращения [276]. Было предложено несколько механизмов узнавания и восприимчивости фагоцитом стареющих эритроцитов [65, 164]. Все они принадлежат эволюционно хорошо сохраненным механизмам для узнавания макрофагами «чужого» и включают установленный рецепторами Fеy (FcyRs) или рецепторами комплемента (CRs) на макрофаге фагоцитоз, признавая Fc-домен иммуноглобулина IgG или фактора комплемента C_3b соответственно [97] (рис. 6). Как описано выше, старение эритроцита связано с включением изменений белка полосы 3, что приводит к закреплению естественных антител антиполосы 3 и рецептора комплемента C_3b на поверхности эритроцитов [31, 206]. При повышении уровня IgG и/или oпсонизированных C_3b на эритроцитах, совпадающих с приближением к возрасту 120 дней, как следствие, эти изменения затрагивают большое число рецепторов FcyRs и CRs у макрофагов, со временем их становится достаточно, чтобы вызвать эритрофагоцитоз [37, 205].

 

Рис. 6. Схема эритрофагоцитоза.

Примечание. Эритрофагоцитоз может стимулироваться рецепторами: FcyR, узнаваемыми IgG; рецептором комплемента СR, узнаваемым фактором комплемента С3b; LDL рецептором, связанным с белком LRP-1, узнаваемым рецептором кальретикулина (Crt); фосфатидилсериновым рецептором (ФС — PS), непосредственно связывающим фосфатидилсерин на эритроците или рецептором фосфатидилсерина на эритроците, связывающим промежуточные ФС белки, привязанные к опосредованному ФС-рецептору фагоцита. Ингибирующий рецептор SIRPα на фагоцитах связывается с CD47 на эритроцитах и может замедлять фагоцитоз, стимулируемый FcyR, CR или LRP-1

 

Наряду с кальций-зависимым механизмом эриптоза был предложен дополнительный рецептор-зависимый механизм, продемонстрированый при удалении стареющих эритроцитов. Один из его этапов — узнавание трансформированного фосфатидилсерина, перемещенного на поверхность эритроцита в результате расстройства асимметрии фосфолипидов мембраны [161, 251]. Исследователи установили, что фосфатидилсерин могут непосредственно узнавать многие рецепторы макрофага, включая стабилин-2, BAI1, Тim-1, Тim-4, CD300 [37, 97]. Все другие рецепторы, включая интегрины и рецептор Mer тирозинкиназы, могут узнавать фосфатидилсерин на поверхности клетки опросредованно через шунтирующие белки, связывающие фосфатидилсерин (MFG-E8, Gas 6, протеин S) (см. рис. 5). Однако восприимчивость фосфатидилсерина, вероятно, не главная особенность посреднической функции фагоцитоза для физиологически стареющих или поврежденных эритроцитов, а, скорее, механизм, чаще включаемый при фагоцитозе эриптозных эритроцитов [65, 112, 160, 170]. Фагоцитоз и жизнеспособность aпоптозных клеток, включая эритроциты, может определяться рецептором LDL, связанным с рецептором белка 1 (LRP-1/CD91), который узнает калретикулин (calreticulin) на поверхности клетки-мишени [118, 227].

Фагоцитоз макрофагов сильно зависит от рецепторов, ингибирующих фагоцитоз [273, 274], причем взаимодействие между адекватно экспрессированным рецептором CD47 на клетках-хозяевах (прежде всего эритроцитах) и рецептором SIRP на макрофагах хорошо изучено [232, 233]. Молекулярные детали, посредством которых взаимодействие рецепторов CD47-SIRP замедляет фагоцитоз, подробно рассмотрены в ряде обстоятельных работ [43, 232, 233]. Авторы других исследований подтвердили, что CD47-SIRP-взаимодействие замедляет фагоцитоз при участии рецепторов FcyRs и CRs, в то время как кальций-зависимый фагоцитоз нечувствителен к SIRP-опосредованному ингибированию [227, 233, 234, 278]. Нормальные циркулирующие эритроциты экспрессируют калретикулин на своей поверхности, при этом взаимодействие рецепторов LRP-1-калретикулина может вызвать фагоцитоз эритроцитов, если восстановлена передача блокирующих сигналов при взаимодействии CD47-SIRP [118, 227]. Профагоцитозная сигнализация во время фагоцитоза, опосредованного рецептором FcyR, или фагоцитоза oпсонизированных эритроцитов опосредованного рецептором CR уравновешиваются блокирующим сигналом посредством CD47-SIRP-взаимодействия, следовательно, суммарное взаимодействие этих сигналов детерминирует интенсивность фагоцитоза [234]. Таким образом, относительное количество рецепторов CD47 и IgG или C_3b на поверхности эритроцита определяет степень FcyR- или CR-опосредованного эритрофагоцитоза. Поэтому вначале было выдвинуто предположение, что восстановленное количество CD47 на стареющих или поврежденных эритроцитах могло быть единственным механизмом, облегчающим эритрофагоцитоз [278]. Однако, несмотря на то что восстановленное количество рецепторов CD47 было действительно найдено на эритроцитах крысы более старой фракции, до сих пор не опубликованы убедительные данные, дающих основание заявить, что эритроциты человека теряют рецептор CD47 в связи со старением при циркуляции в крови [110, 235]. Вместо этого было обнаружено, что рецептор CD47 испытывает при окислительном стрессе конформационные изменения, приводящие к закреплению плазменного белка тромбоспондина 1 на поверхности эритроцита и SIRP-зависимому узнаванию и фагоцитозу эритроцитов селезеночными макрофагами [74].

Ранее было установлено, что стареющие эритроциты предпочтительно узнаются и фагоцитируются макрофагами, расположенными в красной пульпе селезенки [114]. Как описано выше, соответствующие субпопуляции макрофагов оборудованы эффективными клеточными функциями, что позволяет им справляться с разложением значительного количества восстановленного гема и рециркуляции ионов железа [114, 165, 166]. В то время как был показан механизм удаления эриптозных эритроцитов мышей из кровообращения при помощи макрофагов селезенки [252], крайне мало данных о том, где именно в селезенке человека и какой субпопуляцией фагоцитов узнаются и удаляются эриптозные эритроциты человека. Однако известно, что крайняя зона селезенки, расположенная между богатой лимфоцитами белой пульпой и красной пульпой, через которую фильтруется кровь, представлена клетками уникального состава, которые, как установлено, выполняют особенные иммунологические функции [211].

Так, используя в качестве модели крысу и ионофор Ca²⁺, чтобы вызвать Са²⁺-зависимый эриптоз эритроцитов, A. Larsson et al. [194], недавно обнаружили, что эти поврежденные эритроциты быстро захватывают макрофаги и способные к фагоцитозу дендритные клетки (ДК), расположенные в крайней зоне селезенки с очень небольшим вкладом макрофагов красной пульпы. Причем в крайней зоне селезенки удалось идентифицировать две отдельные CDllc⁺ субпопуляции дендритных клеток: одна экспрессирует рецепторы CD8, CD103, CD205 и CD207, а у другой отсутствует экспрессия этих маркерных антигенов [142, 253]. Кроме того, A. Larsson et al. показали, что дендритные клетки, экспрессирующие CD8⁺ и CD207⁺, воспринимали эриптозные эритроциты намного эффективнее, чем клетки, испытывающие недостаток в экспрессии этих маркерных антигенов [194]. Однако удалось выявить, что эта же субпопуляция дендритных клеток, то есть имеющая рецепторы CD8⁺ и CD207⁺, захватывала и aпоптозные лимфоциты во время их прохода через крайнюю зону селезенки [142]. В отличие от замечаемых макрофагами эритроцитов с рецепторами IgG- или C₃-oпсонизированных эритроцитов, опосредованный дендритными клетками фагоцитоз неопсонизированных эриптозных клеток не замедлялся при взаимодействии рецепторов CD47-SIRP как in vitro, так и in vivo [194].

Поскольку доказано, что эриптозные клетки узнают те же самые субпопуляции фагоцитов, расположенные в крайней зоне селезенки, а фагоцитоз макрофагами эриптозных клеток in vitro требует узнавания фосфатидилсерина на поверхности эритроцита [212], это дает основание предположить, что узнавание и восприимчивость эриптозных клеток могут регулировать механизмы, сходные с механизмом узнавания aпоптозных ядросодержащих клеток.

В иммунологических исследованиях показано, что CD207⁺ — сильный антиген, представляющий фагоцитирующие клетки, которые могут вызвать сильную Т-клеточную иммунную реакцию или быть крайне важными для зависимой от T-клеток толерантности [41, 257, 274]. Различные субпопуляции дендритных клеток, как полагают ученые, вызывают иммунные реакции, ведущие к толерантности, которая частично определяется генерацией специфичных антигенов Т-регулирующих клеток [41, 274, 292]. Показано, что аутоиммунная гемолитическая анемия развивается в результате усиленной деструкции эритроцитов, вызванной антиэритроцитарными антителами, самостоятельно или в комбинации с активацией комплемента [44]. Следовательно, развитие аутоиммунной гемолитической анемии происходит в результате расстройства толерантности, но механизмы этих нарушений недостаточно ясны. Процесс аутоиммунной гемолитической анемии человека предполагает, что эта болезнь связана с сокращенным количеством регуляторных антиген-специфичных Т-клеток [44]. На модели экспериментальной аутоиммунной гемолитической анемии, где эритроциты крысы использовались при производстве перекрестнореагирующих антител и против эритроцитов и крысы, и мыши, механизмы толерантности обычно предотвращают развитие антител, перекрестно реагирующих с эритроцитами мыши у большинства мышей [175]. Однако в используемой модели сфера действия антикрысиных антител эритроцитов и аутоиммунной гемолитической анемии была увеличена с 30 до 90 % у мышей, исчерпавших антигены Т-регулирующих клеток. Это позволяет предположить, что антигены Т-регулирующих клеток действительно эффективны в контроле аутоиммунной гемолитической анемии [219]. Индоламин (2,3-диоксигеназа), как установлено, сильно стимулировал функцию толерантности дендритных клеток [132]. Можно также отметить, что индоламин влиял на толерантность и предотвращал гемолитическую болезнь в эритроцитах крысы при индуцибeльной аутоиммунной гемолитической анемии [81].

Активация рецепторов CD207⁺ дендритных клеток микробными антигенами и индукцией иммуногенности включает сильную обратную экспрессию MHC II класса и ко-стимулирующие молекулы (например, CD40 и CD86), тогда как вызывающая толерантность восприимчивость aпоптозных клеток приводит к весьма низкой обратной регуляции этих рецепторов [206]. В настоящее время имеются данные, что дендритные клетки селезенки, которые восприимчивы для эриптозных эритроцитов, имеют сравнительно увеличенную экспрессию CD86, но не CD40 или MHC II класса [212], что предполагает, что восприимчивость дендритных клеток к эриптозным клеткам могла привести к «полузрелому» фенотипу, связанному с восприимчивостью дендритными клетками aпоптозных эритроцитов [205]. Уже описана субпопуляция дендритных клеток с рецепторами CD207⁺ и CD8⁺, экспериментально найденная при фагоцитозе эриптозных клеток у мышей in vivo, которая способствует толерантности Т-клеток к аутоантигенам [215, 276]. Требуется, однако, выяснить, каким образом восприимчивость к эриптозным клеткам, поддерживающим толерантность дендритных клеток, необходима, чтобы добиться толерантности к антигенам эритроцитов. Возможная роль такой толерантности для эриптозных эритроцитов также должна быть исследована относительно воспалительных заболеваний, так как клеточное окружение оказывает значительное влияние на фенотип и функции дендритных клеток и других иммуноцитов [41, 292]. Поэтому дальнейшие иммунологические исследования в этой области могли бы дать весьма показательные данные для лучшего понимания механизмов расстройства толерантности и развития аутоиммунной гемолитической анемии, а также способствовать разработке новых способов поддержания толерантности к антигенам эритроцитов эритроцитсодержащих компонентов, используемых в трансфузиологии.

7. Патoфизиологические особенности эриптоза: роль в лекарственной терапии

В ходе многочисленных биохимических и иммунобиологических исследований установлено, что генетические дефекты синтеза гемоглобина сопровождаются различными патологиями человека: серповидно-клеточной анемией и β-талассемией, дефектами отдельных ферментов метаболизма эритроцитов, например дефицитом глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, или носителей, таких как анионит 1, связанных с повышенной уязвимостью эритроцитов к стимуляторам эриптоза [64, 247]. Ретроспективный генетический анализ показал, что в некоторых случах у членов семьи с повышенным эриптозом, была зарегистрирована мутация GLUT1, сопровождающаяся превращением переносчика глюкозы в кальций-проницаемый катионный канал [299]. Необходимо отметить, что увеличенный эриптоз наблюдается также при ряде общих заболеваний (табл. 2).

 

Таблица 2. Механизмы инициации эриптоза и заболевания, связанные с повышенным эриптозом

Механизм, инициирующий эриптоз	Заболевание	Источник
Увеличение внутриклеточной концентрации свободного Са2+	Гемолитическая анемия	45, 283, 291
	Аутоиммунная гемолитическая анемия	49, 219
	Гемолитический уремический синдром	191
	Железодефицитная анемия	129, 158, 220
	Малярия	62, 68, 298
	Почечная недостаточность	217
	Сердечная недостаточность	208
	Болезнь Паркинсона	244
Образование церамида	Болезнь Вилсона	185
	Гемолитическая анемия	45, 283
	Гемолитический уремический синдром	191
	Сепсис	156
	Токсическое действие свинца	23
Дополнительные механизмы (окислительный стресс, энергетическое истощение клеток, токсические вещества)	Гемолитическая анемия	45
	Диабет второго типа	70, 207
	Малярия	62, 270, 273
	Миелодисплатиеский синдром	48
	Микоплазменная инфекция	93
	Наследственный сфероцитоз	47
	Неоцитолиз	258, 259
	Пароксизмальная ночная гемоглобинурия	48
	Почечная недостаточность	217
	Сердечная недостаточность	208
	Серповидноклеточная анемия (мутация в гене НВВ)	149, 154, 155
	α- и β-талассемия (мутации в генах НВВ1(2) или в гене НВВ)	155, 188
	Истощение фосфатов	54
	Токсическое действие свинца	23, 32
	Токсическое действие ванадия	109
	Угнетающее действие зополрестата	72
	Угнетающее действие нитратов	123

 

Эриптоз, вызываемый гипертермией, очень чувствителен к изменениям температуры. В настоящее время доказано, что избыточный эриптоз наблюдается при дефиците железа, патологическом мочеиспускании, почечной недостаточности, сепсисе и гемолитическом уремическом синдроме. Анализируемые до сих пор гемолитические нарушения также сопровождаются избыточным эриптозом. Рассмотрим подробнее механизмы взаимосвязи эриптоза с отдельными заболеваниями человека.

1. Эриптоз предотвращает преждевременный гемолиз эритроцитов. Физиологически эриптоз в качестве первостепенной задачи, как упоминалось выше, сокращает преждевременный гемолиз травмированных эритроцитов и таким образом предотвращает осложнения, вызываемые повышенным содержанием гемоглобина в кровеносном русле [115], что, в свою очередь, приводит к нарушению функционирования почки и может способствовать осаждению кальция и вызвать окклюзию почечных канальцев [180, 185].

Кроме того, есть убедительное доказательство, что эриптоз может служить важным защитным механизмом против гемолиза, вызываемого малярией [68, 99] а также при серповидно-клеточной анемии [154]. При малярии усиленный эриптоз вызывает при кровообращении ускоренный клиренс эритроцитов, зараженных патогенным плазмодием [138]. Перестройка эритроцитов, необходимая для плазмодия, увеличивается окислительным стрессом, который модулирует деятельность множества ионных каналов, важных для внутриклеточного выживания этого патогена [90, 140]. В таких эритроцитах увеличенная активация каналов, проницаемых для Ca²⁺, способствует эриптозу и приводит к фагоцитозу не только клеток хозяина, но и патогена [99]. Действительно, эксперименты на животных показали, что целый ряд фармакологических агентов, модулирующих эриптоз, оказывает благоприятное воздействие на клинический курс лечения малярии [150]. Увеличенный эриптоз также зарегистрирован при повышении устойчивости к малярии, наблюдаемой при дефиците глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы, β-талассемии и серповидно-клеточной анемии [190].

2. Эриптоз и неоцитолиз. Эриптоз — эффективный механизм удаления чрезмерного количества эритроцитов из кровообращения. Установлено, что хорошо регистрируемое экспонирование фосфатидилсерина у эритроцитов наблюдается при истинной полицитемии [113], причем это явление сопутствует срыву вредных последствий увеличенных уровней гематокрита, а также высоким рискам сердечно-сосудистых тромбозов [279]. Увеличение гибели молодых эритроцитов (неоцитов) у альпинистов, людей высокогорья и космонавтов было зарегистрировано как особое явление, которое назвали неоцитолизом [259]. Согласно исследованиям in vitro, неоциты оказались более чувствительными к присутствию сигналов выживания, таких как высокие уровни эритропоэтина в плазме, по сравнению с другими подтипами эритроцитов. Этот эффект может способствовать быстрому выводу из кровообращения неоцитов in vivo. Есть ли у неоцитолиза молодых эритроцитов механизм цитолиза, перекрывающийся с эриптозом, остается пока неустановленным [258].

3. Эриптоз как элемент патогенеза анемии. Самая важная патология эритроцитов — анемия, определяемая как условие концентрации гемоглобина, гематокрита или индексов эритроцита ниже двух среднеквадратичных отклонений от возрастных средств. С клинической точки зрения анемия классифицируется по трем патофизиологическим этиологиям: 1) уменьшенное производство эритроцитов при эритропоэзе, 2) потеря крови, 3) увеличенная деструкция эритроцитов в периферийном кровообращении. Последняя категория (то есть капиллярное кровообращение) прежде всего охватывает плохо регистриуемый гемолиз [83, 144, 167, 213].

Эриптозные клетки быстро удаляются из кровообращения путем их захвата и поглощения макрофагами. Пока увеличенный эриптоз компенсирует подобный уровень эритропоэза, число эритроцитов в циркулирующей крови может оставаться постоянным [180, 184, 186]. Поскольку генерация новых эритроцитов происходит вследствие появления ретикулоцитов в периферической крови, увеличенный ретикулоцитоз может свидетельствовать о присутствии ускоренного эриптоза даже при нормальных индексах циркулирующих эритроцитов в сосудах. Однако если физиологический эритропоэз не в состоянии уравновесить ускоренную потерю эритроцитов вследствие эриптоза, может последовать клинически регистрируемая анемия [180, 184, 186].

В прошедшем десятилетии клинические исследования на популяциях людей разных рас, так же как при моделировании болезней в экспериментальных условиях привели к более глубокому пониманию системных условий [291], связанных с анемией. Однако перечень этих условий может быть усложнен, если принять во внимание религиозные предрассудки и особенности ускоренного эриптоза.

4. Расстройство капиллярного кровообращения и противосвертывающий феномен эриптоза. В опубликованных ранее работах приводятся доказательства, подтверждающие наличие у эриптозных эритроцитах повышенной склонности к адгезии к эндотелиальным клеткам, подобно тромбоцитам, которые потенциально могут препятствовать капиллярному кровообращению из-за способности к тромбозу вследствие особенностей фенотипа [19, 67, 293]. Эриптозные эритроциты, подвергающиеся действию ионов Са²⁺ на их мембранах, могут взаимодействовать с поверхностными рецепторами на эндотелиальных клетках и тромбоцитах, таких как трансмембранный лиганд CXC хемокина CXCL16, известного как CXCL16/SR-PSOX [67]. Хемокин CXCL16 в связанной форме в эндотелиальных клетках служит фагоцитарным рецептором со сродством к фосфатидилсерину, так же как окисленные, имеющие малую плотность липопротеины [136]. Эндотелиальный CXCL16, как установлено, крайне важен для прилипания лейкоцитов в процессе циркуляции, он же способствует прилипанию моноцита к эндотелию сосудов в местах атеросклеротических повреждений [266]. Увеличенное прилипание эриптозных эритроцитов может сопутствовать параллельным изменениям в атеросклеротических повреждениях и способствовать тромбозным сосудистым осложнениям [293]. Кроме того, показано, что в процесс прилипания эритроцитов к эндотелиальным клеткам могут быть включены дополнительные молекулы, такие как эндотелиальный CD36 и тромбоспондин [294]. Также независимое от фосфатидилсерина прилипание эритроцитов может происходить через взаимодействие между ICAM-4 и эндотелиальными интегринами a_vp₃ [133] и ламинином a₅ [297]. Участвуют ли фосфатидилсерин-зависимые взаимодействия в прилипании эриптозных эритроцитов к эндотелиальным клеткам? Для окончательного ответа требуются дальнейшие исследования.

Тромбоциты, как и эндотелиальные клетки, также экспрессируют CXCL16, по которому выявляется их активация, то есть переводят сосудистое воспаление на тромбо-связанные события при различных болезнях [39, 293]. Тромбоциты, как известно, экспрессируют и рецептор CD36 [38], как ранее мы упоминали, он взаимодействует с фосфатидилсерином [192, 223]. Эксперимент продемонстрировал, что экспонирование фосфатидилсерина эриптозными эритроцитами приводит к взаимодействию с рецепторами тромбоцитов CXCL16 и CD36 и, следовательно, показывает увеличенную адгезию остановленным тромбоцитам в процессе циркуляции [293]. Это взаимодействие может усилить ускоренное формирование тромба при условии гиперсвертываемости, связанной с различными клиническими растройствами, например печеночной недостаточностью [303] и хронической болезнью почек [117, 304]. Интересно, что при моделировании вызванного хлорным железом тромбоза эритроциты способствуют доставке тромбоцитов к месту повреждения [46]. Таким образом, эти исследования подтверждают тезис о том, что эритроциты активно способствуют патофизиологии тромбоза. Однако вклад эриптозных эритроцитов, в противоположность здоровым эритроцитам, в формирование тромба требует дальнейших доказательств.

Растущий объем данных предполагает, что эритроциты, вследствие их биохимических и биофизических свойств, могут активно способствовать патофизиологии гиперсвертываемости при различных клинических условиях [29]. Экспонирование фосфатидилсерина на клеточной мембране эритроцита служит платформой для сборки протромбиназы и комплексных соединений теназы, они, в свою очередь, стимулируют генерацию тромбина и свертывание и таким образом проявляют особые свертывающие эффекты эриптозных эритроцитов [250]. Экспонирование фосфатидилсерина может также стимулировать факторы свертывания крови V и X, что, как известно, вызывает гиперкоагуляцию [265, 311]. Было продемонстрировано, что увеличенное экспонирование фосфатидилсерина на поверхности эритроцита способствует внутрисосудистой коагуляции при уремии [191], сепсисе, вызванном Pseudomonas aeruginosa [250], β-талассемии [40, 77] и интоксикации свинцом [32]. Микрочастицы, полученные из различных клеток, включая эритроциты, продемонстрировали дополнительный свертывающий эпитоп на поверхности фосфолипида за счет сборки свертывающих комплексных соединений фермента и генерации тромбина [39, 121]. Кроме того, недавно было установлено, что активный выпуск микропузырьков в процессе эриптоза при усиленном внутриклеточном поступлении ионов Ca²⁺ и активации PЭC может вызвать перекрытие механизмов, диктующих микровезикуляцию мембраны эритроцита и эриптоз [225].

5. Эриптоз при хронической почечной недостаточности. Известно, что хроническая болезнь почек (ХБП) сопровождается анемией и в значительной степени связана с ослабленным выпуском из почек эритропоэтина [200]. Анемия у пациентов ХБП может впоследствии вызывать дефицит железа [69]. Более современные данные, однако, свидетельствуют, что увеличенный эриптоз эритроцитов у пациентов с ХБП способствует восстанавлению продолжительности жизни эритроцитов при кровообращении [24, 55, 176]. Согласно исследованиям in vitro, уремические токсины, такие как ванадат [109], метилглиоксаль [226], акролеин [22] и сульфат индоксила [117], модифицируют эриптоз. Кроме того, смерть эритроцитов (эриптоз) при ХБП сопровождается высокими плазменными концентрациями фосфора [290]. Однако терапевтические вмешательства (например, гемодиализ) не оказывали влияния на течение эриптоза, но удаляли при этом эритроциты, уязвимые для некроза [55]. С точки зрения механики кровообращения, эритроциты пациентов ХБП усиленно накапливали АФК [24] и уменьшали уровень глютаминил-цистеинил-глицина [119], который, как установлено, может способствовать усиленному эриптозу. Поскольку эритропоэтин при эриптозе замедляет неспецифичные катионные каналы [217], применение эритропоэтина для пациентов ХБП может не только стимулировать эритропоэз, но и усилить выживание эритроцитов, противодействуя тем самим преждевременному старению эритроцитов.

6. Эриптоз при печеночной недостаточности. Нарушение функций печени и фиброз обычно связаны с различной степенью анемии, которая может развиться из-за многих связанных друг с другом условий, таких как геморрагические кровоизлияния, злокачественность, вирусные инфекции, хроническое воспаление и дефицит эфирных питательных веществ, включая витамин B₁₂ и фолат [180, 209]. Анемия при отказе печени может быть вызвана ускоренной запрограммированной смертью эритроцитов, которую связывают с высоким уровнем билирубина [176]. Повышенный уровень связанного билирубина в крови увеличивает формирование церамида и активности цитозольного кальция, которые, в свою очередь, приводят к увеличенному экспонированию фосфатидилсерина с последующим выводом из кровотока циркулирующих эритроцитов. В ходе натурных экспериментов на желчном протоке мышей через три недели после операции в эритроцитах мышей было зарегистрировано уменьшение индекса эритроцитов, гематокрита и понижение уровня гемоглобина — эти изменения сопоставимы с увеличенным клиренсом эриптозных эритроцитов [176]. В других работах показано, что повышенные плазменные уровни гликoханодезоксихолевой и таурoханoдезоксихолевой желчных кислот при холестазе сопровождаются гемолизом, так же как увеличением внутриклеточной концентрации ионов Ca²⁺, формированием церамида и экспонированием фосфатидилсерина на мембране эритроцитов [178, 303]. Таким образом, одномоментное действие нескольких факторов [185] при заболеваниях печени может способствовать анемии и сокращенной продолжительности жизни циркулирующих эритроцитов.

Эриптоз зарегистрирован как фактор, играющий важную роль в патофизиологии анемии при болезни Вилсона, — генетическом отклонении, при котором происходит накопление в клетках ионов Cu²⁺, приводящих к циррозу печени [193]. Проявление эриптоза при этом условии продемонстрировано повышенным содержанием сфингомиелиназы в плазме и формированием церамидов не только в эритроцитах, но и в гепатоцитах [193]. Фармакологическое ингибирование или генетический дефицит сфингомиелиназы позволили уменьшить эриптоз и продлить жизнь крыс, склонных к болезни Вилсона. Примечательно, что Cu^{2 +}-зависимые окислители, вызывающие повреждение клеток при болезни Вилсона, могут способствовать, по крайней мере частично, восстановлению показателей выживаемости эритроцитов [193].

7. Эриптоз при сепсисе. Сепсис — потенциально опасное для жизни человека состояние, вызванное обширным многофакторным ответом на инфекцию [262]. При этом у пациентов с тяжелым сепсисом наблюдается выраженная анемия [25]. Имеются убедительные доказательства, что связанная с сепсисом анемия может следовать за усиленным эриптозом эритроцитов [156]. Повышенный уровень эриптоза при сепсисе может быть вызван поступающими в кровоток бактериальными токсинами. Они состоят из пептидогликанов, гемолизинов, пиоцианинов и листериолизинов [98, 107, 250, 286]. Эриптоз при сепсисе сопровождается усиленным формированием эритроцитами церамида и повышением активности внутриклеточных ионов Ca²⁺ [156, 250]. В эксперименте показано, что фактор токсичности пиоцианина усиливается благодаря накоплению АФК в эритроцитах крысы и сопровождается ускоренным клиренсом эритроцитов при циркуляции [250]. Примечательно, что бактериальные пептидогликаны способствуют прилипанию эриптозных эритроцитов к стенке сосудов за счет молекулы CXCL16/SR-PSOX [19, 67]. В модельном эксперименте показано, что усиленный эриптоз, связанный с сепсисом, может ухудшать микроциркуляцию периферической крови [137].

8. Эриптоз эритроцитов при канцерогенезе. С анемией обычно сталкиваются на различных стадиях канцерогенеза, она может возникнуть вследствие потери крови при оперативном вмешательстве, ослабленном эритропоэзе из-за уменьшенного образования эритропоэтина, снижении эффективности эритропоэтина, дефиците питательных веществ [60, 120, 122]. В недавнем обзоре взаимосвязи анемии и эриптоза отмечено, что при анемии больных раком легких этот процесс может быть сравним с увеличением в эритроцитах активности цитозольного Ca²⁺, генерации церамида, образования АФК и экспонирования фосфатидилсерина [60, 120, 195]. Кроме того, в патогенезе злокачественных новообразований анемии могут вызвать неблагоприятные эффекты после применения цитостатиков [180]. Многочисленные исследования in vitro и in vivo показали, что применение многих химиотерапевтических агентов, включая клофазимин, митоксантрон, блебистатин, руксолитиниб, oксалоплатину, топотекан, регорафениб, оридонин, пицетанол и бипазопаниб, вызывают эриптоз и могут, таким образом, усилить анемию у раковых больных [35, 57, 73, 92, 147, 182, 230, 268, 269, 309].

В эксперименте показано, что мутации гена, связанные с нарушением функции Adenomatous Polyposis Coli (АРС), приводят к многочисленным aденоматозным полипам в толстом кишечнике, что, в конечном счете, становится причиной карциномы ободочной кишки [162]. Мыши, несущие дефектный ген APC, чаще страдают от кишечных опухолей, сравнимых с тяжелой анемией [135, 199]. Вообще принято считать, что анемия у таких мышей развивается в результате кишечных кровоизлияний, а эритроциты этих мышей проявляют повышенную уязвимость для эриптоза [252]. Установлено, что у таких мышей наблюдается увеличенный клиренс эритроцитов, способствующий возникновению серьезной спленомегалии [252]. Авторы исследований обсуждают механизмы, приводящие к усилению эриптоза, но, очевидно, не включают в их число увеличенную активность внутриклеточных ионов Ca²⁺, так как эритроциты от APC-дефектных мышей восстанавливали уровни ATФ, что указывает на эриптоз эритроцитов, чувствительный к энергетической неустойчивости [252].

При миелодисплатическом синдроме (MДС) появляется клоновая неупорядочность, характеризуемая цитопенией с последующим развитием неэффективного гемопоэза и появлением поврежденных эритроцитов, которая усиливается окислительным стрессом и экспонированием фосфатидилсерина [275]. В отличие от эритроцитов здоровых людей, экспонирование фосфатидилсерина на мембране эритроцитов от пациентов MДС происходит преимущественно у молодых из-за преобладания фракции легких эритроцитов [48, 275]. Примечательно, что у молодых эритроцитов от пациентов с MДС, как установлено, увеличивалось появление гликофорина на поверхности клеток, которое может маскировать усиленное экспонирование фосфатидилсерина и таким образом противодействовать преждевременному фагоцитозу [48]. Стимулируемый эриптоз может участвовать в патофизиологии хронической анемии, развивающейся при синдроме МДС. Особенно часто MДС усложняется повышением тромбообразования. Поэтому можно предположить, что увеличенный эриптоз эритроцитов при MДС способствует повышению риска развития тромбозов [171].

9. Эриптоз при сердечной недостаточности, ожирении, диабете. Известно, что анемия распространена при сердечной недостаточности и может отрицательно воздействовать на исход болезни [282]. Патогенез анемии в таком случае может включать воспаление, ослабление почечной функции и дефицит железа [220, 291]. Последние исследования указывают на увеличенный эриптоз как основной механизм анемии, связанной с сердечной недостаточностью [20]. У пациентов, страдающих от остановки сердца, обнаружили повышенное количество эритроцитов с экспонированием фосфатидилсерина и уменьшенным объемом клетки [10, 20]. Кроме того, эритроциты этих пациентов показали увеличенную генерацию АФК, что может способствовать увеличенному эриптозу [20]. Примечательно, что повышенный (не увеличенный) окислительный стресс — особенность патологии остановки сердца [58, 221] — может вызвать повреждение эритроцитов и эриптоз.

Тяжелая форма ожирения связана с повышенным риском тромбозов [61]. Точные механизмы этой связи пока полностью не выяснены. Увеличенная агрегация эритроцитов и уменьшенная способность подвергаться деформации эритроцитов пациентов с ожирением, как полагают, вызывают не только реологические нарушения крови, но и гиперсвертываемость [271]. В предыдущих исследованиях этих авторов экспонирование фосфатидилсерина на эритроцитах было значительно выше у пациентов с более высоким индексом массы тела по сравнению со здоровыми людьми, что дает основания предполагать, что эриптоз может участвовать в гиперсвертываемости, связанной с ожирением [272]. Кроме того, показатель маркерного антигена CD47 старения эритроцита был достаточно высоким у пациентов с ожирением [301, 302]. Поразительно, что дисфункцию эритроцита и мембранную трансформацию фосфатидилсерина продемонстрировали и мыши, в течение длительного периода питавшиеся пищей с высоким содержанием жира [282]. Это исследование показало увеличенную селезеночную восприимчивость к промаркированным эритроцитам, полученных от мышей, которых кормили пищей с высоким содержанием жира, по сравнению с мышами, находившимися на сбалансированной диете [282]. У мышей, находившихся на диете с повышенным содержанием жира, зарегистрировали эндотелиальную дисфункцию вместе с увеличенным прилипанием макрофагов к эндотелиальным клеткам [282], что подчеркивает важность патологической связи между эритроцитом и эндотелиальной дисфункцией, а также активацией макрофагов при ожирении.

У пациентов с диабетом было зарегистрировано повышенное количество (в процентном соотношении) эритроцитов с экспонированным фосфатидилсерином при кровообращении [180]. Недавно показано, что определение маркеров эриптоза может служить важным диагностическим признаком для больных диабетом 2-го типа [159]. Эриптозный фенотип связан, по крайней мере частично, с наличием в плазме увеличенной концентрации дикарбонильного соединения метилглиоксаля, побочного продукта гликолиза. Исследования in vitro показали, что обработка клеток метилглиоксалем снижает содержание цитозольного ATФ в эритроците и концентрацию глютаминил-цистеинил-глицина, но не вызывает увеличения внутриклеточных ионов Ca²⁺ [226]. При сердечно-сосудистых осложнениях диабета отмечена положительная корреляция со снижением антиоксидантной защиты [70, 241, 242, 272]. У эритроцитов от пациентов с диабетом регистрируют увеличенную активность перекиси дисмутазы и образования АФК [218] — факторов, которые способствуют трансформации фосфолипида клеточной мембраны эритроцита. Кроме того, глютатион-индуцированное ускоренное старение эритроцитов, вызванное высокими внеклеточными концентрациями глюкозы в эксперименте in vitrо, сопровождается увеличением содержания внутриклеточных ионов Ca²⁺ и повышенной активностью катионного канала, это позволяет предположить, что гипергликемия оказывает существенное влияние на продолжительность жизни эритроцита [170]. Однако Ca²⁺-независимые механизмы, например активация каспазы 3, также могут участвовать в проявлении дисфункции эритроцитов при диабете [207].

Известно, что железо является обязательным элементом для синтеза гемоглобина, его дефицит — одно из наиболее распространенных нарушений рациона [254]. Следовательно, пищевой дисбаланс также может влиять на продолжительность жизни эритроцита. Так, в модельном эксперименте у мышей с дефицитом железа в эритроцитах зарегистрировали увеличенное экспонирование фосфатидилсерина, уменьшение объема клетки и усиление активности внутриклеточных ионов Ca²⁺ [158]. Показано, что железодефицитная анемия связана с увеличенным экспонированием фосфатидилсерина эритроцитов при окислительном стрессе [220]. Следовательно, окислительный стресс может быть фактором, способствующим восстановлению продолжительности жизни эритроцита при дефиците железа. Кроме того, недостаток витамина D также может оказывать влияние на выживание эритроцита. В эритроцитах мышей, получавших пищу, богатую витамином D, регистрировали усиление чувствительности к эриптозу после экспонирования их к осмотическому шоку и энергетическому истощению [175]. Примечательно, что в крови мышей, получавших в рационе витамин D, обнаружили уменьшение индексов ретикулоцитов, так же как восстановленное производство эритропоэтина [175]. Эти факты дают основание предположить, с другой стороны, что чрезмерное потребление витамина D сенсибилизирует эритроциты к эриптозу, вызванному стрессорами клетки. С другой стороны, дополнение пищи витамином С повышало защиту от увеличенного окислительного стресса и эриптоза при дефиците глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы [267]. Следовательно, можно согласиться с мнением авторов этих работ, что рацион питания человека влияет на продолжительность жизни эритроцита и его функции.

10. Эриптоз при хронических воспалительных заболеваниях. В ходе эпидемиологических исследований установлено, что воспаление — одна из наиболее распространенных причин анемии у пожилых и имеющих хронические заболевания людей. Анемия при воспалительных заболеваниях развивается в значительной степени из-за ослабленного гомеостаза железа и подавления эритропоэза провоспалительными цитокинами [111]. Провоспалительные цитокины, как показали недавние исследования, вызывали изменения мембраны эритроцита, напоминавшие эриптоз [53]. Установлено также, что при воспалительных заболеваниях нарушается ряд функций эритроцитов, что приводит их к эриптозу [240].

Артрит — воспалительное заболевание стенки сосудов — вызывает сосудистую окклюзию и сопровождается анемией [127]. Недавнее исследование продемонстрировало, что анемия у пациентов с артритом должна, по крайней мере частично, вызывать усиленный эриптоз [58]. Увеличенный эриптоз сравним с усиленным окислительным стрессом и повышенным показателем внутриклеточных ионов Ca²⁺ [56]. Заманчиво предположить, что увеличенное прилипание эриптозных эритроцитов к клеткам эндотелия сосудов может способствовать патофизиологии сосудистой окклюзии и ишемии у пациентов с артритом.

Анемия характерна приблизительно для 50 % пациентов с аутоиммунным заболеванием — системной красной волчанкой (СКВ) [126]. Анемия при СКВ имеет многофакторную этиологию и может быть вызвана аутоиммунной деструкцией эритроцитов. Кроме того, определена субпопуляция пациентов СКВ, имеющая антитела против эритропоэтина, которые смягчают нормальное производство эритроцитов [126]. Анемия в СКВ может быть также вызвана уменьшенной продолжительностью жизни эритроцита, поскольку значительно большее число циркулирующих эритроцитов имеют фосфатидилсерин на мембранах [126]. Кроме того, у больных СКВ отмечается увеличенный ретикулоцитоз и обратная регуляция активности внутриклеточных ионов Ca²⁺ и образования АФК [126]. Увеличенный эриптоз является, таким образом, элементом патофизиологии анемии при СКВ [145].

11. Эриптоз при гемолитическом уремическом синдроме. Гемолитический уремический синдром (ГУС) проявляется как осложнение после выброса бактериального токсина, который впоследствии вызывает гемолитическую анемию, тромбоцитопению и острое повреждение почки [89]. Нехватка инактивирующего фактора H была предложена в качестве механизма, лежащего в основе развития ГУС [89]. При инкубации эритроцитов в экспериментах in vitro в плазме ГУС, лишенной фактора H, чтобы показать активацию комплемента для выявления экспонирования фосфатидилсерина, увеличения активности цитозольного Ca²⁺, формирования церамида и уменьшения объема клетки, что позволяет предположить, что потеря целостности клеточной мембраны эритроцитов и гемолиз у больных ГУС сопровождается усиленным эриптозом [191]. Таким образом, даже вне чрезмерного гемолиза увеличенный эриптоз может способствовать функциональной патологии эритроцитов и усилению анемии у пациентов с ГУС.

12. Эриптоз эритроцитов у пожилых людей. Распространенность анемии среди пожилых людей увеличивается с возрастом и составляет 50 % от общей популяции людей старше 80 лет [36, 131]. В большинстве случаев присутствие у людей пожилого возраста иных факторов может путать этиологию анемии. Так, недавно сообщили, что содержание подвергнутых действию фосфатидилсерина эритроцитов значительно выше у пожилых людей и корелирует с увеличенным окислительным стрессом [204]. Однако увеличенный эриптоз у пожилых несопоставим с увеличенной активностью внутриклеточных ионов Ca²⁺ и образованием церамида [204]. Примечательно, что об увеличенном эриптозе сообщили при исследовании мышей, дефектных по белку Клото, известному мембранному белку молодости, который вырабатывается в сальниках паращитовидной железы, почке и сплетении сосудистой оболочки [157]. Дефектные по белку Kлото мыши использовались в качестве экспериментальной модели для изучения ускоренного старения животных [157]. Эритроциты этих мышей демонстрируют явную чувствительность к эриптозу, вызванному энергетическим истощением и окислительным стрессом. У этих мышей также регистрируется ускоренная циркуляция эритроцитов. Дефицит белка Клото на эритроцитах можно было частично нивелировать диетой, богатой витамином D [157]. Кроме того, эритроциты мышей с мутацией по митохондриальной ДНК (прогероидной моделью) демонстрируют аберрантное поглощение железа и окислительный стресс, так же как блокирование выброса митохондрий во время эритропоэза, приводящее клетки к преждевременной смерти [21]. Таким образом, убедительные данные многочисленных исследований на человеке и на на экспериментальных животных подтверждают, что эриптоз, по крайней мере частично, способствует развитию анемии, связанной со старением.

13. Эриптоз эритроцитов и трансфузиология. В публикациях последних лет была продемонстрирована корреляция между экспозицией фосфатидилсерина, физиологическими особенностями донора и параметрами качества эритроцитсодержащих компонентов крови, указывающих на то, что экспозиция фосфатидилсерина может быть биологически значимым параметром качества компонентов [65, 70, 85, 249]. Эти данные подчеркивают необходимость изучения механизмов, стимулирующих экстернализацию фосфатидилсерина на эритроцитах при их циркуляции в крови. Знания об этом могут способствовать разработке методов улучшения выживаемости эритроцитов при хранении и после переливания крови, а также целевому выбору эритроцитных взвесей или концентратов эритроцитов и даже доноров для конкретных групп пациентов. В отдельных работах было высказано предположение, что эритроцит-содержащие компоненты крови с высоким содержанием гемоглобина следует переливать вместе с большим объемом крови [238]. Причем целесообразно подбирать компоненты с наименьшей экстернализацией фосфатидилсерина для пациентов с многократными переливаниями и для больных с выраженной анемией или удалить эритроциты, которые восприимчивы к стресс-индуцированному воздействию. Это было бы полезно, особенно для пациентов с многократными переливаниями, так как сокращение числа быстро удаляемых поврежденных эритроцитов привело бы к повышению эффективности переливания и значительному снижению скорости накопления железа и патологической активации иммунной системы больного [210, 306].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Эриптоз (мембраносвязанный апоптоз) — фундаментальный процесс клеточной смерти эритроцитов, который, подобно апоптозу ядросодержащих клеток, характеризуется определенными морфологическими изменениями, включая сокращение объема клетки, везикуляцию мембраны и расстройство мембранной асимметрии фосфолипидов, приводящие к экспонированию фосфатидилсерина — основного рецептора для фагоцитов. Физиологически эриптоз предназначен для быстрого устранения травмированных и поврежденных эритроцитов, чтобы предотвратить их преждевременный гемолиз в сосудистом русле и накопление внеклеточного гемоглобина в циркулирующей крови. Чрезмерный эриптоз связан с рядом болезненных состояний человека, включая сахарный диабет, печеночную недостаточность, уремию, гемолитический уремический синдром, сердечную недостаточность, рак, сепсис и хроническое воспаление (рис. 7).

 

Рис. 7. Обобщенная схема взаимосвязи эриптоза и анемии с болезнями человека

 

Эриптоз вызывается различными патофизиологическими стрессорами клетки и организован сложной машиной, включающей ионные каналы, мембранные белки и клеточные ферменты (см. рис. 1 и 2). Фагоциты (макрофаги и дендритные клетки) узнают и поглощают эриптозные эритроциты, они подвергаются разложению в ретикулоэндотелиальной системе. Этот процесс включает точно определенную, пока еще не вполне понятную молекулярную перекрестную связь между эритроцитами и фагоцитирующими клетками (см. рис. 6). Необходимы дополнительные экспериментальные усилия для получения точных ответов и понимания действия ключевых эпитопов сигнальных молекул и путей, регулирующих эриптозную машину. Кроме того, несмотря на уже достигнутые определенные успехи, все еще остается много неизвестного относительно способности эриптозных эритроцитов модулировать клетки врожденной и адаптивной иммунной системы и их способности воздействовать на аутоиммунные механизмы человека и механизм толерантности. Наконец, очень важно, чтобы будущие исследования позволили точно установить, являются ли методы лечения, основанные на механизме эриптоза и направленные на противодействие ему, действенной стратегией для преодоления анемии, расстройства микроциркуляции и предотвращения тромбозов, которые, как уже установлено, связаны с различными заболеваниями.

About the authors

Vladimir I. Vaschenko

S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: vaschenko@yandex.ru

Dr. Biol. Sci., Chief, Lab. Department Centre of Blood and Tissues

Russian Federation, Saint Petersburg

Vladimir N. Vil’yaninov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: vilyaninov@mail.ru

PhD, Head, Centre of Blood and Tissues

Russian Federation, Saint Petersburg

References