Lipid-lowering and anti-atherosclerotic activity of the natural original enzyme preparation in the experiment

Cover Page

Abstract


The experimental large-scale investigation in vitro and in vivo is devoted to the results of a long-term study of the biological, lipid-lowering and anti-atherosclerotic activity of the original natural microbial enzyme preparation of cholesterol oxidase (CHO). In chronic experiments (rats, rabbits, dogs), low toxicity, good tolerability, and anti-atherosclerotic activity of the CHO preparation were established. To assess the effect of CHO in conditions of moderate nutritional dyslipoproteinemia, experiments were carried out in 3 species of animals (rats, guinea pigs, rabbits). It was shown the pronounced lipid-lowering effect of CHO in modeling dyslipoproteinemia.


Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что развитие атеросклероза (АС) вызывает появление наиболее серьезных клинических осложнений (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, инсульт), которые приводят к инвалидности и высокой смертности больных сердечно-сосудистыми заболеваниями [3, 5]. Одной из причин коморбидного патогенеза АС является накопление в организме человека избыточного количества холестерина (ХС) в артериальной стенке (атеросклеротические повреждения) и в крови — в виде атерогенной дислипопротеинемии (ДЛП). Известно, что атерогенная ДЛП относится к ведущему, но модифицируемому фактору риска АС. Для лечения АС и ДЛП применяются немногочисленные гиполипидемические препараты, имеющие серьезные побочные эффекты. Помимо использования липидснижающих средств профилактики АС необходимо сокращать поступление ХС с пищей, то есть больным рекомендуется употреблять продукты с низким содержанием ХС. Данные ряда популяционных исследований показывают, что существует прямая корреляционная связь между количеством ХС в пище и уровнем ХС в крови, поэтому ограничение приема пищевого ХС — необходимый шаг перед началом интенсивной фармакотерапии АС. Следует подчеркнуть, что уменьшать количество ХС можно и путем его повышенного выведения из организма. Это происходит после длительного приема синтетического сорбента холестирамина в дозе 18–24 г в день, но это крайне неудобно для пациента, так как вызывает выраженные нарушения деятельности желудочно-кишечного тракта. Следовательно, по-прежнему актуален направленный поиск биологически активных веществ различного происхождения, которые корректируют нарушение липидного обмена, особенно среди соединений, близких естественным метаболитам организма. С этой целью применяются как природные ферменты, так и препараты, полученные биотехнологическим путем. Препараты ферментов — амилазы, липоксигеназы, липазы, галактозидазы, пектиназы, пепсина и многих других — находят широкое применение в пищевой промышленности и медицинской практике. Эти ферменты являются действительно высоко активными, а главное, нетоксичными катализаторами, которые обладают исключительной субстратной специфичностью, без них в организме невозможны многие жизненно важные биохимические процессы. Например, при инфаркте миокарда весьма информативны диагностические пробы с ферментами аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ) и КФ (креатинфосфат). Лактат и глюкозооксидаза используются для определения концентрации глюкозы в крови и моче. Липазы требуются для гидролиза жиров и эфиров жирных кислот. Препарат фермента супероксиддисмутазы применяют в качестве метаболического средства для лечения гипоксии, болезней сердца, при трансплантации почек. Протеолитические ферменты (стрептокиназа, урокиназа) необходимы для растворения тромбов, удаления из организма токсических веществ [1, 2].

Источником фермента холестериноксидазы (ХСО) [EC1. 1. 3. 6. ] являются бактерии Streptomices lavendulae. ХСО относится к классу оксидоредуктаз, имеет молекулярную массу 55 кДа и катализирует окислительно-восстановительные реакции, в частности окисление гидроксильного радикала ХС в положении С3 с образованием кетона (холест-4-ен-3-он) и перекиси водорода. ХСО применяют в лабораторной диагностике для определения в сыворотке крови уровня общего ХС и ХС липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). В научной литературе отмечен значительный интерес к проблемам, связанным с изучением модификаций ХСО. Современное биотехнологическое применение ХСО, получаемой из различных источников, ее новые физико-химические, биологические и физиологические свойства активно изучаются во многих зарубежных лабораториях [2, 4, 6, 8].

Наше внимание привлек оригинальный отечественный препарат фермента ХСО природного происхождения. Технология получения субстрации ХСО из Streptomices lavendulae штамм ВКМА-5921 почвенного происхождения была разработана в Институте антибиотиков и ферментов медицинского назначения (Санкт-Петербург).

Цель исследования — выявить биологическую активность, гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действие бактериального ферментного препарата ХСО из источника (Streptomices lavendulae штамм ВКМА-5921) в модельных опытах in vitro и in vivo.

МЕТОДИКА

Экспериментальные исследования проведены в два этапа. Первый, начальный этап был необходим для выявления специфического действия ХСО. Второй этап посвящен задаче определения влияния ХСО на развитие умеренно высокой ДЛП в модельных опытах на трех видах экспериментальных животных.

В начале первого этапа изучали способность препарата ХСО связывать ХС из пищевых продуктов в опытах in vitro, затем исследовали биологическую активность in vivo (острую и хроническую токсичность на мышах и крысах) и антиатеросклеротическое действие на кроликах. Всего было использовано следующее количество половозрелых экспериментальных животных (самцов): 100 мышей (18–20 г), 350 крыс (180–200 г), 30 кроликов (2,5–2,7 кг), 5 собак (15–18 кг). Эксперименты выполнены в соответствии с Правилами работы с лабораторными животными, которых содержались в условиях искусственного освещения в помещении со свободным доступом к воде и корму.

Во втором этапе серия опытов проведена на более взрослых самцах животных: 155 крысах (250–300 г), 20 морских свинках (360–380 г) и 18 кроликах (3,0–3,5 кг), которых содержались в тех же стандартных условиях вивария. Опытные образцы ферментного препарата ХСО вводили ежедневно, перорально, в дозах, рассчитанных в единицах активности (от 0,16 до 10 ЕД).

Экспериментальную, алиментарную ДЛП (гиперлипидемию) у крыс, морских свинок и кроликов вызывали в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению новых гиполипидемических и антиатеросклеротических средств» (2012). Для этого использовали атерогенный рацион — гиперхолестериновую (ГХС) диету. У крыс умеренно высокую гиперлипидемию вызывали применением специальной ГХС диеты, скармливая опытный рацион, обогащенный пищевым холестерином (ХС) в виде 5 % прогретой смеси с подсолнечным маслом и повреждающим тиреоидсупрессорным агентом — метилтиоурацилом (МТУ 0,12 %) в течение 20 дней. Гиперлипидемию у морских свинок создавали кормлением ГХС диетой, содержащей избыточное количество пищевого ХС (0,5 г/кг) и смесью жиров (подсолнечное масло / свиной жир 3 : 1) в течение 20 дней. Умеренно высокую гиперлипидемию у кроликов моделировали, используя пищевой ХС (0,5 г/кг), перемешанный вместе с небольшим количеством капусты, в течение 12–24 дней. Перед окончанием опытов всех подопытных животных отсаживали на голод в течение 18 ч. Крыс и морских свинок забивали быстрой декапитацией, кроликов — мгновенной воздушной эмболией. В полученной крови и печени определяли содержание общего ХС (ОХС), триглицеридов (ТГ), ХС липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) с помощью наборов реактивов Ranbaxy (Великобритания). По общепринятой формуле А.Н. Климова рассчитывали важный коэффициент — индекс атерогенности крови (ИА):

ОХС – ХС ЛПВП / ХС ЛПВП.

Кроме того, сыворотку крови крыс, морских свинок и кроликов исследовали, используя метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности калия бромида (KBr) для анализа распределения спектра липопротеинов: ЛП промежуточной плотности (ЛППП), ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП), ЛП низкой плотности (ЛПНП), ЛПВП. Статистическую обработку данных производили, сравнивая средние значения величин, с помощью однофакторного ANOVA теста при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение биологической активности препарата ХСО для коррекции экспериментального АС в опытах in vitro и in vivo коллектив авторов проводил в течение трех лет в четырех сериях исследований комплексно — в лаборатории экспериментальной фармакотерапии и отделе биохимии Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург).

Первый, начальный этап исследований выявил отчетливую специфическую активность тестируемого препарата — микробного ферментного препарата ХСО. Согласно протоколам опытов были получены следующие результаты.

В первой серии исследований в опытах in vitro было показано, что микробный препарат фермента ХСО в суммарной дозе 300–400 ЕД проявляет специфическую биологическую активность в уменьшении концентрации ХС в натуральных пищевых продуктах. Так, после добавления препарата ХСО с исходной концентрацией 0,16 ЕД/мл активности к 1 л цельного 6 % молока было обнаружено, что после инкубации в термостате при 37 оС в течение 3 ч наблюдалось снижение уровня общего ХС на 48 % (p < 0,05). После аналогичной инкубации пяти яичных желтков (с исходным содержанием ХС 15,64 мг/мл) концентрация ХС в них уменьшилась на 51 % (p < 0,05). Кроме того, при инкубации смешанных образцов в течение 3 ч при комнатной температуре концентрация в яичных желтках была в 1,5 раза ниже, чем в исходном продукте. Важно подчеркнуть, что при этом способе пищевые продукты не потеряли своих вкусовых и естественных качеств.

Во второй серии исследований в опытах in vivo у мышей и крыс определяли острую токсичность ХСО. Хроническую токсичность препарата изучали в длительных экспериментах (крысы — 3 месяца) и (собаки — 5 месяцев). Острую токсичность ХСО у мышей и крыс определить не удалось, так как даже большие дозы ХСО не оказывали патологического действия. Обнаружено, что пероральное введение препарата ХСО в опытах в дозах 300–400 ЕД животные переносили без осложнений. Кроме того, для выяснения влияния на жизненно важные системы и органы были проведены хронические опыты на крысах и собаках. Установлено, что ежедневное применение ХСО пероральной дозы с исходной активностью от 0,16 до 1,0–20,0 ЕД/мг не оказывает токсического действия на организмы крыс и собак при длительном применении (3 и 5 месяцев соответственно). Анализ деятельности желудочно-кишечного тракта, крови по форменным элементам и морфологии органов (сердце, печень, почки, надпочечники, селезенка) не выявил серьезных патологических изменений у опытных животных.

В третьей серии опытов моделирования на кроликах алиментарного АС (3 месяца) без использования ферментного препарата ХС было отмечено появление и развитие выраженных атеросклеротических повреждений в аортах опытных животных при ежедневном скармливании яичных желтков. В то же время в аортах группы кроликов, получавших в тех же условиях в качестве препарата сравнения гиполипидемический препарат клофибрат, наблюдались начальные диффузные поражения стенки аорты.

В четвертой серии опытов при изучении переносимости ХСО в эффективной дозе 20 ЕД у кроликов (3 месяца) и собак (5 месяцев) обнаружено, что ежедневное пероральное введение тестируемого препарата в разных дозах и яичных желтков не вызывало никаких поражений в аортах экспериментальных животных.

Таким образом, в опытах in vitro и in vivo была установлена низкая токсичность, биологическая активность и антиатеросклеротическое действие изучаемого микробного препарата ХСО.

На втором этапе исследований была поставлена задача — выяснить, в какой степени препарат ХСО может влиять на развитие умеренно высокой алиментарной ДЛП у крыс, морских свинок и кроликов. Использование в опытах трех видов экспериментальных животных (грызунов) обусловлено особенностями липидного спектра их крови, который различается следующим образом. У кроликов основное количество ХС распределено по фракциям атерогенных липопротеинов (ЛПОНП, ЛППП и ЛПНП) и антиатерогенных ЛПВП равномерно. У крыс основной пул ХС находится в антиатерогенных ЛПВП, а у морских свинок — в атерогенных фракциях ЛПОНП и ЛПНП. Следует отметить, что морские свинки более чувствительны к созданию моделируемой ДЛП, чем кролики и крысы. Моделирование алиментарной ДЛП (гиперлипидемии) у морских свинок осуществляли пероральным введением с помощью зонда прогретой смеси жиров и избытка пищевого ХС в течение 20 дней. Крысы менее чувствительны к воздействию скармливания атерогенного рациона, поэтому им необходимо длительно вводить ГХС диету не только со смесью жиров и избыточным количеством ХС, но и использовать в высоких дозах такие повреждающие агенты, как МТУ, холевая кислота, витамин D2 в течение 21–30 дней. Разработкой и внедрением алиментарных моделей ДЛП для экспериментальной работы занималась одна из авторов данной статьи — И.В. Окуневич [7].

 

Таблица 1. Влияние препарата холестериноксидазы на показатели липидного обмена в сыворотке крови и печени морских свинок при пероральном введении в течение 20 дней

Группа животных

ХС сыворотки

ТГ сыворотки

ХС печени

ТГ печени

1. Интактные морские свинки

1,19 ± 0,13

0,61 ± 0,14

2,5 ± 0,07

5,8 ± 0,4

2. ГХС диета

6,49 ± 0,72*

18,0 ± 0,36*

13,8 ± 0,09*

26,5 ± 3,2*

3. ГХС диета + ХСО

4,14 ± 0,54#

14,3 ± 0,27#

10,5 ± 0,08#

20,0 ± 1,7#

Примечание: * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2 при p < 0,05; # различия достоверны в сравнении групп 2 и 3, при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды, ГХС — гиперхолестериновая.

 

Таблица 2. Влияние препарата разных доз холестериноксидазы на показатели липидного обмена в сыворотке крови крыс при пероральном введении в течение 30 дней

Группа животных

ХС сыворотки

ТГ сыворотки

ХС ЛПВП

Индекс атерогенности

1. Интактные крысы

1,40 ± 0,03

0,78 ± 0,02

0,93 ± 0,07

0,50

2. ГХС диета

4,69 ± 0,13*

0,42 ± 0,05*

0,55 ± 0,06*

7,43

3. ГХС диета + ХСО 2 ЕД

4,01 ± 0,15*, #

0,56 ± 0,07*

0,64 ± 0,08*, #

5,26

4. ГХС диета + ХСО 4 ЕД

3,96 ± 0,17*, #

0,52 ± 0,04*

0,73 ± 0,06*, #

4,43

5. ГХС диета + ХСО 8 ЕД

3,78 ± 0,31*, #

0,50 ± 0,03*

0,81 ± 0,09*, #

3,66

6. ГХС диета + ХСО 10 ЕД

2,92 ± 0,18*, #

0,51 ± 0,08*

0,96 ± 0,08*, #

2,04

7. ГХС диета + ХСО 20 ЕД

2,79 ± 0,27*, #

0,49 ± 0,06*

0,97 ± 0,05*, #

1,74

Примечание: * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2 при p < 0,05; # различия достоверны в сравнении групп 2 (ГХС диета) и 3, 4, 5, 6, 7, при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды, ЛПВП — липопротеины высокой плотности, ГХС — гиперхолестериновая.

Таблица 3. Влияние препарата холестериноксидазы на показатели липидного обмена в сыворотке крови и печени крыс при пероральном введении в течение 13 дней (диета — 22 дня)

Группа животных

ХС сыворотки

ТГ сыворотки

ХС печени

ТГ печени

1. Интактные крысы

1,32 ± 0,08

0,73 ± 0,06

4,45 ± 0,38

7,53 ± 0,91

2. ГХС диета

3,17 ± 0,13*

0,42 ± 0,05*

21,15 ± 0,96*

23,4 ± 1,03*

3. ГХС диета + ХСО 2 ЕД

1,71 ± 0,05*, #

0,32 ± 0,07*

14,48 ± 1,03*, #

12,0 ± 1,13*, #

Примечание: * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2 при p < 0,05; # различия достоверны в сравнении групп 2 и 3 при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды, ГХС — гиперхолестериновая.

 

Таблица 4. Влияние препарата холестериноксидазы, вводимой перорально в течение 12 и 24 дней, на изменение уровня липидов сыворотки крови у кроликов с дислипопротеинемией

Группа животных

n

ХС сыворотки крови (ммоль/л)

ТГ сыворотки (ммоль/л)

Индекс атерогенности, ЕД

Начало опыта

Через 12 дней

Через 24 дня

Начало опыта

Через 12 дней

Через 24 дня

24 дня

1. Интактные морские свинки

5

1,1 ± 0,21

2,0 ± 0,44

1,4 ± 0,10

0,94 ± 0,10

0,90 ± 0,28

1,04 ± 0,08

1,0

2. ГХС диета

5

1,2 ± 0,16

29,7 ± 3,80*

45,0 ± 2,82*

0,62 ± 0,11*

1,67 ± 0,32*

2,45 ± 0,24*

149,0

3. ГХС диета + + ХСО

8

1,2 ± 0,05

24,5 ± 2,70*, #

11,7 ± 2,64*, #

0,91 ± 0,15*, #

0,42 ± 0,11*, #

0,97 ± 0,21*, #

12,0

Примечание: n — число животных в группе, * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2, *, # различия достоверны в сравнении с группами 2 и 3, при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды.

 

Полученные во втором этапе результаты опытов по изучению влияния ХСО на развитие умеренной алиментарной ДЛП представлены в табл. 1–4. Введение препарата ХСО морским свинкам способствовало снижению уровня липидов в сыворотке крови и в печени данных животных (см. табл. 1). Так, уровень ХС в крови снизился на 49 %, в печени — на 26 %, содержание в сыворотке крови уменьшилось на 21 %, в печени — на 25 %, что свидетельствовало о выраженном гиполипидемическом действии изучаемого препарата. При тестировании влияния разных доз ХСО на модели алиментарной ДЛП у крыс (см. табл. 2) обнаружено, что при увеличении дозирования препарата наблюдалось достоверное снижение общего ХС сыворотки крови (группы 3–7 в сравнении с группой 2). Отмечено также позитивное увеличение концентрации ХС антиатерогенных ЛП — ХС ЛПВП (сниженной в результате моделирования ДЛП). При этом при анализе степени атерогенности сыворотки крови обнаружено снижение величины расчетного коэффициента: ИА составляет от 5,26 до 1,74 (группа 2 и опытные группы 3–7). В следующем эксперименте на модели ДЛП у крыс на ГХС диете было показано гиполипидемическое действие ХСО у крыс, получавших тестируемый препарат ХСО: ХС в сыворотке крови снижался на 47 %, в печени — на 34 %. Из-за использования в атерогенном рационе тиреоид-супрессорного агента МТУ уровень ТГ сыворотки крови не увеличивался. Липидснижающий эффект ХСО — снижение ТГ под влиянием препарата — наблюдался только в печени (см. табл. 3, группы 3 и 2). В табл. 4 приведены результаты, полученные после перорального введения ХСО кроликам. Из данных видно, что через 12 дней и, в большей степени, через 24 дня кормления животных гиперхолестериновой диетой значительно увеличилось содержание ХС в сыворотке крови и величина ИА (более чем в 12 раз) по сравнению с нормальными животными (группы 3 и 2). Результаты опытов, проведенных на трех видах экспериментальных животных (грызунов), свидетельствуют об имеющемся у препарата ХСО гиполипидемическом действии в условиях моделирования алиментарной ДЛП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в двухэтапном экспериментальном исследовании установлены биологическая активность, гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действия ферментного препарата микробного происхождения холестериноксидазы. Полученные данные расширяют наше представление о фармакологическом действии фермента холестериноксидазы, что может иметь перспективу его внедрения в практику.

About the authors

Irina V. Okunevich

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: irina_okunevich@mail.ru

Russian Federation, St. Petersburg

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, S.V. Anichkov Department of Neuropharmacology

Natalia N. Klyueva

Institute of Experimental Medicine

Email: nnklyueva@gmail.com

Russian Federation, St. Petersburg

Candidate of Biological Sciences, Researcher of the Department of Biochemistry

Nina S. Parfenova

Institute of Experimental Medicine

Email: nina.parf@mail.ru

Russian Federation, St. Petersburg

Candidate of Medical Sciences, Senior Researcher of the Department of Biochemistry

Elena V. Belova

Institute of Experimental Medicine

Email: irina_okunevich@mail.ru

Russian Federation, St. Petersburg

Candidate of Biological Sciences, Researcher of the Department of Biochemistry

References

  1. Безбородов А.М., Загустина Н.А. Ферментативные реакции в химикоэнзиматическом синтезе лекарственных препаратов // Прикладная биохимия и микробиология. – 2016. – Т. 52. – № 3. – С. 257–271. [Bezborodov AM, Zagustina NA. Fermentativnye reaktsii v khimikoenzimaticheskom sinteze lekarstvennykh preparatov. Prikladnaja biohimija i mikrobiologija. 2016;52(3):257-271. (In Russ.)]. https://doi.org/10. 7868/S055510991603003X.
  2. Bogdanov M. Mapping of membrane protein topology by substituted cystein accessibility method (SCAM™). Methods Mol Biol. 2017;1615:105-128. https://doi.org/10. 1007/978-1-4939-7033-9_9.
  3. Catapano AL, Lautsch D, Tokgözoglu L, et al. Prevalence of potential familial hypercholesteremia (FH) in 54,811 statin-treated patients in clinical practice. Atherosclerosis. 2016;252:1-8. https://doi.org/10. 1016/j.atherosclerosis.2016. 07. 007.
  4. Gadbery JE, Sampson NS. Use of an Isotope-Coded Mass Tag (ICMT) method to determine the orientation of cholesterol oxidase on model membrances. Biochemistry. 2018;57(36):5370-5378. https://doi.org/10. 1021/acs.biochem. 8b00788.
  5. Khatib R, Mckee M, Shannon H, et al. Availalibity and affordability of cardiovascular disease medicines and their effect on use in high-income, middle-income and low-income countries: an analysis of PURE study data. Lancet. 2016;387(10013):61-9. https://doi.org/10. 1016/s0140-6736(15)00469-9.
  6. Kreit I, Sampson NS. Cholesterol oxidase: biochemistry and structure features: Review. FEBS J. 2009;276(23):6844-56. https://doi.org/10. 1111/j.1742-4658. 2009. 07378. x
  7. Okunevich IV, Knychenko LK, Sapronov NS. Pharmacological activity of sulfobisanion in models of experimental dyslipoproteinemia Pharm Chem J. 2013;47(7):374-377. https://doi.org/10. 1007/s11094-013-0962-x.
  8. Vrilink A, Ghisla S. Cholesterol oxidase: biochemistry and features. FEBS J. 2009;276(23):6826-6843. https://doi.org/10. 1111/j. 1742-4658. 2009. 07377. x.

Statistics

Views

Abstract - 151

PDF (Russian) - 79

Cited-By


PlumX

Dimensions


Copyright (c) 2019 Okunevich I.V., Klyueva N.N., Parfenova N.S., Belova E.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies